Name: 성인 마우스에서 동방 노드 근육 세포의 분리, 문화 및 기능 특성화하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 배우세요 성인 마우스에서 동방 결절 심근 세포를 분리하고 배양하는 방법을. 심장 박동 조절 메커니즘과 이온 전류 연구에 활용할 수 있는 기능적 특성 분석 기술을 익히세요.

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원고를 비판적으로 읽어주신 Christian Rickert 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 국립심장폐혈액연구소(National Heart Lung and Blood Institute, R01-HL088427)의 CP에 대한 보조금의 지원을 받았습니다. EJS는 국립노화연구소(National Institute on Aging)의 5T32-AG000279의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

모든 동물의 절차는 콜로라도 앤 슈츠 의료 캠퍼스의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다. 표준 프로토콜은 다음과 나이 2 ~ 3 개월 남성 C57BL / 6J 마우스를 사용하여 최적화되었습니다. 1. 실험의 사전에 솔루션 주식 ​​및 용품 준비 참고 : 필요한 장비 및 소모품에 대한 자료 표를 참조하십시오. <ol><li> 전체 타이로드의, 저 칼슘 / 마그네슘 2+ 타이로드의, 수정 크래프트 - Brühe (KB) 솔루션 및 소 혈청 알부민 (BSA) 해결 방법 : 표 1에 나타낸 바와 같이 1 L 다음 솔루션의 각을 준비합니다. 사용 초순수 모든 솔루션을 탈 이온수를 여과 하였다. 최대 6 개월 동안 20 ° C에서 각각 50 ㎖ 씩에 솔루션 및 저장소를 나눈다. 바로 실험을하기 전에 각각의 분취 량을 해동, 1 주일에 최대 4에 대한 저장6; C. </li><li> 초순수 여과 탈 이온수 (표 1)에 염화나트륨과 염화칼슘이 용해 된 10 mM의 NaCl과 1.8 mM의 CaCl2를 적응 용액 50 ㎖를 준비합니다. 최대 6 개월 동안 실온에서 보관하십시오. </li><li> 의 microfuge 튜브에 피펫 팅에 의해 엘라 스타 제의 4.75 효소 활성 단위 (U) 분취 량을 준비합니다. 최대 세 달 동안 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 의 microfuge 튜브에 피펫 팅에 의해 콜라게나 프로테아제 효소 블렌드 (초순수 H 2 O)에 375 μg의 분취 량을 준비합니다. 최대 3 개월 -20 ° C에서 보관. </li><li> (도 1Aiv 그림 1C ~ 1.5 mm 최종 개구 직경)과 해리 하나 (1 ~ 2 mm 직경도 1Aiii 그림 1C)이 화재 - 광택 파스퇴르 피펫, 조직 전송을 위해 하나를 준비합니다. <ol><li> 점수 파스퇴르 유리 커터 피펫 및 원하는 크기보다 약간 큰 개구를 생성하기 위해 상기 점수를 따라 스냅. 불두꺼운 벽 연마 원하는 직경의 개구를 생성하는 분젠 버너의 화염이 낮은 이상 ~ 30 ~ 60 초 동안 각각의 피펫의 절단 단부 -polish. 화재 연마 개방 균열이나 거친 가장자리 무료입니다 확인합니다. </li></ol></li><li> 추가하여 두 해부 요리를 준비 ~ 25 ml의 실리콘 엘라스토머 각각 100mm 페트리 접시에 제조업체의 방향 (그림 1Ai 및 그림 1B)에 따라 혼합. 48 시간 동안 실온에서 치료 할 수 있습니다. </li><li> 문화에만 : ml의 25-50을 준비 각각의 도금 중간 및 표 2에 따라 문화 매체 스토어 2 주까지에서 4 ℃로합니다.. </li></ol> 2. 준비 솔루션은 세포 분리의 날에 사용되는 주 : 다음 금액은 한 마우스에서 동방 근육 세포의 분리를위한 것입니다. <ol><li> 추가 2.5 낮은 칼슘 ml의 2 + 세 개의 작은, 둥근 바닥 문화 튜브의 각 / 마그네슘 2+ 타이로드의 (PH 6.9)에스. 35 ± 1 ° C의 물을 욕조에 넣어 튜브. </li><li> 저 칼슘 / 마그네슘 2+ 타이로드의 하나의 큰 둥근 바닥 문화 튜브의 2.5 ML을 추가합니다. 이 튜브에, 1 분취 (4.75 U) 엘라 스타 제와 하나의 나누어지는 (375 μg의) 콜라게나 프로테아제 효소의 조화를 추가합니다. 혼합 소용돌이 친다. 35 ± 1 ° C의 물을 욕조에 넣어 튜브. </li><li> 세 개의 추가 작은 둥근 바닥 문화 튜브와 하나의 추가 크고 둥근 바닥 문화 튜브에 KB 매체의 2.5 ML을 추가합니다. 35 ± 1 ° C의 물을 욕조에 넣어 튜브. </li><li> 하나의 큰 바닥이 문화 튜브에 BSA 용액 ~ 7 ML을 추가합니다. 실온에서이 튜브를 유지합니다. </li><li> 50 비이커 (그림 1Aii)에 완료 타이로드의 솔루션의 20 ~ 40 ml에 놓습니다. 혼합 10 USP / ㎖ 헤파린, 소용돌이를 추가하고 35 ± 1 ° C의 물을 욕조에 비커를 놓습니다. </li></ol> 배양 된 세포는 (급성 고립 된 세포에 대해이 단계를 건너 뛰기) 3. 추가 솔루션 및 재료 준비 <ol><li>무균 조직 배양 후드에서 24 웰 플레이트의 각 우물에 마우스 당 두 개의 12mm 라운드 커버 글라스를 배치합니다. 참고 : 우물 후속 바이러스 감염의 볼륨을 제한하는 역할을 편리한 크기 때문에 24 웰 플레이트가 사용됩니다. </li><li> 피펫 각 커버 슬립 위에 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)에 희석 마우스 라미닌의 100 NG / ㎖ 용액 약 200 μL. </li><li> 37 ° C의 배양기에서 분리 (적어도 1 시간)의 기간 동안 라미닌 커버 슬립을 부화. </li><li> 사전 따뜻한 도금 매체와 문화 매체 37 ° C에 (단계 1.7 표 3에서). </li></ol> 4. 동방 노드 격리 <ol><li> 화학 퓸 후드에서, 두 챔버 박스의 챔버 내에 마우스를 배치하고, 다른 챔버에 면봉을 통해 도입 ~ 200 ㎕의 액체를 이소 플루 란 마취. 발가락 핀치와 (보통 30 ~ 60 초 ~ 이내) 마취를 확인합니다. 안락사자궁 경부 전위로 마우스. 주 : 빈 1 ml의 피펫 팁 박스는 2 챔버 박스를 형성하는데 사용될 수있다; 직접 접촉 마우스를 방지하기 위해 이소 플루 란에 대한 별도의 구획을 만들기 위해 상자에 거꾸로 랙을 켭니다. </li><li> 외부 조직 포셉 (그림 1Aviii) 및 해부 가위 (그림 1Avix)를 사용하여 흉강을 노출 가위 및 횡단면 리브 케이지 가슴에서 모피를 제거합니다. ~ 2 ml의 헤파린이 전송 피펫을 이용하여 완전한 타이로드의 가온과 흉강을 목욕. 참고 : 필요한 경우 준비가 건조하는 것을 허용하지 않습니다, 목욕 흉강을 계속합니다. </li><li> 해부 현미경 하에서 조심스럽게 폐를 제거하고 내부 가위 (그림 1Avi) 및 해부 포셉 (그림 1Avii)를 사용하여 흉선. </li><li> 부드럽게 내부 해부 집게로 마음의 정점을 잡고 조심스럽게 하대 정맥하고 A 컷내부 가위로 오르타는 흉강의 심장을 제거합니다. 실리콘 해부 요리 중 하나에 마음을 전송하고 ~ 4 ml를 완료 타이로드의가 전송 피펫을 사용하여 헤파린 따뜻해진와 목욕. </li><li> 동양 심장 등의 후방 선박이 표시 및 실험자의 왼쪽에있는 동물의 실험자의 오른쪽 우심방과 좌심방으로,이 위를 향하도록되어있다. 지향되면, 실리콘 해부 접시에 정점을 고정하여 마음을 고정. </li><li> 심실과 심방 (심실 위의 맑은 링) 사이의 홈을 찾습니다. </li><li> 내부 해부 가위를 사용하여 심방보다 심실에 가까운 유지 홈에 절개를합니다. 추가 따뜻하게 헤파린 완료 타이로드가 같은 심방과 밸브의 밝은 전망을 허용하는 데 필요한의로 홈과 절개를 플래시합니다. 심실에서 심방을 분리 홈을 따라 절단 계속합니다. </li><li>두 번째 실리콘 해부 접시에 심방 조직을 전송하고 ~ 3ml를 완료 타이로드의를 헤파린 따뜻해진와 목욕. </li><li> 오리엔트 동물의 우심방는 실험자의 왼쪽 이제 조직이되도록, 및 좌심방이 오른쪽이다. 참고 : 좌심방이 어두운 붉은 톤 이상을 보유하고있는 동안 우심방이 더 투명합니다. </li><li> 조심스럽게 준비 스트레칭, 하부 우수한 대정 cavae 오른쪽과 왼쪽 심방 부속을 통해 조직을 고정. 준비 (동방 노드가 아주 섬세하고 쉽게 손상 될 수있는, 심방 벽에 절단되지 않도록주의)을 명확하게 볼 수 있도록 남아있는 지방이나 기타 조직을 제거합니다. </li><li> 대정맥을 통해 절단에 의해 심방의 앞쪽 벽을 엽니 다. 심방 중격를 시각화하기 위해 필요에 따라 핀을 다시하는 것은-놓습니다. </li><li> 좌심방을 제거하기 위해 심방 중격을 따라 잘라. 부드럽게 스트레칭, 준비를 다시하는 것은-핀. </li><li> t을 제거우심방 부속 그와 심방 부속 경계 어두운 오렌지 행진으로 나타나는의 cristae의 terminalis을 따라 절단하여 동방 노드를 무료로 제공됩니다. </li><li> 마디 조직을 다시 핀과 세 개의 동일한 크기의 스트립을 생성합니다 (crista의 terminalis에 수직) 옆으로 잘라. </li></ol> 5. 동방 노드 소화 <ol><li> 좁은 불을 광택 피펫 (그림 1Aiv)를 사용하여, 저 칼슘 2.5 ml에 포함 된 세 개의 작은, 둥근 바닥 튜브의 첫 번째로 동방 노드 조직의 세 개의 스트립을 전송 2+ / 마그네슘 2+ 타이로드의 35 ± 1 °의 C 물 목욕. 5 분 동안 품어. </li><li> 2.5 ml의 낮은 칼슘이 포함 된 두 번째 작은 둥근 바닥 튜브로 전송 조직 스트립 2+ 같은 좁은 피펫을 사용하여 / 마그네슘 2+ 타이로드의 35 ± 1 ° C의 물을 욕조에. 부드러운가 튜브를 소용돌이 또는 부드럽게 좁은 피펫 피펫 팅하여 조직 스트립을 씻으십시오. 안 인버튜브에서 t. </li><li> 2.5 ml의 낮은 칼슘을 함유하는 제 작고 둥근 바닥 튜브에 전송 조직 스트립 2+ ㎎ / 2+의 타이로드하고, 단계 5.2에 기재된 세정 공정을 반복한다. </li><li> 저 칼슘 2.5 ml에 포함 된 큰 둥근 바닥 튜브에 전송 스트립 2+ / 마그네슘 2+ 타이로드의 35 ° C의 물을 욕조에있는 효소 (엘라 스타 플러스 콜라게나 - 단백질 분해 효소 혼합)와 함께. 세 조직 스트립이 있는지 확인합니다. 35 ± 1 ℃에서 10 ~ 15 분 동안 품어. 부드럽게 튜브를 소용돌이에 의해 매 5 분을 섞는다. 튜브를 반전하지 마십시오. </li></ol> 6. 동방 노드 심근 해리 <ol><li> 효소 분해 후, 온화하게 35 ± 1 ℃에서 2.5 ml의 KB 용액을 포함하는 제 작고 둥근 바닥 튜브에 조직 스트립 전송 좁은 화재 연마 피펫을 사용한다. 부드럽게 튜브를 소용돌이로 조직을 씻으십시오. 참고 : 조직 스트립이 약간 반투명 나타나고 번째에서 함께 응집 할 수있다포인트입니다. 세포 손실을 방지하는 효소 소화 한 후 매우 부드럽게 처리합니다. </li><li> 35 ± 1 ℃에서 2.5 ml의 KB를 함유하는 제 2 미소 둥근 바닥 튜브에 조직을 옮긴다. 씻어 부드럽게 소용돌이. </li><li> 35 ± 1 ℃에서 2.5 ml의 KB 함유 세번째 작은 둥근 바닥 튜브에 조직을 옮긴다. 씻어 부드럽게 소용돌이. </li><li> 35 ± 1 ℃에서 2.5 ml의 KB 함유 큰 둥근 바닥 튜브에 조직을 옮긴다. </li><li> 돌보는, 약 0.5 Hz에서 5 ~ 10 분 동안 일정하게 분쇄하여 큰 둥근 바닥 튜브에 세포를 떼어 놓다, 더 큰 화재 연마 피펫 (그림 1Aiii 그림 1C)를 사용하면에 잠긴 해리 튜브를 유지하는 35 ± 1 ° C의 물을 욕조 및 솔루션에 거품을 도입 피하기 위해. 참고 : 분쇄 시간은 해리 피펫의 직경과 피펫의 힘에 따라 달라집니다. 조직 조각을 t로 남아 있도록 시간 조정되어야그는 해리의 끝은 얇고 투명하고 전경이 나타납니다. 조직이 어떤 색깔을 유지하는 경우, 분리가 불완전 할 가능성이 높습니다. 주파수 (0.5 Hz에서) 손에 의해 결정된다. </li><li> 수조로부터 해리 된 SAM을 함유하는 둥근 바닥 튜브를 제거하고 실온에서 5 분간 평형화. </li></ol> 제 동방 노드 칼슘 재 적응 (상온에서) 참고 : SAM을 문화 실험을 향하는를 들어, 다음 항목의 절차는 무균 조직 배양 후드에서 수행해야합니다. SAM을 급성 실험에 사용되는 경우, 무균 환경에서 이러한 단계를 수행 할 필요가 없다. <ol><li> 염화나트륨 / 염화칼슘이 적응 용액 (표 2)의 75 μl를 추가합니다. 혼합 5 분 동안 품어 부드럽게 소용돌이. </li><li> 염화나트륨 / 염화칼슘이 적응 용액 160 μl를 추가합니다. 혼합 5 분 동안 품어 부드럽게 소용돌이. </li><li> BSA 졸의 390 μl를 추가의 ution (표 2). 혼합 4 분 동안 품어 부드럽게 소용돌이. </li><li> BSA 용액의 1.25 ML을 추가합니다. 혼합 4 분 동안 품어 부드럽게 소용돌이. </li><li> BSA 용액의 4.37 ML을 추가합니다. 혼합 4 분 동안 품어 부드럽게 소용돌이. 참고 : 칼슘의 최종 농도가 1.8 mM의 것입니다. </li><li> 칼슘 재 적응 후, 3 분 ~ 2000 XG에 10 분 ~ 또는 원심 분리하여 중력에 의해 정착 할 수 있도록하여 SAM에를 수집합니다. <ol><li> 급성 고립 셀 부드럽게 ~ 2 ㎖를 세포 남겨 제거하고 유리 파스퇴르 피펫을 이용하여 상층 액의 약 5 mL를 버린다. 패치 클램프 녹음 최대 8 ~에 시간 동안 실온에서이 세포를 저장합니다. </li><li> 배양 된 세포를 들어, 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 가능한 한 상등액의 정도를 제거합니다. 미리 예열 한 용액에 재현 탁 세포 펠렛 (37 ° C) 도금 중간 (표 2). </li></ol></li></ol> 동방 묘 8. 도금 및 문화cytes (급성 고립 세포에 대한 건너 뛰기) <ol><li> 파스퇴르 피펫 단계 3.3에서 커버 슬립에서 라미닌 솔루션을 제거합니다. 즉시 (3 단계) 각 라미닌 - 코팅 커버 슬립 상에 500 μl를 (~ 50 ~ 100 셀) 시드. 참고 : 수축 억제제 2,3- 부탄 monoxime (BDM)은 셀 (9)의 마찰이 발생 수축을 방지하기 위해 도금과 문화 미디어에 포함되어 있습니다. </li><li> 인큐베이터를 새로 접종 된 SAM을 포함하는 24 웰 플레이트를 돌려 95 % 공기 / 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 유지한다. 세포가 도금 미디어에서 4-6 시간 (표 2)에 대한 커버 슬립을 준수 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 도금 매체를 제거합니다. 미리 예열 (37 ° C) 문화 매체의 잘 당 500 μL (표 2)로 교체하십시오. </li></ol> 성인 동방 심근 문화의 9 아데노 바이러스 형질 도입 (급성 고립 된 세포에 대한 건너 뛰기) <ol><li> 가전의 수를 예측즉시 배율 조정, 현미경 시야에서 세포를 계수하여 아데노 바이러스를 적용하기 전에 커버 슬립 당 LLS. 모든 셀뿐만 아니라 SAM에를 계산합니다. </li><li> 보통 199에서 아데노 바이러스를 희석하고 1-10 μL의 응용 프로그램이 셀 당 100 바이러스 단위의 감염의 최종 다양성 (MOI)를 달성하기 위해 필요하므로 바이러스 역가의 희석을 조정합니다. 직접 도금 SAM을 상에 적하 방식으로 아데노 바이러스 솔루션을 추가합니다. </li><li> 바이러스 함유 배지 하룻밤 (~ 12 ~ 14 시간)와 세포를 품어. 그리고 신선한 배지로 교환합니다. 목적 단백질의 발현이 얻어 질 때까지, 배양 배지를 매 48 시간을 변경 배양기에서 세포를 유지한다. </li></ol> 급성 격리 또는 배양 SAM을 10. 기능 평가 참고 : 다음 프로토콜은 자연 AP와 나는 모두를 기록하는 천공 패치 기술을 암포 테리를 사용하여 격리 된 SAM의 기능 평가의 예입니다 <sub&gt; 동일한 셀로부터 F (참고 9 참조). <ol><li> 표 3에 기록 된 바와 같이 용액을 준비한다. </li><li> 녹화 일 신선한 DMSO에 20 ㎎ / ㎖의 암포 테리 신 B-원액을 준비한다. 실온에서 재고를 유지하고 빛으로부터 보호합니다. 200 UG의 최종 농도로 세포 내 용액에 암포 테리 신-B 주식을 희석는 / 그냥 사용하기 전에 ml로. 얼음에 최종 피펫 솔루션을 유지하고 빛으로부터 보호합니다. 참고 실험의 암포 테리 신 - 함유 피펫 용액은 적어도 1 분 동안 세포 용액 텍싱로 원액의 분취 액을 희석하여 신선한 시간당 제조되어야한다. </li><li> 의 분취 이동시켜 급성 SAM의 세포 현탁액을 35 ± 1 ℃에서의 타이로드 용액을 함유하는 기록 챔버로 배양 SAM에 담지 된 유리 커버 슬립의 단편 해리. 적어도 2 분 전에 전기 생리 recordin에 대한 타이로드의 솔루션 세포를 관류GS는 문화 매체에 남아있는 잔류 BDM를 제거합니다. 주 : 자발적인 수축 즉시 타이로드의 솔루션에 전송에 분명해야합니다. 기록 된 SAM 자발적인 수축 활성 특징 형태 (예.,도 2), 줄무늬 부족 HCN4 단백질의 발현, I f를 현재 존재 멤브레인 용량 &lt;50 pF의, 자발적 AP를 포함하여 기능의 조합에 의해 식별 될 수있다 확장기 탈분극 상과 느린 상향 행정을 포함 파형과 함께. </li><li> 1.5-3.0 MΩ의 저항과 붕규산 유리 피펫을 사용하여, 세포 내 용액으로 끝을 작성은 10-30 초 동안 침지하여 암포 테리 부족. 그런 다음, 암포 테리 신 함유 용액에 피펫을 다시 채우기. GΩ 세포 부착 밀봉 가능한 한 신속하게 얻을 수 있습니다. 시일 형성이 곤란한 경우, 팁 - 충전 시간을 증가시킨다. 주 : 액세스 저항은 계속되어야한다셀에 연결된 실의 형성 다음 모니터링 및 녹음은 &lt;10 MΩ의 안정된 접속 저항을 획득 한 후 시작해야합니다. </li><li> 자연 AP를 기록하려면, 전류가 주입 빠른 전류 클램프 모드로 앰프를 전환합니다. 주 : 앞서 열을보고, 연소율을 안정화 AP를 기록 할 때 1 나노 이소은 타이로드의 세포 외 용액에 포함된다. </li></ol>

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이 논문은 성인 쥐에서 완전히 차별화 된 동방 노드 근육 세포의 분리 및 문화에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 분리 프로토콜은 안정적으로 즉시 전기 생리 분석 또는 후속 문화 중 하나에 적합한 자연 활성 마우스 SAM에 생성됩니다. 유사한 프로토콜 (예를 들어, 참조 11,12,10,13-17 참조) 많은 다른 그룹에 의해보고되었다. 그러나, 체외에서 성인 마우스 SAM을 유지를위한 우리의 프로토콜은 특징적인 형태, 자발적인 활동 및 세포의 전기 생리 특성을 보존하고 단백질 9의 아데노 바이러스 전달을 위해 수 있습니다. 수정 및 프로토콜의 문제를 들어, 몇 가지 중요한 단계는 주목해야한다. 첫 번째 중요한 요소는 주어진 위해 준비 할 격리 극적 번호의 SAMs의 질을 바꿀 수있는 분해 효소 (1.4 단계)의 활성에 중요한 로트 가변성 인ATION. 이러한 변동은 전형적으로 세포 수 및 건강을 최대화하기 위해 많은 ...

페이스 메이커의 심장의 동방 노드에서 근육 세포 (동방 근육 세포는, &quot;SAM을&quot;)는 각각의 심장 박동을 시작 심근 통해 전파 자연, 리듬 활동 전위 (APS)를 생성합니다. 많은 종에서 급격하게 격리 된 SAM을 사용하여 실험 맥박 조정기 활동의 발생에 기여하는 메커니즘을 해명 필수적이었다. SAM을는 형태, 기능 및 단백질 발현의 관점에서, 심방 및 심실의 심근의 해당 실질적으로 상이 고도로 전문화 심근이다. SAM을 자발적 액세스 포인트들의 특징은 다음 AP 1,2 트리거 임계 막 전위를 구동 이완기 자발적인 탈분극이다. 이러한 &quot;심박 전위&quot;많은 상이한 &quot;재미 전류&quot;(I의 F)을 포함하여 막 전류 T- 및 L 형 칼슘 전류와 나트륨 - 칼슘 교환기 CURR의 활성에 따라 조정근질 세망 3,4에서 칼슘 방출에 의해 구동되는 엔트 (I NCX). 급성 고립 된 마우스 SAM을가 심장 박동의 연구에 필수적인 실험 준비를하는 동안 마우스 SAN의 불명료 한 해부학과 작은 크기가 미묘한 미세 절제와 결합 된 효소 및 기계를 필요로하기 때문에, 마우스에서 SAM을의 분리 채택하기 어려운 방법이 될 수 있습니다 세포의 분리주의 최적화가 필요합니다. 우리는 여기에 성공적으로 패치 클램프 녹음 5-8을위한 성인 마우스에서 SAM을 격리하는 데 사용 된 프로토콜의 상세한 비디오 데모를 제공합니다. 우리의 지식에, 다른 소스에서 사용 가능한 시각적 데모가 없습니다. 또한, 새로운 방법이 설명된다되는 성인 마우스로부터함으로써 유전자의 단백질의 도입을 허용하는, 수 일간 시험관 내에서 유지 될 수있는 SAM을 격리아데노 바이러스 감염 (9)을 통해 기자 분자 또는 RNAi의.

<table><tbody><tr><td>Sylgruard/Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 9" 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>작고 둥근 바닥 배양 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>크고 둥근 바닥 배양 튜브</td><td>Corning</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Worthington 생화학</td><td>LS002279</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>조직 해리 솔루션</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>SAGENT Pharmaceuticals&nbsp;</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>마우스 라미닌</td><td>코닝</td><td>CB-354232</td><td></td></tr><tr><td>12mm 라운드 글라스 커버슬립</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>24웰 배양 플레이트</td><td>Fisher</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Ad-mCherry</td><td>Vector Biolabs</td><td>1767</td><td></td></tr><tr><td>Ad-eGFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱, 일회용 전사 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-496</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 겸자</td><td>Roboz 계기</td><td>RS-4904</td><td></td></tr><tr><td>조직 집게</td><td>Roboz 계기</td><td>RS-8164</td><td></td></tr><tr><td>해부 홍채 가위</td><td>WPI, Inc.</td><td></td><td></td>501264</tr><tr><td>해부 핀</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>60353</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마</td><td>G0350500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>타우린</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>K-글루타메이트</td><td>Sigma</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>K-아스파르테이트</td><td>Sigma</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>크레아틴</td><td>Sigma</td><td>C0780</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin-B</td><td>Fisher Scientific</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>Calbiochem</td><td>420355</td><td></td></tr><tr><td>Media199</td><td>Sigma</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>2,3-부탄디온 모노심 (BDM)</td><td>시그마</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>소태아 혈청 (FBS)</td><td>시그마</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>혈청 알부민 (BSA)</td><td>시그마</td><td>A5611</td><td></td></tr><tr><td>인슐린&nbsp; &nbsp;</td><td>시그마</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>트랜스페린</td><td>시그마</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>셀레늄</td><td>시그마</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>페니실린</td><td>GE 헬스케어</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신</td><td>하이클론</td><td>SV30010</td><td></td></tr></tbody></table>

성인 마우스에서 동방 노드 근육 세포의 분리, 문화 및 기능 특성화하는 방법

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

자발적인 활동 전위 (APS)를 생성하여 이길 각각의 마음을 개시 마음의 자연 페이스 메이커로 동방 노드 근육 세포 (SAM을) 행위. 이 페이스 메이커 AP는 다수의 막 전류와 세포 내 칼슘 자전거의 조정 활동을 반영합니다. 그러나 SAM을에서 자연 페이스 메이커 활동을 구동하는 정확한 메커니즘은 애매 남아있다. 급성 고립 된 SAM은 실험 심장 심장 박동의 분자 기초를 해부하기위한 필수적인 준비합니다. 그러나, 불명료 한 해부학, 복잡한 미세 절제, 그리고 몹시 신경을 쓰는 효소 소화 조건은 급성 고립 된 SAM의 광범위한 사용을 방지했다. 또한, 방법은 단백질 발현 연구에 SAM에의 장기 문화를 허용하는 최근까지 사용할 수 없었다. 여기에서 우리는 성인 쥐에서 SAM을의 분리를위한 단계별 프로토콜 및 비디오 데모를 제공합니다. 방법은 또한 시험 관내 및 expressi 위해 성체 마우스의 SAMs 유지를위한 입증되고아데노 바이러스 감염을 통해 외래 단백질에. 급성 격리 및이 방법에 의해 제조 배양 된 SAM은 전기 생리 및 이미징 연구의 다양한 적합하다.

여기에 설명 된 프로토콜은 이전에 다른 패치 클램프 실험 5-8 다양한 적합한 성인 마우스로부터 자발적 활성 SAM을 분리하기 위해 사용되어왔다. 또한, 프로토콜 최대 1 주 동안 배양 유지할 수있다 절연 SAM을 허용한다. 배양 된 세포로의 유전자 전달은 아데노 바이러스 감염 9를 통해 달성 될 수있다. 이 절에서 제시된 결과는 이전 연구에서 파생과 급성 분리 및 배양 SAM을의 특성의 예로서 여기에 표시됩니다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 자발적 활성 SAM을 최대 6 일 동안 배양 유지할 수있다. 배양 된 세포를 유의 평균 길이, 폭의 변경, 단면적, 또는 배양의 막 커패시턴스, 급성 격리 된 SAM과 매우 유사한 전체 형태를 유지세포는 심하게 격리 세포 (- E</str...

방법은 패치 클램프 전기 생리학 또는 이미징 연구를위한 성인 마우스의 동방 노드 근육 세포 (SAM을)의 분리를 위해 증명된다. 분리 된 세포를 직접 사용할 수 또는 부호화 유전자 리포터로서 관심 단백질의 발현을 허용하는 배양에서 유지 될 수있다.

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 단기 또는 중기 전기생리학적 실험이나 이미징 실험을 위해 마우스로부터 자발적으로 활성화되는 동방결절 심근세포를 분리하는 것입니다. 분리된 동방결절 심근세포는 심장 페이스메이커 메커니즘, 특히 특정 이온 전류나 세포 내 칼슘 방출 타이밍에 관한 연구에 매우 중요합니다. 하지만 서면으로 된 방법만으로는 해당 절차를 익히기가 매우 어렵기 때문에, 마우스 유래 분리 동방결절 심근세포를 사용하는 연구실은 상대적으로 적은 편입니다.분리에 필요한 모든 용액을 준비한 후, 가위를 사용하여 동물의 가슴 부위 털을 제거합니다. 그다음 외부 조직 포셉과 해부 가위를 사용하여 흉곽을 절개하여 흉강을 노출시킵니다. 헤파린이 포함된 가온된 완전 Tyrode's 용액 2 mL로 흉강을 헹굽니다.해부 현미경 하에서 내부 가위와 해부용 핀셋을 사용하여 폐와 흉선을 조심스럽게 제거합니다. 심장의 정점을 부드럽게 잡은 상태에서 하대정맥과 대동맥을 조심스럽게 절단하여 흉강에서 심장을 적출합니다. 그 다음 심장을 실리콘 해부 접시 중 하나로 옮긴 후, 2~4 mL의 가온된 헤파린 처리 완전 Tyrode's 용액으로 헹굽니다.후방 혈관들이 보이고 위를 향하도록 심장의 방향을 잡습니다. 다음으로, 심장의 심첨부를 통해 실리콘 해부 접시에 핀으로 고정하여 움직이지 않게 합니다. 그 후, 심실과 심방 사이의 홈을 찾습니다.내부 해부 가위를 사용하여 심실에 가깝게 유지하면서 홈 부위를 절개합니다. 심방과 판막을 명확하게 관찰할 수 있도록 필요에 따라 따뜻하게 데운 헤파린 처리된 Tyrode's complete solution으로 홈과 절개 부위를 세척합니다. 그런 다음 홈을 따라 계속 절개하여 심방을 심실로부터 분리합니다.그 다음, 심방 조직을 두 번째 실리콘 해부 접시로 옮기고 3 mL의 가온된 헤파린 처리된 Tyrode's 완전 용액으로 헹굽니다. 이후, 준비물을 부드럽게 늘리면서 하대정맥을 통해 조직을 핀으로 고정합니다. 그런 다음 조직을 뒤집어 동물의 우심방이 실험자의 왼쪽에, 좌심방이 실험자의 오른쪽에 오도록 배치합니다.정확한 조직을 분리하기 위해서는 방향을 파악하고 인식하는 것이 매우 중요합니다. 상대정맥을 통해 조직을 고정한 다음, 우심방 및 좌심방 이(atrial appendages)를 핀으로 고정하십시오. 준비된 시료를 명확하게 관찰할 수 있도록 남아 있는 지방이나 기타 조직을 제거하십시오.이어서, 대정맥을 절개하여 심방의 전벽을 엽니다. 상대정맥과 하대정맥을 모두 박리할 수 있도록 필요에 따라 접시를 회전시킵니다. 심방중격이 잘 보이도록 필요에 따라 핀의 위치를 조정합니다.그런 다음 심방 중격을 따라 절개하여 좌심방을 제거합니다. 표본을 다시 핀으로 고정하고 부드럽게 늘린 후, 동방결절 뒤쪽의 지방을 제거합니다. 그 후 우심방이를 제거하고, 심방이의 경계에 진한 주황색 선으로 나타나는 말단능을 따라 절개하여 동방결절을 분리합니다.결절 조직의 핀을 다시 고정하거나 제거한 후, 가로 방향으로 절단하여 동일한 크기의 조각 3개를 만듭니다. 이 과정에서 끝을 좁게 가열 처리한 피펫을 사용하여, 2.5 milliliters의 저칼슘-마그네슘 Tyrode 용액이 담긴 3개의 작은 라운드 바텀 튜브 중 첫 번째 튜브에 동방결절 조직 조각 3개를 옮기고 5분 동안 배양합니다. 5분 후, 조직 조각들을 2.5 milliliters의 저칼슘-마그네슘 Tyrode 용액이 담긴 두 번째 작은 라운드 바텀 튜브로 옮깁니다.튜브를 부드럽게 흔들거나 좁은 피펫으로 조심스럽게 피펫팅하여 조직 스트립을 세척하십시오. 튜브를 뒤집지 마십시오. 그런 다음 2.5 milliliters의 저칼슘 마그네슘 Tyrode's 용액이 들어 있는 세 번째 소형 라운드 바텀 튜브로 조직 스트립을 옮기고 세척 단계를 반복하십시오.그 후, 효소가 포함된 2.5 milliliters의 저칼슘 마그네슘 Tyrode 용액이 들어 있는 큰 라운드 바텀 튜브로 스트립을 옮깁니다. 5분마다 튜브를 부드럽게 돌려 혼합합니다. 효소 소화가 끝나면, 끝을 불로 매끄럽게 다듬은 좁은 피펫을 사용하여 조직 스트립을 수정된 KB 용액이 들어 있는 세 개의 작은 라운드 바텀 튜브 중 첫 번째 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.그런 다음 두 번째와 세 번째 소형 라운드 바텀 튜브로 스트립을 옮겨 조직을 세척한 후, KB 용액이 담긴 대형 라운드 바텀 튜브로 옮깁니다. 더 큰 화염 연마 피펫을 사용하여 대형 라운드 바텀 튜브 내의 세포를 지속적으로 트리튜레이션하여 해리시킵니다. 이때 해리 튜브가 35 °C 항온수조에 잠겨 있도록 주의하고 용액에 기포가 유입되지 않도록 합니다. 초당 약 1회 또는 1 Hz의 빈도로 용액을 강하게 배출하는 방식이 가장 효과적인 것으로 확인되었습니다.이제 조직에 염화나트륨 염화칼슘 적응액 75 µL를 첨가합니다. 부드럽게 흔들어 섞어준 후 5분 동안 배양합니다. 서면 프로토콜에 명시된 대로 칼슘을 단계적으로 계속 첨가하십시오.칼슘 재적응 후, 세포를 약 10분 동안 가라앉히거나 2,000 ×g에서 3분간 원심분리하여 동방결절 심근세포를 수집합니다. 급성으로 분리된 세포의 경우, 트랜스퍼 피펫을 사용하여 상층액 약 5 mL를 조심스럽게 제거하고 버립니다. 그 후 패치 클램프 실험을 위해 세포를 실온에서 최대 8시간 동안 보관합니다.그 후, 분리된 동방결절 심근세포의 기능적 평가는 패치 클램프 기록법을 사용하여 자발적 활동 전위와 막 전류를 측정함으로써 수행할 수 있습니다. 자발적으로 활성화된 동방결절 심근세포는 최대 6일 동안 배양 상태로 유지될 수 있습니다. 배양된 세포는 급성으로 분리된 동방결절 심근세포와 매우 유사한 전반적인 형태를 유지하며, 급성 분리 세포와 비교했을 때 배양된 세포의 평균 길이, 너비, 단면적 또는 막 커패시턴스에서 유의미한 변화가 나타나지 않습니다.이 세포들은 전압 및 전류 클램프 기록과 같은 다양한 실험 연구에 적합합니다. 여기서는 예시로 자발적 활동 전위와 funny current를 보여줍니다. 동방결절의 박리, 분리 및 칼슘 재도입 과정을 숙달하면 약 2시간 만에 완료할 수 있어, 실험에 즉시 사용할 수 있는 세포를 준비할 수 있습니다.본 절차를 수행할 때, 정교한 박리를 위해서는 조직의 방향 설정이 매우 중요하며, 효소 및 기계적 해리 단계는 본문에 설명된 대로 최적화해야 한다는 점을 유념하십시오. 본 절차를 통해 분리된 동방결절 심근세포는 단일 세포 전기생리학, 칼슘 이미징 및 면역세포화학을 포함한 다양한 실험에 사용할 수 있습니다. 또한, 유전자 조작이나 리포터 분자의 발현이 필요한 실험을 위해 세포를 배양하여 유지할 수 있습니다.이 영상을 시청하신 후, 성체 마우스에서 동방결절 심근세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하셨기를 바랍니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 기원합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 쥐의 심장에서 동방결절 또는 SAN을 분리하는 절차를 보여줍니다. SAN은 자발적인 활동 전위를 생성하여 심장 박동을 시작하는 동방 세포를 수용합니다.

마우스 모델에서 동방결절 분리: 쥐 심장에서 SA 결절을 채취하는 절차

여기서 우리는 랑겐 관류 시스템을 사용하여 성인 마우스 된 심근의 분리에 대해 설명합니다. 얻어진 세포 + 내성 전기적 무부하 외 Ca2이며 배양 및 아데노 - 또는 유전자 발현을 조작하기 lentiviruses로 형질 감염 될 수있다. 그 기능 또한 MMSYS 시스템 및 패치 클램프 기술을 이용하여 분석 될 수있다.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

우리는 성인 마우스 심근의 분리를 위해 신뢰할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 변형 마우스의 다양한 기능에서 성인 심근의 문화에 대한 일관성있는 결과를 얻을 수 있습니다.

분리 및 문화 성인 마우스 세포 신호 전달 용의 Cardiomyocytes과의<em&gt; 시험관</em&gt; 심장 비대

이 프로토콜은 높은 수율, 순도 및 생존력을 가진 성체 마우스 심근세포의 재현 가능한 분리 및 장기 배양을 위한 단계별 방법을 설명합니다.

격리, 문화 및 성인 마우스 심근 세포의 형질 도입

이 프로토콜은 청크 소화 접근법을 사용하여 성인 마우스 심장으로부터 단일 심방 심근세포를 분리하는 데 사용됩니다. 이 접근법은 패치 클램프 연구에서 심방 근세포 전기 생리학을 특성화하는 데 사용할 수 있는 우측 또는 좌심방 근세포를 분리하는 데 사용됩니다.

성인 마우스에서 심방 근세포의 격리

여기서, 우리는 성인 마우스와 쥐 심근세포의 격리, 형질 전환 및 장기 문화에 대한 프로토콜을 제시합니다.

성인 마우스및 쥐 심근세포의 격리, 트랜스페션 및 장기 문화

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

우리는 선행 관류 기술에 의해 고품질의 개별 마우스 심장 세포를 격리하기위한 simple 방법을 개발했습니다. 이 방법은 Langendorff가 없으며 심실 및 심방 심근 세포 또는 심장 섬유아세포 또는 선조와 같은 간질 세포를 분리하는 데 유용합니다.

마우스에서 심근세포 절연을 위한 영양 관류 방법

마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

여기에 제시된 프로토콜은 마우스 심장의 동방 결절 (SAN) 및 방실 결절 (AVN) 영역으로부터 심장 상주 대 식세포를 분리하기위한 단계별 접근법을 제공한다.

쥐 동방과 방실 결절에서 상주 심장 대 식세포의 분리 및 배양

이 프로토콜은 성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를 위한 대동맥 통조림의 깊이를 포함하는 Langendorff 방법의 변형을 설명합니다.

성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를위한 랑엔도르프 방법의 수정

배우세요 성인 마우스에서 동방 결절 심근 세포를 분리하고 배양하는 방법을. 심장 박동 조절 메커니즘과 이온 전류 연구에 활용할 수 있는 기능적 특성 분석 기술을 익히세요.

성인 마우스에서 동방 노드 근육 세포의 분리, 문화 및 기능 특성화하는 방법

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