나무 형성 및 보조 스템 개발에 관여하는 유전자 및 발기인 유학을위한 유도 체세포 업종 분석 (ISSA)의 사용

유도 체세포 섹터 분석(Induced Somatic Sector Analysis)의 전반적인 목표는 비교적 짧은 시간 내에 수목의 2차 줄기 조직 내에서 유전자 및 프로모터 구조체의 기능적 특성을 분석할 수 있는 중급에서 고급 처리량 기술을 제공하는 것입니다. 이 방법은 유전자가 어디서 언제 발현되는지뿐만 아니라, 목재 형성 및 2차 줄기 발달과 같은 생물학적으로 중요한 과정에서의 역할을 규명하는 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 효율적이고 간편하며 상대적으로 빠른 절차라는 점이며, 광범위한 수종에 적용 가능하다는 것입니다.

먼저, 박테리아 선택을 위한 적절한 항생제가 포함된 28 °C의 신선한 LB 배지 19 mL를 깨끗한 50 mL 스크류 캡 튜브에 준비합니다. A.tumefaciens 배양액 1 mL를 첨가하고 600 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정합니다. OD가 0.1보다 높으면 따뜻한 LB 배지로 추가 희석합니다. OD 600이 0.4에서 0.6 사이가 될 때까지 A.tumefaciens 배양액을 진탕 배양기에 넣고 배양합니다.

이 단계가 완료되면, 4°C에서 1,000 x g로 15분 동안 세포를 원심 분리합니다. 튜브에서 상층액을 따라내고, 세포 펠렛을 즉시 1 mL의 냉각된 MS 배지로 재부유시킵니다. 현탁액을 깨끗한 2 mL 마이크로튜브로 옮겨 필요한 시점까지 얼음에 보관합니다.

봄 또는 초여름에 실험을 시작하고, 형성층이 활발하고 빠르게 성장하는 식물을 선택하십시오. 이는 체관부를 자일럼(xylem)에서 쉽게 벗겨낼 수 있는지로 확인할 수 있습니다. 식물의 기부 근처에서 곧은 줄기 부분을 찾아 잎이나 가지를 제거하십시오.

날카로운 메스를 사용하여, 5mm 간격으로 두 개의 평행한 20mm 절개선을 사부(phloem)를 통해 만들어 1제곱센티미터 크기의 형성층 창(cambial window)을 냅니다. 그 후, 두 수직 절개선의 기부 끝단을 가로지르는 단일 수평 절개를 실시합니다. 사부 조각을 위쪽으로 걷어내어 발달 중인 목질부(xylem) 조직을 노출시킵니다. 그다음, 피펫을 사용하여 노출된 목질부 표면이 충분히 젖을 정도로 접종 배지를 첨가합니다.

즉시 체관부 조각을 줄기에 다시 삽입하고 파라필름으로 단단히 고정합니다. 관심 있는 모든 유전자나 프로모터에 대해 이러한 접종 단계를 반복하며, 기존 창보다 최소 1cm 위 또는 아래에 90도 오프셋으로 새로운 형성층 창을 만듭니다. 또한, 실험군 접종물과 마찬가지로 동일한 줄기 또는 줄기들에 양성 및 음성 대조군 벡터를 접종합니다.

줄기의 성장을 주기적으로 관찰하고, 반경 방향으로 최소 5 mm의 성장이 확인되면 $\beta$-glucuronidase 또는 GUS 분석을 위해 조직을 채취하십시오. 시험 재료를 채취하려면, 먼저 줄기에서 형성층 창(cambial window)을 절제하여 새로운 성장 부위가 아닌 모든 조직을 제거하십시오. 성숙한 xylem 및 phloem 세포 또는 조직 형태에 관한 연구의 경우, xylem에서 phloem을 벗겨내십시오.

또는 형성층 구역을 온전하게 유지해야 하거나 프로모터 발현 패턴을 평가해야 하는 연구의 경우, 면도날을 사용하여 형성층 윈도우를 횡단면으로 절단하여 0.5~1 mm 두께의 디스크를 만듭니다. 수확한 형성층 윈도우 조직을 개별 14 mL 라운드 바텀 튜브에 넣고, 조직이 완전히 잠기도록 하여 pH 7의 0.1 M 인산염 완충액으로 5분씩 두 번 헹굽니다. 두 번째 헹굼이 끝난 후, 남은 용액을 모두 주의 깊게 제거합니다.

다음으로, 각 튜브에 GUS 시약 5 mL를 넣습니다. 조직 샘플이 완전히 잠기지 않은 경우, 시약을 추가로 넣습니다. 튜브를 55 °C의 암실에서 10분 동안 배양합니다.

그 다음, 튜브를 37°C의 셰이커에서 부드럽게 흔들어주며 어두운 상태로 12~16시간 동안 더 배양합니다. 인큐베이터에서 꺼낸 후, 튜브 중 임의의 하위 집합을 선택하여 pH 범위가 0에서 7인 리트머스 시험지로 GUS 시약의 pH를 확인합니다. 만약 pH가 6보다 낮은 튜브가 있다면, 해당 튜브에 라벨을 표시하고 나머지 튜브들을 확인합니다.

pH가 6 미만인 튜브에 라벨을 붙이고 제외하십시오. 튜브에서 GUS 시약을 따라내고 조직이 잠길 만큼의 충분한 70% 에탄올로 교체하십시오. 샘플을 필요할 때까지 4°C에서 보관하십시오.

깨끗한 핀셋을 사용하여 샘플 튜브에서 모든 형성층 윈도우 조직을 제거하고, 현미경 관찰을 위해 작은 트레이나 페트리 접시에 놓습니다. 1배에서 4배율 사이의 실체 현미경 렌즈 아래에 샘플을 두고, 밝은 파란색으로 염색된 세포 또는 조직의 수를 확인하고 집계합니다. 사관이 제거된 사례의 경우, 발달 중인 목질부 표면에서 발견되는 형성층 조직 내의 섹터 수를 셉니다.

디스크 형태로 절단된 시료의 경우, 서로 다른 세포 또는 조직 유형에서 발견되는 섹터의 수를 측정합니다. 디스크의 양면을 모두 확인하고, 두 개의 디스크에 걸쳐 나타나는 섹터는 서로 매칭시켜 숫자가 과다하게 산정되지 않도록 합니다. 섹터가 포함된 조직만을 70% 에탄올이 담긴 튜브에 다시 넣고 필요할 때까지 보관합니다.

양성 및 음성 대조군을 포함하여 수확한 추가 형성층 창(cambial windows)에 대해 분석을 반복하십시오. 구역의 정확한 식별과 분류를 돕기 위해, 상처에 대한 줄기의 반응을 포함하여 줄기의 2차 해부학적 구조 및 발달 과정에 익숙해질 것을 권장합니다. 이 그림은 청색으로 염색된 영역으로 나타나는 여러 성공적인 형질전환 사례를 보여줍니다.

예시로 제시된 체관부 박피 창에는 여러 개의 형질전환 구역이 나타나 있으며, 두 가지 수종에서 채취한 디스크들은 형질전환 구역과 그 이후의 방사형 성장을 보여줍니다. 다양한 조직 유형에서의 형질전환 또한 관찰할 수 있습니다. 여기서는 흰포플러의 코르크 형성층, 체관부, 상처 유세포 및 기타 여러 조직 부위에서 줄기 구역을 확인할 수 있습니다.

이 이미지는 형성층 유도체에서의 유전자 프로모터 발현 결과를 보여줍니다. 본 예시에서는 유칼립투스 하이브리드 줄기로 형질전환된 eucalyptus grandis의 다양한 CesA 프로모터를 포함하는 실험에서 각 조직 유형별 염색 비율을 확인할 수 있습니다. 사부, 발달 중인 목질부 및 발달된 목질부에서의 발현은 백분율로 표시됩니다.

접종된 형성층 센티미터당 평균 형질전환 이벤트 횟수 또한 각 프로모터 또는 관심 유전자에 대해 계산할 수 있습니다. 이 표는 디스크 수확법을 사용하여 분석한, 양성 대조군 또는 관심 프로모터로 형질전환된 유칼립투스와 포플러 피험체에서 확인된 전형적인 섹터의 데이터를 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 2차 줄기 발달 과정에서 형성층 분화의 복잡한 특성을 분석하는 빠르고 효율적이며 널리 적용 가능한 방법을 제공할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 식물과 박테리아를 준비하는 방법, 형질전환 및 줄기 배양과 회수 방법, 그리고 표현형 평가를 위해 형질전환 조직을 식별하고 분류하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.