Name: 방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다 초파리 애벌레 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 배우세요 초파리 애벌레의 림프선 분리 및 면역조직화학 기법을 활용한 조혈계 분석 방법입니다. 유전적·환경적 변화가 조혈 과정에 미치는 특정 효과를 규명할 수 있습니다.

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도움을 주신 Matthew O'Connell, Maryam Jahanshahi, Andreas Jenny에게 감사드립니다. 원형질세포 특이적 항체를 제공해 주신 István Andó님, dome-meso-EBFP2 파리를 주신 Utpal Banerjee님, antp>GFP 파리를 주신 Julian Martinez-Agosto님, ptth 및 ptth>grim 파리를 주신 Michael O'Connor님께 감사드립니다. 이러한 방법은 Kimmel Foundation, Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059 및 NIH/NCI T32CA078207의 지원으로 개발되었습니다.

1. 순환 혈구 농도 <ol><li> 6 시간 -이 분석을 위해 거의 동일한 발달 단계의 유충을 얻으려면, 여성이 2의 고정 된 시간 동안 알을 낳기 수 있도록하여 달걀 수집을 제한 할 수 있습니다. </li><li> 1 배 인산염 완충 생리 식염수 (PBS, 표 1) 가득 접시의 우물을 해부에 애벌레를 수집합니다. </li><li> 각각의 애벌레를 들어, 얼음에 microcentrifuge 관에 PBS 1X 10 μl의 깨끗한 해부 패드에 PBS 1X 10 μl를 배치합니다. 조명 실체베이스에 해부 패드를 놓습니다. </li><li> 조직에 배치하여 각각의 유충을 건조는 해부 패드에 PBS 드롭에 전송하기 전에 닦아주십시오. </li><li> 포셉 한 쌍을 사용하여 부드럽게 열고 눈물 조심스럽게 체액을 해제 할 수있는 표피를 반전. 참고 : 긁어 또는이 잠재적으로 정착 혈구 세포 (29)를 방출 수로 표피를 잽주의 바랍니다. </li><li> 피펫을 사용하여 해부 패드로부터의 체액을 수집한다. 공동 피이러한 지방 본문으로 애벌레 파편을 llecting. </li><li> 미세 원심 튜브에 체액을 추가로 pipetting 아래로 섞는다. 주의 : 샘플을 여러 번에 수집 시간까지 얼음 상에 유지 될 수있다. </li><li> 옵션 : 염색과 죽은 세포를 제외 균등의 체액 샘플과 트리 판 블루를 섞는다. 이 세포에 독성이 있기 때문에 트리 판 블루를 추가의 3 분 이내에 세포를 계산합니다. </li><li> 최대 피펫 팅에 의해 아래로 혈구 실에 10 μl를로드하기 전에 샘플을 섞는다. </li><li> 자동 세포 계수기를 사용하는 경우, 셀 크기 및 원형에 대한 적절한 매개 변수를 설정합니다. 통상 둥근 혈구 세포 (34)를 검출하기 위해 80 %의 원형 - 예를 들어, 2 μm의 최소 셀 크기 22 ㎛의 최대 셀 크기 및 (75)의 원형도를 설정한다. 다른 매개 변수를 실험은 lamellocytes으로 더 큰 스핀들 모양의 혈구 세포를 감지합니다. 또한, 수동 혈구 세포를 계산하는 혈구를 사용합니다. </li></ol> 2. CIRculating 혈구 면역 조직 화학 <ol><li> 6 시간 -이 분석을 위해 거의 동일한 발달 단계의 유충을 얻으려면, 여성이 2의 고정 된 시간 동안 알을 낳기 수 있도록하여 달걀 수집을 제한 할 수 있습니다. </li><li> 6- 또는 12 웰 플레이트의 각 웰에 하나의 coverslip를 놓습니다. 참고 : 광장 된 커버 (22mm) 6 웰 플레이트 라운드 커버 슬립 (18mm 직경)에 맞는 12 웰 플레이트에 적합. </li><li> 1X PBS 가득 접시의 우물을 해부에 애벌레를 수집합니다. </li><li> 각 커버 슬립의 중심에 5 μL 1X PBS를 놓습니다. </li><li> 조명 실체베이스에있는 플레이트에 놓습니다. </li><li> 닦아 조직의 개별 애벌레를 건조 후 커버 슬립에 PBS에 배치합니다. </li><li> 포셉 한 쌍을 사용하여 부드럽게 찢어 조심스럽게 표피를 반전. 애벌레 시체를 제거하기 전에 균일하게 체액을 전파하는 데 사용합니다. 참고 : 긁어 또는이 잠재적으로 정착 혈구 세포 (29)를 방출 수로 표피를 잽주의 바랍니다. </li><li> Repea커버 슬립 당 하나의 유충의 체액을 수집, 모든 애벌레에 대한 마에. 혈구 세포 5에 대한 커버 슬립을 준수 할 수 있도록 허용 -. 실내 온도 실온에서 8 분 고정하기 전에 30 분을 초과하지 마십시오. </li><li> 실온에서 15 분 동안 각 커버 슬립을 7.5 % 포름 알데히드 (표 1) 5 μl를 첨가하여 혈구 세포를 고정한다. </li><li> 워시는 1X PBS로 3 회 된 커버. 판 팁 각 세척 후 PBS를 대기음. 다음 단계에서 permeabilization 솔루션의 실행 - 오프를 방지하기 위해, 커버 슬립의 경계에서 초과 PBS를 제거하는 흡입기를 사용합니다. </li><li> 실온에서 20 분 동안 각 coverslip에 100 ㎕의 permeabilization 솔루션 (표 1)를 추가합니다. </li><li> 팁 부드럽게 permeabilization 솔루션을 대기음 할 수있는 판을 누릅니다. </li><li> 공급자의 사양에 따라 항체 용액 (표 1)과 차 항체를 희석. 12 웰 플레이트에서 적어도 500 μL를 커버 슬립 1 차 항체 솔루션을 추가합니다.6 웰 플레이트에서 적어도 1.5 ML을 추가합니다. 밤새 4 ° C에서 품어. </li><li> 차 항체 용액을 제거하고 궤도 흔드는, 세 번에 10 분 동안 1X PBS로 된 커버를 세척한다. </li><li> 공급자의 사양에 따라 항체 솔루션 차 항체를 희석. 12 웰 플레이트에서 커버 슬립 적어도 500 μL 차 항체 솔루션을 추가합니다. 6 웰 플레이트 적어도 1.5 ML을 추가합니다. RT에서 적어도 2 시간 동안 인큐베이션. </li><li> 이차 항체 용액을 제거하고 단계 2.10, 세 번 같이 궤도 통에 10 분 동안 1X PBS로 된 커버를 세척한다. </li><li> 세척 단계 동안 깨끗한 유리 현미경 조직 제거제를 사용하여 70 % 에탄올 (표 1)과 함께 슬라이드. 각 커버 슬립 들어 유리 슬라이드 5 μL 장착 완충액 (표 1)을 배치했다. 참고 : 두 개의 커버 슬립 한 슬라이드에 맞게. </li><li> 최종 PBS 세척을 대기음. </li><li> 조심스럽게 접시와 장소, INV에서 커버 슬립을 제거하기 위해 집게를 사용하여장착 버퍼의 상단에, erted. 참고 : 현미경 슬라이드 이전 영상에 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 최대 축적 시간은 사용되는 항체의 안정성에 의존한다. 6- 12- 웰 플레이트를 세정하여 재사용 할 수있다. </li></ol> 생체 크리스탈 셀 Melanization 3. <ol><li> 이 분석에 대해 거의 동일한 발달 단계의 유충을 얻으려면, 여성 2-6 시간 고정 된 시간 동안 알을 낳기 수 있도록하여 달걀 수집을 제한 할 수 있습니다. </li><li> 시작하기 전에 60 ℃에서 가열 원을 설정한다. 주 : (25 ℃로 유지 하였다)를 10 분 동안 60 ° C의 열 순환기 프로그램은 잘 작동하지만, 상기 열은 각각 충 걸쳐 일관되고 균일하게 분포 될 때 수조 또는 다른 열원 긴로 충분하다. </li><li> 1X PBS (표 1) 가득 접시의 우물을 해부에 애벌레를 수집합니다. </li><li> 한번에 하나는 조직에 유충이 PCR 튜브의 하단에 위치 닦아 건조. 각각의 유충을 배치별도의 PCR 튜브한다. (그림 3A를 참조하십시오.) </li><li> 15 분 및 / 또는 부드럽게 전에 가열로 튜브를 눌러 - 일관성있는 결과를 들어, 10 4 ° C에서 튜브에서 애벌레를 차게하여 PCR 튜브의 바닥에 그 애벌레 숙박을 보장합니다. </li><li> 열 자전거 타는 사람 (또는 물 목욕)에서 PCR 튜브를 놓습니다. 10 분 동안 60 ℃에서 가열한다. </li><li> 조심스럽게 신선한 1X PBS 가득 접시의 우물을 해부으로 PCR 튜브에서 애벌레를 제거합니다. </li><li> 조직에 드라이 유충 닦아 실체 현미경에서 이미징을위한 평평한 표면에 배열합니다. </li><li> 맹목적으로 여러 개인 애벌레의 이미지를 점수. </li></ol> 4. 애벌레 림프 글 랜드 면역 조직 화학 참고 : 임파선이 약간 지느러미 측의 두뇌 아래의 유충의 앞쪽 끝에서 약 3 분의 1 길이에 위치해 있습니다. (그림 3B에서 화살표를 참조하십시오.) 림프 글 랜드는 등의 용기를 옆구리 가장 쉽게 입 ~이 부착 해부한다KS 또는 뇌. 야생 형, 세 번째 령 임파선이 매우 작은 구조이다; 길이 200 μm의 - 주 로브는 약 100입니다. (그림 4A를 참조하십시오.) <ol><li> 6 시간 -이 분석을 위해 거의 동일한 발달 단계의 유충을 얻으려면, 여성이 2의 고정 된 시간 동안 알을 낳기 수 있도록하여 달걀 수집을 제한 할 수 있습니다. </li><li> 림프의 글 랜드 해부 <ol><li> 각 실험 조건의 경우, 24 웰 플레이트의 한 웰에 PBS 1 배 1 ㎖ (표 1)를 추가합니다. </li><li> 각 웰 일회용 전달 피펫을 사용하여 0.1 % PBST (표 1) 1 방울을 추가한다. 주 : 세제, 예컨대 트윈 (Tween) 20, 조직은 웰의 바닥에 가라 앉을 수 있도록 표면 장력을 낮추기 위해 추가된다. </li><li> 얼음에 플랫 플레이트를 놓습니다. </li><li> 1X PBS 가득 접시의 우물을 해부에 애벌레를 수집합니다. </li><li> 조명 실체베이스에 깨끗한 해부 패드를 놓습니다. 에 작은 배치 일회용 전송 피펫을 사용하여난 패드에 0.01 %의 PBST (표 1)을 삭제합니다. 해부에 대한 PBST 드롭 한 유충을 전송합니다. </li><li> 후방 끝에서 하나의 약 포셉 한 쌍의 1/4 길이, 지느러미 쪽이 위로 유충을 잡아. </li><li> 표피 즉시 유충을 잡고있는 집게에 전방 잡아 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. 입 후크가 노출 될 때까지 조심스럽게 앞쪽 끝으로 표피를 잡아 당깁니다. 참고 : 목표는 내부 구조를 방해하지 않고 표피를 벗겨하는 것입니다. </li><li> 표피를 놓고 두 유충을 잘라 두 집게를 사용합니다. PBST 드롭의 후방 끝을 제거합니다. 참고 : 표피 입 후크에 모든 방법을 벗겨하지 않는 경우, 두 유충을 절감하고 후방 끝을 제거합니다. 표피의 가장자리를 개최하고, 개방을 통해 입 후크를 밀어 포셉의 다른 쌍을 사용하는 집게 한 쌍을 사용합니다. 이것은 표피를 반전 입 후크를 노출합니다. 이은 altern로서 사용될 수있다뿐만 아니라 절개 방법을 먹었다. </li><li> 안정성을 위해 표피 (중 복부 표피, 지느러미 표피 플랩, 또는 둘 다) 아래로 핀 집게 한 쌍을 사용합니다. </li><li> 노출 된 입 후크를 잡아 조심스럽게 그들을 밖으로 끌어 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. 참고 :이 내부 구조에서 표피를 분리합니다. 이상적으로는, 눈 / 더듬이 가상적인 디스크, 뇌, 링 글 랜드 및 지느러미 선박 측면 림프 글 랜드는 입 후크에 부착 된 상태로 유지됩니다. </li><li> 여전히 입 후크를 누른 상태에서 조심스럽게 예를 들면 침샘, 지방 본문 및 소장으로 원치 않는 구조를 제거합니다. 참고 : 뇌가 입 고리에서 분리하는 경우, 림프 글 랜드는 여전히에 부착 뇌에 수집 될 수 있습니다. 이 경우, 복부 신경 코드 대신 입 후크를 개최합니다. </li><li> 핸들과 입 후크 또는 복부 신경 코드를 사용하면. 얼음에 잘에 림프 글 랜드를 포함하는 해부 복잡한 전송 30 분을 초과하지 마십시오고정하기 전에. </li></ol></li><li> 고정 및 면역 조직 화학 <ol><li> 실체베이스의 24 웰 플레이트를 놓습니다. </li><li> 신중하게 잘에서 PBST를 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다. 참고 : 빈, 이웃 우물 일시적으로 폐기물을 입금 유용하다. </li><li> 부드럽게 잘 측면 아래로 200 ㎕를 3.7 % 포름 알데히드 (표 1)를 추가하고 해부 조직이 완전히 침수되는 것을 보장하기 위해 접시를 소용돌이 친다. </li><li> 30 분 동안 얼음 접시를 돌려줍니다. 림프 분비가 형광 단백질 (들)을 표현하는 경우, 광표백을 방지하기 위해 커버 플레이트를 유지합니다. </li><li> 주의 깊게 정착을 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다. </li><li> 웰을 200 ㎕의 1X PBS를 첨가하여 실온에서 5 분 동안 진탕 기에서 플레이트를 배치하여 세척 하였다. 조심스럽게 PBS를 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다. 참고 : 모든 실험 조건이 거라고 있습니다에 대한 고정 임파선은 임파선까지 PBS에서 얼음에 남아있을 수 있습니다issected 고정. </li><li> 세척이 두 번 더 단계를 반복합니다. </li><li> 잘 200 μl의 permeabilization 솔루션 (표 1)를 추가합니다. 실온에서 45 분 동안 궤도 통에 접시를 설정합니다. 참고 : 45 분 림프 글 랜드 permeabilization의 &quot;황금 표준&quot;하지만 저자는 20 분 후 성공을. </li><li> P200 피펫으로 솔루션을 제거합니다. </li><li> 공급자의 사양에 따라 항체 용액 (표 1)과 차 항체를 희석. 잘 300 μL 차 항체 솔루션을 추가하고 해부 조직이 완전히 침수되어 있는지 확인합니다. 밤새 4 ° C에서 품어. </li><li> 차 항체를 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다. </li><li> 웰을 200 ㎕의 1X PBS를 첨가하여 실온에서 10 분 동안 진탕 기에서 플레이트를 배치하여 세척 하였다. 조심스럽게 PBS를 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다. </li><li> 세척이 두 번 더 단계를 반복합니다. </li><li> 보조 희석공급자의 사양에 따라 항체 용액으로 ntibody. 잘 300 μL 차 항체 솔루션을 추가하고 해부 조직이 완전히 침수되어 있는지 확인합니다. RT에서 적어도 2 시간 동안 오비탈 진탕 기에서 인큐베이션. </li><li> 이차 항체를 제거하고 단계 4.3.12 및 4.3.13에 기술 된 바와 같이 씻어 P200 피펫을 사용합니다. 최종 세척 후 PBS를 제거하지 마십시오. </li></ol></li><li> 글 랜드 장착을 림프 <ol><li> 청소 유리 현미경은 70 % 에탄올 (표 1)과 조직 와이프를 사용하여 슬라이드. </li><li> 각 실험 조건에 대한 유리 슬라이드에 완충액 (표 1)를 장착 한 방울을 놓는다. 참고 : 두 조건은 하나의 슬라이드에 맞게. 버퍼 볼륨을 장착하면 임파선의 수를 장착 할 수에 따라 달라집니다. 20 임파선, 10 일 μL - - 12, 5 이하 0.5 ㎕의 약 18에 대한 2 μl를 사용합니다. </li><li> 조명 실체베이스의 현미경 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 한 번에 최대 두 가지 조건의 경우, 핸들로 입 후크 또는 복부 신경 코드를 사용하여 집게로 장착 버퍼에 우물에서 임파선을 모두 전송합니다. </li><li> 공간 처리에서 장착 버퍼 확산 원형 또는 직사각형 균일 해부 조직. </li><li> 해부 조직의 각각에 대해 개별적으로, 지느러미 용기 아래 포셉 한 통을 밀어 부드럽게 장착 버퍼의 주변쪽으로 당깁니다. 참고 :이 림프가 해부 조직의 나머지에서 밖으로 글 랜드와 유리에 림프 글 랜드를 평평하게 그릴 것입니다. </li><li> 하나 포셉의 통과 톱질 동작을 사용하여, 임파선과 뇌 사이의 지느러미 용기를 잘라. </li><li> 버퍼의 가장 바깥 쪽 가장자리에서 상기 임파선의 반대측에 해부 조직의 나머지를 이동. 참고 : 원치 않는 해부 조직은 결국 임파선 주위에 경계를 형성 whic에 따라 지원 될 것입니다커버 슬립이 휴식 할 시간. </li><li> 림프 분비 모두가 중앙에 배치 할 원치 않는 해부 조직 중 하나 예약, 해부 조직에서 분리 될 때까지 반복합니다. </li><li> 두 손가락 사이에 커버 슬립을 가져 가라. 커버 슬립이 먼지와 지문이 없는지 확인합니다. 필요한 경우, 조직 닦아 사용하고 70 % 에탄올은 커버 슬립을 청소. </li><li> 커버 슬립의 쪽이 유리 슬라이드의 가장자리에 평행 한 것을 보장 신중 장착 버퍼 위에 커버 슬립을 낮출. 참고 : 현미경 슬라이드 이전 영상에 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 최대 축적 시간은 사용되는 항체의 안정성에 의존한다. 24 웰 플레이트를 세정하여 재사용 할 수있다. </li></ol></li></ol> 5. 이미지 <ol><li> 이미지 혈구 세포를 고정 제조 업체의 운영 매뉴얼에 따라 20 배 이상 확대에 적절한 표준 형광 또는 공 초점 현미경에 임파선을 탑재. 스탠드에 이미지 전체 애벌레제조업체의 작동 설명서에 따라 2 배의 배율에서 ARD 실체. </li><li> 원하는 경우, 디컨 볼 루션 소프트웨어 제공 업체의 지침을 따르십시오. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 해결책 </td><td> 구성 </td><td> 저장 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td rowspan="5"> 1X PBS </td><td> 200 ㎎ / ℓ 염화칼륨 </td><td rowspan="5"> 실온 </td><td rowspan="5"></td></tr><tr><td> 200 ㎎ / ℓ 인산 칼륨 일 염기성 </td></tr><tr><td> 8,000 ㎎ / ℓ 염화나트륨 </td></tr><tr><td> 1,150 ㎎ / ℓ 인산 나트륨 </td></tr><tr><td> DH 2 O </td></tr><tr><td> 정착액 </td><td> 3.7 % 또는 7.5 %의 포름 알데히드 1X PBS에서 </td><td> 어둠 속에서 실온 </td><td> 포름 알데히드는 독성이있다. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Permeabilization 솔루션 / 항체 희석제</td><td> 0.4 % 트리톤 </td><td rowspan="3"> 4 ° C </td><td rowspan="3"> 표준 공식은 0.4 % 트리톤를 사용하지만 저자는 성공 트윈 20 0.1 %를 사용합니다. 공급 업체의 권장 농도에 따라 기본 및 보조 항체를 희석하여 사용합니다. </td></tr><tr><td> 5 % 소 혈청 알부민, 정상 염소 혈청 또는 정상 당나귀 혈청 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td></tr><tr><td> 70 % 에탄올 </td><td> dH2O 중에서 70 ~ 200 % 증거 에탄올 </td><td> 실온 </td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"> 설치 버퍼 </td><td> 0.5 % n- 프로필 갈 레이트 </td><td rowspan="4"> 어둠 속에서 4 ° C </td><td rowspan="4"> n- 프로필 갈 레이트는 유해하다. DAPI는 돌연변이입니다. </td></tr><tr><td> 80 % 글리세롤 </td></tr><tr><td> 옵션 : 1 μg의 / ㎖의 DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌) </td></tr><tr><td> 1X PBS </td></tr><tr><td> 0.1 % PBST </td><td> 1X PBS에서 0.1 % 트윈 20 </td><td> 실온 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 0.01 %의 PBST </td><td> 0.1 % PBST 1:10 희석 </td><td> 실온 </td><td></td></tr></tbody></table> 이 의정서에 사용되는 표 1. 솔루션.

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

유전 적 또는 환경 변화에 따라, 여기에 설명 된 네 가지 방법은 신호, 생존, 증식 및 분화와 같은 조혈 동안 별개 프로세스를 분석하기 위해 개별적으로 또는 함께 사용할 수 초파리 조혈 동적 프로세스이다.; 동물 당 혈구 세포의 수가 증가하고 35 임파선의 구조 및 유전자 발현이 발달 동안에 32를 변경한다. 이러한 분석을 수행하기 이전에, 따라서, 고정 된 시간에 대한 산란 원하는 유충 발달 단계를 확인 암컷시킴으로써 달걀 모음을 제한하는 것이 중요하다. 짧은 계란 컬렉션 (이하 6 시간) 또는 여성이 건강에 해로운 또는 부족한되는 인스턴스를 들어, 달걀 누워는 음식에 균열을 생성하여 격려 할 수있다. 이는 에탄올 세정 주걱 음식의 부분을 제거함으로써 달성 될 수있다. 를 초과하는 액체 식품에 축적 경우, 사용 조직을 흡수하기 위해 잎사귀액체. (그림 1A를 참조하십시오.) 혼자, 여기에...

혈액 학적 질환의 조혈 시스템의 개발 및 그 고장 좌표 전사 인자 및 신호 전달 경로를 조절 복잡한 메커니즘이 제대로 이해 남아. 이러한 전사 인자 및 신호 경로뿐만 아니라, 그 조절은 매우 초파리 및 포유류 조혈 1-5 사이에 보존된다. 따라서 초파리 조혈 시스템은 조혈 및 기저 혈액 질환을 제어하는 분자 메커니즘을 정의하는 우수한 유전 모델을 나타낸다. 포유 동물과 유사하게, 초파리는 조혈의 공간적 및 시간적으로 별개의 단계에서 혈구 불리는 혈액 세포를 생성. 전통적으로, 초파리의 조혈는 배아 중배엽과 애벌레 림프 글 랜드에서 단계로 제한 될 것으로 생각되었다. 조혈 또한 애벌레 정착 클러에서 발생하는 최근의 연구는 증거를 제공sters과 6-8 복부 성인이다. plasmatocytes 및 액정 셀 모든 조혈 상 성숙 혈구 세포의 두 가지 유형을 생성한다. Plasmatocytes은 식균 작용, 선천성 면역, 및 상처 치유에 관여하는 대 식세포와 같은 세포이다. 크리스탈 세포는 melanization, 곤충 면역 반응 및 상처 치유에 사용되는 반응에 필요한 프로 phenoloxidases가 포함되어 있습니다. 제 성숙한 혈구 유형을 생성 할 수 있습니다 애벌레 조혈는 같은 포식 기생자 말벌 감염 9,10와 같은 특정 면역 도전에 대응하는 lamellocyte을했다. Lamellocytes는 캡슐화와 초파리 유충에 누워 말벌 알을 중화, plasmatocytes 및 결정 세포와 함께, 작동 큰, 부착 세포이다. 기생가 없을 lamellocytes는 야생형 유충에서 발견되지 않는다. Melanotic 대중 흑화, 캡슐 말벌 달걀을 닮은; 많은 초파리 돌연변이 균주 기생의 부재 melanotic 질량을 개발한다. lamello의 존재cytes 및 / 또는 melanotic 대중은 조혈 이상을 표시 할 수 있습니다. 사실, melanotic 질량 표현형 조혈 11-14에 관여하는 유전자 및 경로를 식별하는데 사용되었다. 애벌레 조혈 시스템은 가장 광범위하게 최신 연구이다. 그것은 체액의 순환 혈구 세포로 구성되어, 고착 혈구의 표피 아래 패턴 클러스터 및 혈구 세포는 림프 글 랜드에 거주. 림프 글 랜드는 등의 용기에 부착 된 양자 로브 시리즈입니다. 림프 글 랜드의 각 주 로브는 세 가지 주요 영역으로 구분된다. 가장 바깥 쪽 영역은 대뇌 피질의 영역으로 알려져 있으며, 혈구 세포를 성숙 포함되어 있습니다. 가장 안쪽 영역은 골수 영역이라고하며 대기 혈구 전구 물질로 구성된다. 제 3 구역, 후방 센터 시그널링은 줄기 세포와 같은 틈새로 작용 임파선 기지에서 세포의 작은 그룹이다. 초기 작품은 노치 15-18위한 중요한 기능을 설립 </suP&gt;, 고슴도치 19, 20, JAK-STAT (18), 및 날개없는 21 활동은 애벌레 림프 글 랜드 개발을 조절합니다. 최근의 연구는 BMP (22), FGF-라스 (23), 그리고 마 24, 25 신호는 애벌레 림프 글 랜드 내에서 작동하는지 증명하고있다. 여기에 설명 된 네 유생 조혈 분석 1) 단위 부피 당 세포 수를 의미 순환 혈구 농도를 측정, 2) 분리 및 정착 3) 생체 내에서 액정 셀을 시각화 면역 대한 혈구 세포를 순환하고, 4), 고정 해부 및 장착 설명 림프는 면역 조직 화학에 대한 글 랜드. 이러한 분석은 함수 및 애벌레 조혈 시스템에서 신호 전달 경로의 규제를 평가하는 조혈 판독로서 사용될 수있다. 이러한 방법은 필드에서 이전에 사용되었지만, 이러한 분석법 시각 문서 최근 8,26-30 시작했다. 여기에 인용 된 여러 출판물에 도움된다유사한 방법 및 조혈 마커 26,31-33을 설명 FUL 자원. 또한, 트롤과 바이킹은 림프 글 랜드 기저막의 유용한 지표이다.

<table><tbody><tr><td>PBS 정제</td><td>MP Biomedicals</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>해부 접시</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 해부 패드, Sylgard 184 키트</td><td>Krayden으로 제작(Fisher를 통해 배포)</td><td>NC9644388(Fisher 카탈로그 번호)</td><td>제조사 지침에 따라 Sylgard 엘라스토머 키트의 구성 요소를 혼합하여 페트리 접시에서 만들어졌습니다.</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Morrell Instruments (Nikon 대리점)</td> <td>mna42000, mma36300</td><td>Nikon 모델 SMZ1000 및 SMZ645</td></tr><tr><td>티슈 와이프</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>겸자</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72700-DZ</td><td></td></tr><tr><td>p200 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>백작 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Hausser Scientific</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 스테인</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Rocky Mountain Biologicals</td><td>BSA-BSH-01K</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>시그마</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>일반 당나귀 혈청</td><td>시그마</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>200 프루프 에탄올</td><td>VWR</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>N-프로필 갈레이트</td><td>MP Biomedicals</td><td>102747</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>VWR</td><td>EM-4750</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌)</td><td>Fisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리, 22mm 정사각형</td><td>Fisher</td><td>12-544-10</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리, 18mm 원형</td><td>Fisher</td><td>12-545-100</td><td></td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>22-034-980</td><td></td></tr><tr><td>열 순환기</td>, <td>Eppendorf</td><td>E950010037</td><td>Mastercycler EP Gradient S</td></tr><tr><td>PCR 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>일회용 이송 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Axio Imager.Z1</td></tr></tbody></table>

방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

많은 유사점. 초파리 포유류 적응 면역 특성화 림프 혈통 부족에도 초파리 및 포유류 조혈 시스템 간에는 초파리 및 포유류 조혈 여러 혈액 세포 계통을 생성 시공간적 가지 단계에서 발생한다. 두 시스템 확장하거나 성숙한 계통을 대체 할 수있는 혈액 세포 전구 세포의 저수지를 유지한다. 조혈 시스템은 초파리와 포유류에 대응하는 면역 도전에 적응 할 수 있습니다. 중요한 것은, 생성, 유지 보수 및 조혈 시스템의 기능을 조절하는 전사 규제 및 신호 전달 경로는 포유류에 파리에서 보존된다. 이러한 유사성은 초파리 유전자 모델 개발 및 조혈 질환에 사용될 수 있도록. 여기에 우리 세부 분석은 초파리 애벌레의 조혈 시스템을 검사합니다. 에서특히, 우리는 혈액 세포 수와 농도를 측정하는 생체 내에서 특정 성숙한 혈통 시각화 및 순환과 조혈 기관의 혈액 세포에서 면역 조직 화학 법을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 분석은 유전자 발현의 변화 및 신호, 생존, 증식 및 분화를 포함하는 세포 과정을 공개하고 조혈에 대한 질문의 다양성을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 초파리 가능한 유전 도구와 결합 된 분석 방법은 정의 된 유전자 변형시의 조혈 시스템을 평가할 수있다. 특히 여기에 설명되지는 않았지만, 이러한 분석법은 조혈 시스템의 감염이나식이 요법 등의 환경 변화의 영향을 조사하는데 사용될 수있다.

혈구 농도 순환 혈구 수는 애벌레 개발 (35)에 걸쳐 증가한다. 이 방법은 혈구 수와 농도의 차이를 감지하는지 설명하기 위해, 상관없이 생물학적 원인, 우리는 지연 및 비 지연 유충의 혈구 농도를 측정 하였다. ptth 생산 뉴런 (ptth&gt; 냉혹)의 유전 적 절제에 의해 prothoracicotropic 호르몬 (ptth)의 손실 애벌레 개발 (36)의 지연을 생산하고 있습니다. 25 ℃로 올려 8 이상의 개별 유충의 프로토콜 1에 기재된대로 각 유전자형 들어 혈구 농도를 측정 하였다. 2 시간 달걀 수집 후 120 시간에서 지연 유충 당 평균 혈구 농도는 (ptth&gt; 냉혹 한)는 제어 유충 (ptth) 당 평균 혈구 농도보다 작다. 만 구일 후 그 컨트롤의 지연 유충의 접근 당 평균 혈구 농도를 (수행 <st룽...

초파리와 포유류의 조혈 시스템은 조혈을 연구하기 위해 초파리에게 매력적인 유전 적 모델을 만들고, 많은 일반적인 기능을 공유 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 면역 조직 화학의 주요 애벌레 조혈 기관의 해부 및 장착을 보여줍니다. 우리는 또한 순환 혈구 세포와 고착 결정 세포 등 다양한 애벌레 조혈 구획을 분석하는 방법을 설명합니다.

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

이 절차들의 전반적인 목표는 림프샘의 해부 및 면역조직화학 염색을 위한 마운팅에 중점을 두어 초파리 조혈계의 다양한 구성 성분을 분석하는 것입니다. 이러한 방법들은 유전적 또는 환경적 변화가 생존, 증식, 분화 및 조혈 계통의 세포 신호 전달과 같은 과정에 미치는 영향을 포함하여, 초파리 조혈 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이러한 기법들의 주요 장점은 함께 사용할 때 조혈 과정 중 복잡한 프로세스에 변형이 미치는 특정 영향을 구분하는 데 도움이 될 수 있다는 점입니다. 마이크로원심분리 튜브에 1x PBS 10 µL를 넣고 튜브를 얼음에 배치하여 혈림프 수집을 시작하십시오. 다음으로 깨끗한 해부 패드 위에 1x PBS를 10 µL 떨어뜨리십시오.개별 유충을 선택하여 티슈 와이프 위에 올려 건조시킨 후, 해부 패드 위의 PBS 방울로 옮깁니다. 핀셋을 사용하여 큐티클을 조심스럽게 찢어 뒤집어 혈림프를 방출시킨 다음, 사체는 폐기합니다. 피펫을 사용하여 해부 패드에서 혈림프를 수집합니다.냉각된 PBS가 들어있는 마이크로원심분리 튜브에 혈림프를 넣고 피펫팅하여 혼합합니다. 시료 10 µL를 혈구계 챔버에 로딩하고 농도를 측정합니다. 혈림프 면역화학 분석을 수행하려면, 먼저 12-웰 플레이트의 웰에 놓인 18 mm 원형 커버슬립 중앙에 1x PBS 5 µL를 넣습니다.티슈로 유충의 물기를 닦아낸 후, 커버슬립 위의 PBS에 넣습니다. 핀셋을 사용하여 큐티클을 조심스럽게 찢어 뒤집은 다음 사체는 제거합니다. 원하는 수의 유충을 사용하여 개별 커버슬립에서 해부 과정을 반복하고, 혈구(hemocytes)가 상온에서 5~8분 동안 커버슬립에 부착되도록 둡니다.고정 단계로 넘어가기 전, 해부 시간이 30분을 초과하지 않도록 하십시오. 커버스립에 7.5% formaldehyde 5 µL를 첨가하여 혈구 세포를 고정합니다. 플레이트를 상온에서 15분 동안 그대로 둡니다.플레이트를 기울여 커버슬립이 잠길 정도의 충분한 양의 1x PBS로 커버슬립을 3회 세척하며, 각 세척 후에는 액체를 흡입하여 제거합니다. 각 웰에 100 µL의 투과화 용액을 넣고 실온에서 20분 동안 둡니다. 플레이트를 기울이고 가볍게 두드려 투과화 용액을 흡입하여 제거합니다.다음으로 커버슬립에 1차 항체 용액 500 µL를 첨가한 후, 필요에 따라 4 °C에서 빛이 차단된 상태로 하룻밤 동안 배양합니다. 1차 항체 용액을 제거하고, 저속

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Parasitoid (기생) 말벌을 포함한 여러 곤충들의 천적의 주요 클래스를...

의 기생충 말벌에 대한 소개<em&gt; Drosophila</em&gt; 그리고 Antiparasite 면역 반응

이 동영상은 파리 유충의 주요 조혈 부위인 초파리 림프샘에 대해 설명하고, 면역조직화학 및 형광 이미징을 위해 장기를 해부하고 장착하는 프로토콜의 예시를 보여줍니다.

유충 림프선 박리: 초파리 혈구 생산 기관 분리

초파리 혈림프는 혈액과 간질액의 역할을 하며 유충과 성충 단계에서 몸 전체를 순환합니다. 이 비디오는 순환 세포를 정량화하기 위해 유충 혈림프를 수집하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

큐티클 파괴: 초파리 유충에서 혈림프를 수집하는 방법

이 비디오는 초파리 유충의 조혈 주머니에서 혈구 재접착을 평가하는 혈구 교란 분석을 보여줍니다. 기계적 교란은 상주 혈구를 방출하여 순환 혈구 수를 증가시킵니다. 회복 후, 상주 혈구의 재부착이 확인되어 가역성을 보여줍니다.

조혈낭에 대한 적세포 재부착을 평가하기 위한 Hemocyte Disturbance Assay

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

초파리 혈액 세포 또는 혈구는 거주 부위와 순환 사이를 순환합니다.  유충에서 상주(고착성) 혈구는 유도성 미세환경인 Hematopoietic Pockets에 국한되는 반면, 순환하는 혈구는 혈림프에서 자유롭게 움직입니다. 이 프로토콜의 목표는 행동적으로 다르지만 상호 변화하는 이 두 가지 혈구 집단의 표준화된 분리 및 정량화입니다.

의 시금 혈액 세포 집단<em&gt; 초파리</em&gt; 유충

이 메서드는 3 차원 (3D) 모델 곤충 세포로 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 보여 줍니다. 초파리 애벌레에서 hemocytes 바이러스 성 또는 세균성 병원 체, ex vivo 또는 vivo에서감염 되었습니다. 감염 된 hemocytes 다음 고정 되었고 confocal 현미경 및 후속 3D 셀룰러 재건 이미징 스테인드.

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

이 프로토콜에서는 성인 초파리 melanogaster 식 인식 및 미생물 감염의 계량에서 vivo에서 먹어서 분석 결과를 설명 합니다.

과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

이 프로토콜은 소아 세포토균에 젊고 숙성된 Drosophila 멜라노가스터 혈구세포의 능력을 평가하고 정량화하는 데 사용되는 phagocytosis의 생체 내 분석방법을설명합니다.

인 비보 식세포 분석기를 사용하여 성인 Drosophila 멜라노가스터 혈구의 연령별 식세포 능력 평가

배우세요 초파리 애벌레의 림프선 분리 및 면역조직화학 기법을 활용한 조혈계 분석 방법입니다. 유전적·환경적 변화가 조혈 과정에 미치는 특정 효과를 규명할 수 있습니다.

방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다

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