성인 마우스에서 동방 노드 근육 세포의 분리, 문화 및 기능 특성화하는 방법

이 절차의 전반적인 목표는 단기 또는 중기 전기생리학 또는 이미징 실험을 위해 마우스에서 자발적으로 활성화된 동방결절 근세포를 분리하는 것입니다. 고립된 동방결절 근세포는 심장 박동 메커니즘 연구, 특히 특정 이온 전류 또는 세포 내 칼슘 방출 타이밍에 대한 연구에 중요합니다. 그러나 상대적으로 소수의 실험실에서 쥐의 분리된 동방근세포를 사용하는 이유는 문서화된 방법만으로는 절차를 배우기가 매우 어렵기 때문입니다.

격리에 필요한 모든 용액을 준비한 후 가위로 동물의 가슴에서 털을 제거하십시오. 그런 다음 외부 조직 집게와 해부 가위를 사용하여 흉강을 노출시키기 위해 흉곽을 절제합니다. 헤파린이 함유된 데운 티로드 2밀리리터로 흉강을 헹굽니다.

해부 현미경으로 내부 가위와 해부 집게를 사용하여 폐와 흉선을 조심스럽게 제거합니다. 심장의 정점을 부드럽게 잡으면서 하대정맥과 대동맥을 조심스럽게 절개하여 흉강에서 심장을 제거합니다. 그런 다음 심장을 실리콘 해부 접시 중 하나로 옮긴 다음 2-4밀리리터의 데운 헤파린화된 완전한 Tyrode's로 헹굽니다.

후방 혈관이 보이고 위를 향하도록 심장의 방향을 잡습니다. 다음으로, 심장을 정점을 통해 실리콘 해부 접시에 고정하여 심장을 고정시킵니다. 그런 다음 심실과 심방 사이의 홈을 찾습니다.

내부 박리 가위를 사용하여 심실 가까이에 유지하면서 홈을 절개합니다. 심방과 판막을 명확하게 볼 수 있도록 필요에 따라 추가로 데워지고 헤파린화된 완전한 Tyrode's로 홈과 절개 부위를 씻어냅니다. 그런 다음 홈을 따라 계속 절단하여 심실에서 심방을 분리합니다.

그런 다음 심방 조직을 두 번째 실리콘 해부 접시로 옮기고 3ml의 데운 헤파린 처리된 완전한 Tyrode로 헹굽니다. 그런 다음 제제를 부드럽게 늘리면서 조직을 하대정맥에 고정합니다. 그런 다음 조직을 뒤집어 동물의 오른쪽 심방이 실험자의 왼쪽에 있고 왼쪽 심방이 실험자의 오른쪽에 있도록 합니다.

올바른 조직을 분리하기 위해 방향을 얻고 인식하는 것이 매우 중요합니다. 상대정맥을 통해 조직을 고정한 다음 오른쪽 및 왼쪽 심방 부속기를 통해 조직을 고정합니다. 제제를 명확하게 볼 수 있도록 남아 있는 지방이나 기타 조직을 제거하십시오.

그런 다음 대정맥 강을 절단하여 심방의 전벽을 엽니다. 필요에 따라 접시를 회전시켜 상대정맥과 하대정맥을 모두 해부합니다. 심방 간 중격을 시각화하기 위해 필요에 따라 핀을 재배치합니다.

그런 다음 심방 사이 중격을 따라 절단하여 왼쪽 심방을 제거합니다. 제제를 다시 고정하고 부드럽게 늘린 다음 동방결절 뒤의 지방을 제거합니다. 그 후, 우심방 부속기를 제거한 다음 심방 부속기와 접하는 짙은 주황색 줄무늬로 나타나는 크리스타 터미널리스를 따라 절단하여 동방결절을 제거합니다.

결절 조직을 다시 고정하거나 풀고 측면으로 잘라 동일한 크기의 스트립 3개를 만듭니다. 이 절차에서는 좁은 방화 피펫을 사용하여 3개의 동방 결절 조직을 2.5ml의 저칼슘 마그네슘 Tyrode's가 들어 있는 3개의 작은 원형 바닥 튜브 중 첫 번째 튜브로 옮기고 5분 동안 배양합니다. 5분 후, 조직 스트립을 2.5ml의 저칼슘 마그네슘 Tyrode's가 들어 있는 두 번째 작은 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.

튜브를 부드럽게 휘젓거나 좁은 피펫으로 부드럽게 피펫팅하여 조직 스트립을 세척합니다. 튜브를 뒤집지 마십시오. 그런 다음 조직 스트립을 2.5ml의 저칼슘 마그네슘 Tyrode가 들어 있는 세 번째 작은 둥근 바닥 튜브로 옮기고 세척 단계를 반복합니다.

그 후, 효소가 함유된 2.5ml의 저칼슘 마그네슘 Tyrode가 들어 있는 큰 둥근 바닥 튜브로 스트립을 옮깁니다. 튜브를 부드럽게 휘젓아 5분마다 섞습니다. 효소 분해 후, 좁은 화염 광택 피펫을 사용하여 조직 스트립을 변형된 KB 용액이 들어 있는 세 개의 작은 둥근 바닥 튜브 중 첫 번째 튜브로 부드럽게 옮깁니다.

그런 다음 KB 용액이 들어 있는 큰 둥근 바닥 튜브로 옮기기 전에 두 번째 및 세 번째 작은 둥근 바닥 튜브를 통해 스트립을 옮겨 조직을 씻습니다. 더 큰 화염 광택 피펫을 사용하여 지속적인 분쇄에 의해 큰 둥근 바닥 튜브의 세포를 해리하고 해리 튜브가 섭씨 35도의 수조에 잠긴 상태를 유지하고 용액에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 우리는 대략 초당 1 또는 1 헤르츠의 주파수에서 용액을 강제로 배출하는 것이 가장 효과적이라는 것을 발견했습니다.

이제 75 마이크로 리터의 염화나트륨 염화칼슘 적응 용액을 조직에 첨가하십시오. 부드럽게 휘저어 섞고 5분 동안 배양합니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 칼슘을 점진적으로 계속 추가하십시오.

칼슘 재적응 후, 약 10분 동안 침전시키거나 3분 동안 2, 000회 g에서 원심분리하여 중심방 근세포를 수집합니다. 급성으로 분리된 세포의 경우, 전사 피펫을 사용하여 약 5ml의 상층액을 부드럽게 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 패치 클램프 실험을 위해 셀을 최대 8시간 동안 실온에서 보관합니다.

그 후, 고립된 동방 근세포의 기능 평가는 자발적 활동 전위 및 막 전류에 대한 패치 클램프 기록을 사용하여 수행할 수 있습니다. 자발적으로 활성화된 동방근세포는 최대 6일 동안 배양에서 유지될 수 있습니다. 배양된 세포는 급성으로 분리된 세포와 비교하여 배양된 세포의 평균 길이, 너비, 단면적 또는 막 용량에 큰 변화가 없이 급성 고립된 동방 근세포와 매우 유사한 전체 형태를 유지합니다.

이 셀은 전류 및 전압 클램프 기록과 같은 다양한 실험 연구에 적합합니다. 여기에 예시로 표시된 것은 자발적인 활동 전위와 재미있는 전류입니다. 일단 숙달되면 동방결절 절제, 분리 및 칼슘 재주입을 약 2시간 만에 완료할 수 있으므로 실험을 위해 세포를 준비할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 조직의 방향이 좋은 해부를 위해 매우 중요하며 텍스트에 설명된 대로 효소 및 기계적 해리 단계를 최적화해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 분리된 동방결절 근세포는 단세포 전기생리학, 칼슘 이미징 및 면역세포화학을 포함한 다양한 실험에 사용할 수 있습니다. 세포는 또한 유전자 조작 또는 리포터 분자의 발현이 필요한 실험을 위해 배양에서 유지될 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 성체 마우스에서 동방 근세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 실험에 행운을 빕니다.