Name: HIV-1 감염 라이브 차 인간 대 식세포에서 측정 Phagosome 마이그레이션 및 속도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 학습하세요 HIV-1 감염 대식세포에서 파고솜 이동 속도를 측정하는 방법을. 스피닝 디스크 공초점 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 내 파고솜의 이동을 추적하고 정량화합니다.

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원고를 읽어주신 Jamil Jubrail 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 CNRS, Inserm, Université Paris Descartes, Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 GLB 박사 펠로우십 포함) 및 Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS, CD에 대한 박사 후 펠로우십 포함)의 보조금으로 지원되었습니다. A. Dumas는 Université Paris Descartes와 Sidaction의 박사 펠로우십의 지원을 받았습니다.

이 프로토콜은 국내 및 국제 법규 및 지역 규정에 엄격한에 따라 수행되어야한다. 연구 목적으로 혈액을 기증 동의를 준 건강한 기증자로부터 혈액이 기관이 계약을 체결 한있는 수혈 센터에서 얻을 수있다. 인간의 혈액을 사용하는 경우 특별 보호는주의해야합니다. HIV-1과 실험은 3 또는 2 (BSL-3 또는 2) 연구소는 현지 법률에 따라 바이오 안전성 수준에서 수행해야합니다. 접착에 의한 밀도 구배 원심 분리 및 선택에 의해 인간 단핵구 유래 대 식세포 (hMDMs) 1. 준비 <ol><li> 건강한 기증자 (9 ㎖)에서 신선한 혈액으로 시작합니다. 70 ml의 최종 용적을 수득 칼슘 및 마그네슘 2+없이 멸균 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)와 신선한 혈액의 전체 부피를 희석하고 부드럽게 개의 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 희석 된 혈액을 추가 (튜브 당 35 mL) 중 , 15 ml의 상단에eutral가 높은 각 튜브 이미 용액에 높은 질량 친수성 ​​다당류 지형. </li><li> 브레이크없이 20 ° C에서 20 분 동안 537 XG에 혈액을 원심 분리기는 모두 튜브. 그런 계면 흐린 셀 링에 포함 된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수집하고 칼슘 및 마그네슘 2+없이 1X PBS 15 ml를 함유하는 새로운 50 ㎖ 튜브로 옮긴다. </li><li> 원심 분리기 20 ° C에서 5 분 동안 218 XG에 세포와 칼슘 및 마그네슘없이 1X PBS 45 ml의에서 펠렛을 재현 탁 2+. </li><li> 원심 분리는 20 ℃에서 5 분 동안 218 XG에서 세포는 칼슘 및 마그네슘 2+없이 1X PBS 10ml에 펠렛을 재현 탁하고 트리 판 블루에 1/200의 최종 희석액으로 희석하여 세포 수를 계산. </li><li> 20 ° C에서 5 분 동안 218 XG에 세포를 원심 분리기 1640 배지 2 mM의 L- 글루타민 및 100 μg의 / ㎖로 보충 된 RPMI penic (로스웰 파크 메모리얼 연구소)에 펠렛을 재현 탁illin - 스트렙토 6 웰 - 플레이트의 각 웰에서 배지 2 ㎖에 웰 당 7 × 106 PBMC를가하도록. </li><li> 2 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 접시를 품어. 2 시간 후 단핵구는 플라스틱에 부착 된 것입니다. </li><li> 갓 절연 단핵구가 hMDMs로 분화 배지를 흡인하고 보충 2ml의 hMDM 배지 (RPMI 1640, 태아 송아지 혈청 (FCS를 decomplemented 10 %), 2 mM L- 글루타민, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신)로 교체 할 수 있도록하려면 재조합 인간 대 식세포 콜로니 자극 인자 10 ng를 / ml의 최종 농도 (RHM-CSF). </li><li> 십일일 (그림 1)에 대한 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 하루에 11에서 매체를 제거하고 잘 따라 차가운 hMDM 매체의 2 ㎖로 2 회 씻는다. 다음 차가운 1X PBS 1 ml의 각 웰을 2 회 반복한다. </li><li> (2 mM의 ethylenediaminetetraacetatic 산 차가운 1X PBS 1 ml의 각 웰에 1 시간을 씻어 완전히 차별화 된 hMDMs를 분리하려면EDTA) 및 4 ℃에서 15 내지 60 분 동안 잘 당 2 mM의 EDTA와 차가운 1X PBS 2 ㎖에 세포를 배양한다. 참고 : 세포가 존재 분리하는 다른 방법 (예를 들면, 트립신 또는 트립신 같은 활동) 좋은 결과 (11)을 줄 수 있습니다. </li><li> (상하 웰 부드럽게 피펫 완료) 분리 후, 세포를 수집하고 차가운 hMDM 배지 10 ㎖를 함유하는 얼음에 50 ㎖ 튜브에 넣어. </li><li> 원심 분리는 20 ℃에서 5 분 동안 218 XG에 세포를 차가운 hMDM 배지 10ml에 펠렛을 재현 탁하고 트리 판 블루로 1/20 희석하여 세포 수를 계산. </li><li> 35mm 현미경 수준의 유리 바닥 접시 당 1 × 10 6 hMDMs에서 세포를 시드 및 1 일 5 % CO 2와 37 ° C에서 접시를 품어. </li></ol> HIV-1 바이러스 성 주식의 2. 생산 및 정량화 참고 : NLR4.3 HIV-1 개그 - iGFP (녹색 형광 단백질) M. Schindl에서 R5-열대 봉투, 선물을 들고ER 10 마크로파지를 감염 실시간으로 감염된 세포를 참조하는 데 사용된다. <ol><li> 상업 형질 전환 시약을 사용하여 해당 프로 바이러스 DNA의 6 μg의 인간 배아 신장 293T 세포 (2 × 106에서 100mm 요리)의 형질 전환에 의해 바이러스 주식을 생성합니다. </li><li> 세포 및 계수의 베타 갈 락토시다 착색 이어 바이러스 주식의 희석액을 사용하여 (HIV-1 LTR의 제어하에 베타 갈 락토시다 제 유전자를 함유) 헬라 TZM-BL 인디케이터 세포를 사용하여 바이러스 주식의 감염성 정량화 의 파란색 셀 (12)는. </li></ol> HIV-1 hMDMs 3. 감염 <ol><li> hMDMs (1.13 도금 세포)에 감염 (MOI)의 다양성에 hMDM 매체의 0.02-0.03 1 ml에 바이러스를 추가합니다. 우물 hMDM 매체의 1ml를 추가 제어하고 이일 (그림 1)에 대한 5 % CO 2와 37 ° C에서 요리를 부화합니다. </li><li> 하루에 2 hMDM 의대로 세포를 씻어3 회 IUM과 접시 당 신선한 hMDM 매체의 1ml를 추가합니다. 육일 (그림 1)에 대한 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어. </li></ol> 양 적혈구 4. 옵 소닌 <ol><li> 접시 당 7 × 106 SRBCs의 제조를위한 4 분 동안 600 × g으로 원심 분리로 1X PBS에 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 용액 100 ㎕에 SRBCs 두 번 세척 하였다. </li><li> SRBCs 5 μL 당 서브 응집 농도 토끼 IgG 형 SRBCs와 PBS / 0.1 % BSA 500 ㎕의 1X에서 세정 SRBCs을 재현 탁하고 실온에서 30 분 동안 회전 배양한다. 주 : 안티 SRBCs의 IgG 서브 응집 농도를 측정 96 웰 플레이트에 20 ㎕의 1 / 25,600로 1/50에서 (13.1 ㎎ / ㎖ 농도에서 스톡)의 IgG의 희석액을 제조 하였다. 각 웰에 20 μl를 2 × 10 6 SRBCs을 추가하고 몇 시간 동안 어두운 방에서 접시를 넣어. 서브 응집 농도 인직전 잘 응집 (IgG를 + SRBCs 네트워크를 형성)로 잘 희석. </li><li> 회전 후 4 분 동안 600 XG에서의 IgG-옵 소닌 - SRBCs을 원심 분리하고 4 분 동안 600 XG에서 원심 분리하여 1X PBS / BSA 0.1 % 100 ㎕로 씻는다. </li><li> 2 mM의 L- 글루타민 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (1 ㎖ / 접시)이 보충 된 예비 가온 된 페놀 레드없는 RPMI 배지에서의 IgG - 옵 소닌-SRBCs를 재현 탁. </li></ol> 5. 라이브 셀 비디오 현미경 탐식의 분석 <ol><li> 이러한 CO 2의 가습을위한 물이 병을 통과하여 37 ℃의 가열 챔버를 구비 한 회전 디스크 시스템과 같은 촛점 이미징 시스템을 사용한다. </li><li> 식세포 분석의 시작 전에 37 ℃에서 현미경 스테이지를 가지고 실험 전에 가열 실 켜기. 현미경과 컴퓨터를 켜고, 및 이미징 소프트웨어를로드합니다. </li><li> 이러한 주사 속도 MAGNIFICAT로서 촬상 설정을 최적화이온, 해상도 등은 60 ~ 120 분 사이에 매 분마다 필드 당 이미지 한 프레임에 적어도 하나의 셀을 가지고 있습니다. 참고 : 여기에, 샘플 63X 렌즈와 함께 60 분 동안 하나의 프레임 분마다 이미징된다. </li><li> 현미경 무대에 영상 접시를 놓습니다. 초점을 조정하고 위치는 필드에 하나의 전체 HIV-1에 감염된 대 식세포를 찾을 수 있습니다. 사용 된 영상 시스템 및 프로브에 따라 적합한 여기 / 방출 설정을 사용합니다. phagosomes을 관찰 밝은 필드 (BF) 채널을 포함합니다 (그림 1II). 투과광 노광 시간의 비율을 조정함으로써, 상이한 채널 이미지의 모양을 최적화한다. 참고 : 여기에, NLR4.3 HIV-1 개그 - iGFP 레이저의 20 % (그림 1I)와 노출 시간의 50 밀리 초와 491 nm의 레이저를 사용하여 흥분했다. </li><li> 이미징 접시를 제거하고 접시에 7 × 10 6 SRBCs / ㎖ (그림 1)에서 SRBC 현탁액 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 500 XG에 원심 분리기RT에서 2 분, 식균 작용이 동기화 원심의 끝 시간을 기록하고, 상기 스테이지에 접시를 반환한다. </li><li> 적어도 1 시간 동안 매분 - (통상 20 평면 0.3 ㎛의 스텝 거리, 셀의 두께에 걸쳐) Z-스택의 초점 캡처 GFP 및 BF 이미지를 최적화한다. 사용 된 영상 시스템의 기본 파일 형식으로 시간 경과 비디오를 저장합니다. 참고 : 여기에, 시간 경과 영화가 네이티브 형식으로 저장된 * .stk 파일. </li></ol> 시간 경과 영화 6. 분석 <ol><li> 비디오 편집 메뉴 &#39;앱&#39;다운 비디오 편집 소프트웨어의 탭에 &quot;검토 다중 차원 데이터&quot;에 드롭을 클릭합니다. <ol><li> 파일을 열려면 다음 &quot;디렉토리 선택&quot;에서 &quot;선택 자료 파일&quot;을 클릭합니다. &quot;데이터가 설정&quot;상자에서 (.nd 형식)을 분석하고 &#39;보기&#39;를 클릭 인수를 선택합니다. 데이터는 열 경시 표로 표현라인에서 D의 Z-계획. </li><li> A ~ Z 프로젝션 (그림 2, 왼쪽 패널)에 감염을 표현하려면 &quot;파장&quot;상자에 491 nm 파장을 선택하고 &quot;모든면&quot;와 &quot;Z 투사&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> (시간 순서 분석은 &quot;파장&quot;상자에 BF 파장을 선택하고 외부 SRBCs (그림 2, 빨간색 화살표), 내부 SRBCs (그림 2, 빨간색 원)과 핵을 구별하기 위해 Z 축에 최적의 평면을 선택합니다 그림 2, 파란색 원). </li><li> 비디오 몽타주을 저장하려면, &quot;선택 [X]의&quot;탭을 누른 다음 &quot;로드 이미지 (들)&quot;을 클릭합니다. 마지막으로,이 .tif 형식으로로드 된 이미지를 저장하고 ImageJ에 소프트웨어에 다음을 엽니 다. </li></ol></li><li> 핵의 위치와 BF 채널에서 관찰 된 다른 phagosomes (그림 3)을 측정하기 위해 ImageJ에 소프트웨어를 플러그인 &quot;수동 추적&quot;를 사용합니다. <ol><li> 다우ImageJ에 웹 사이트의 &quot;수동 추적&quot;플러그인을 nload. ImageJ에에서 (그림 3, 1 단계 및 2) 플러그인 및 이미지 시퀀스를 분석 할 엽니 다. </li><li> 이러한 인접 프레임 사이의 시간의 양을 나타낸다 &quot;시간 간격&quot;, 픽셀 당 거리를 나타내는 &quot;X / Y 보정&quot;(그림 3, 3 단계)로 설정을 입력합니다. 주 : 63X 크게하고 6.45 X 6.45 μm의 (2)의 화소 크기를 갖는 카메라를 사용하기 때문에 여기서, 각 프레임 및 0.205 ㎛, X / Y의 교정과 1 분의 시간 간격으로 화상 시퀀스를 저장한다. </li><li> 추적을 시작하려면 (그림 3, 4 단계) &quot;트랙 추가&quot;를 클릭하고이 내면화 될 때 제 시간에 SRBC 센터를 클릭합니다. 다음 프레임이 자동으로 나타납니다. </li><li> 시간 동안 다른 위치 (그림 3, 빨간색 상자에 6 단계)가 모든 프레임에서 SRBC 센터를 클릭하여 계속합니다. <ol><li> 그 중심을 클릭하여 모든 프레임에서의 위치를​​ 가지고 핵을 추적하기 시작합니다. 다음 시간 SRBCs의 기능에서 다른 자신의 내면화의 (프레임)에서 하나 하나 (중심을 클릭하여) phagosomes를 추적 할 수 있습니다. 편의 BF 채널에 SRBC를 참조하려면, 추적 (그림 3, 5 단계) 동안 &quot;밝기 및 명암 대비&quot;창을 사용합니다. </li></ol></li><li> 각 SRBC 추적 사이에 새로운 트랙을 가지고 (그림 3, 4 단계) &quot;트랙 추가&quot;를 클릭합니다. 추적의 수는 두 번째 열에서 변경되며, 그 결과 테이블의 &quot;트랙 N °&quot;(도 3, 단계 6). </li><li> 분석의 다음 단계를 계속하기 위해 스프레드 시트의 데이터를 저장합니다. </li></ol></li><li> (핵 및 SRBCs의 국제화 후 첫 5 분 동안 phagosomes의 속도를 향해 SRBCs를 포함하는 phagosomes의 이동 거리를 계산하기 위해 인터넷을 스프레드 시트 소프트웨어를 사용하여gure 4). <ol><li> 스프레드 시트 테이블과 새 스프레드 시트 파일을 엽니 다. 이 새로운 다음 매개 변수 전용 파일, 시간, x 축에 전송하고 핵 및 모든 SRBCs (그림 4A)의 좌표 Y-. </li><li> , 그들의 좌표 SRBCs과 핵 사이의 거리를 계산 XY 좌표 평면 (그림 4B)에서 핵 및 SRBC을 고려합니다. 주 : 두 점 사이의 거리를 연결 경로의 길이이다. 평면에서 SRBC과 핵 사이의 거리는 피타고라스의 정리에 의해 주어진다. <ol><li> C (핵과 SRBC 사이의 거리) 및 빗변의 길이를 나타내고, (B) 다른 두 변의 길이를 나타내는 경우, 피타고라스 식은 피타고라스 정리를 표현 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq1.jpg" /> 주 : 동시에, 직교에서 수평 거리A는 (X 핵 -x SRBC)는 수직 거리 (B)는 (SRBC -y Y 핵)이다. </li><li> 따라서, 핵 및 SRBC (도 4a, 퍼플 박스)에 의해 사이의 거리를 계산한다 : <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq2.jpg" /> 주 : μm의의 거리를 갖고, X / Y 교정하여 픽셀 단위로 획득 된 거리 값을 곱한다. 여기서, X / Y의 교정은 0.205 μm의 것이다. </li><li> 각 시간에서, 핵 초기 위치 (도 4C)에 SRBC 사이의 거리를 뺀다. </li><li> 처음 5 분 동안 측정 시간에 대하여 플롯. 플롯에 선형 트렌드 라인 (그림 5A)를 적용하고 SRBC 국제화 후 첫 5 분 동안 핵을 향해 phagosome 속도를 나타내는 선형 트렌드 라인의 기울기를 결정한다. </li><li> 평균 오차 통계를 계산하는 데이터를 대조속도 값을 적절한 소프트웨어 (도 5B)를 사용하여 적절한 형태로 이들을 플롯 및. </li></ol></li></ol></li></ol>

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이 기술은 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 감염의 백분율 도너 의존하기 때문에 우선, HIV-1에 의한 hMDMs의 제조 및 감염은 매우 중요하다. 잠재적으로 생체 내에서 바이러스에 의해 발생하는 대 식세포의 상태가 아니라 지금까지 특징되지 않았기 때문에 참고로, 우리는 이전에 감염 체외에서 편광되지 않은 대 식세포를 사용하기로 결정했습니다. 우리는 대 식세포는도없고 M1 M2임을 나타내는 여러 표면 마커의 발현을 확인하고, CD4 및 CCR5의 발현을 확인 하였다. 감염 속도는 변수이며, 10 ~ 40 %, 그리고 때로는 이하로 다양합니다. 이 현미경 하에서 HIV-1 감염의 형광 hMDM를 찾는 것은 어려울 수있다 이유 가변 감염률이다. 또한, 원심 분리 공정 후에 즉시 HIV-1 감염 세포를 발견하는 데 필요한 시간도 취득 개시까지의 지연을 초래할 수있다. 식균 작용은 synchronizatio없이 개시 될 수있다바인딩 및 원심 분리에 의해 생성 된 흡수 n은. 그러나이 옵션은 세포에 도...

대식세포는 선천면역계와 항상성에 중요한 역할을 합니다. 이들은 식세포작용(phagocytosis) 1,2라는 과정을 통해 병원균과 파편을 내부화하고 제거하는 전문적인 식세포입니다. 미립자 물질이 삼켜진 후 형성되는 닫힌 구획인 phagosome은 내세포 구획과 함께 일련의 융합 및 분열 사건을 겪어 phagolysosome이라고 하는 분해 구획으로 이어집니다. 이 구획은 양성자 펌핑 v-ATPase의 획득으로 인해 산성 pH를 가지며 가수분해 효소를 포함하며 리소좀 관련 막 단백질(LAMP)이 풍부합니다. 식체(phagosome)의 성숙은 미세소관 3,4를 통해 세포 중심을 향하여 리소좀(lysosome)이 축적되는 핵주위 위치에 도달하는 이동을 동반합니다.
많은 병원체가 식체체 성숙을 가로채는 것으로 보고되었으며, 여기에는 자신이 서식하는 액포 환경을 변형시키는 세포 내 생활 방식을 가진 박테리아가 포함됩니다 5. 인체 면역결핍 바이러스(HIV)-1은 T 세포 외에도 대식세포를 표적으로 합니다. 대식세포는 T 세포와 달리 바이러스의 세포병성 영향에 내성이 있기 때문에 바이러스의 저장소로 간주될 수 있습니다. 또한 HIV-1에 감염된 대식세포는 식세포 기능에 결함이 있어 기회감염성 질환의 발병에 기여합니다. 특히, Salmonella Typhimurium ST313에 의해 유발되는 중증 침습성 비장티푸스성 살모넬라균 질환은 지난 30년 동안 HIV 6에 감염된 사하라 사막 이남 아프리카 아동 또는 성인에서 널리 퍼져 있습니다. HIV에 감염된 사람이 HIV에 감염되지 않은 사람보다 결핵에 걸릴 위험이 20배 이상 더 높은 것으로 추산됩니다. 
이러한 모든 이유로, HIV에 감염된 대식세포의 식세포 결함의 기저에 있는 분자 메커니즘을 더 잘 정의하는 것이 중요합니다. 우리는 HIV에 감염된 대식세포에서 미립자 물질, 옵소니화된 입자, 박테리아 또는 곰팡이의 흡수가 억제된다는 것을 보여주었다 7. 이러한 억제가 부분적이라는 점을 감안하여, 우리는 HIV에 감염된 인간 대식세포에서 내재화된 식체(phagosome)의 운명을 분석하기 시작했다 8. phagosome maturation은 cell center로의 이동 및 lysosome과의 융합과 밀접하게 연결되어 있기 때문에 phagosomal maturation의 결함은 감염된 세포의 trafficking modality의 변형으로 인한 것일 수 있습니다. 여기에 설명된 방법은 IgG-SRBC(IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells)를 수용체 매개 식세포작용, 특히 면역글로불린(FcR)의 Fc 부분에 대한 수용체를 표적으로 하는 모델로 사용합니다. 이러한 입자는 라텍스 비드보다 명시야(BF)에서 이미징하기가 더 쉬운데, 이는 세포외 및 세포 내 SRBC가 서로 다른 굴절 특성을 나타내기 때문입니다 9. HIV에 감염된 대식세포에서 핵을 향해 이동하는 식체의 속도를 측정하기 위해 형광 바이러스 10을 사용하고 여기에 설명된 간단한 수동 추적 방법을 설정했습니다. 이 방법은 고급 프로그래밍이 필요하지 않으며 단순히 ImageJ를 사용합니다. 부착 세포와 모든 유형의 입자 또는 병원체에 적용할 수 있으며, 명시야 현미경 또는 형광 이미징으로 시각화할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Falcon 100mm TC 처리 세포 배양 접시</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>바이러스 생산용</td></tr><tr><td>유리 바닥 접시 35mm 코팅되지 않은 1.5</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>케이스 인수용</td></tr><tr><td>Falcon 조직 배양 플레이트 6-well</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Corning. Inc. 353934</td><td>인간 단핵구 유래 대식세포용</td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque PLUS</td><td>Dominique Dutscher</td><td>17-1440-03</td><td>밀도 원심분리를 위한 용액 내 중성, 고도로 분지화, 고질량, 친수성 다당류</td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘</td><td>없음 Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td>RT</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose)</td><td>GIBCO, Molecular probes</td><td>31966-021</td><td>4°C에서 보존; C ; HEK 세포 배양</td></tr><tr><td>RPMI 1640 배지 GLUTAMAX&nbsp; </td><td>보충 생명 기술</td><td>61870-010</td><td>4 &deg에서 보존; C; hMDM 문화</td></tr><tr><td>F&oelig; 탈 카프 세럼 (FCS)&nbsp;</td><td>유로바이오</td><td>CVFSVF0001</td><td>-20 &deg에서 보존; C ; decomplemented</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td>-20 &deg에서 보존; C ; hMDM 배양</td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체, 페놀 레드 없음 (10x 500 ml)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>Warm in 37 &deg; 사용 전 C 수조; 식세포작용 분석법:</td></tr><tr><td>FuGENE6 Transfection 시약</td><td>Promega</td><td>E2692</td>, <td>4°C 보존; C ; 바이러스 생산을 위해</td></tr><tr><td>양 적혈구 (SRBC)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>4 &deg에서 Alsever 버퍼에 보존; C 사용 전</td></tr><tr><td>안티 양 적혈구 IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>4 &deg에서 보존; C</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 열 충격 분율, pH 7, &ge; 98%&nbsp;</td><td>시그마</td><td>A7906</td><td>-20 &deg에서 보존; C</td></tr><tr><td>도립 현미경 DMI600</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Spinning Disk Unit&nbsp; CSU-X1M1</td>, <td>요코가와</td><td></td><td></td></tr><tr><td>491 nm, 50 mW, 레이저</td><td>, COBOLT, CALYPSO,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX, PL, APO, CS, Objectif</td>, <td>Leica</td><td></td>, <td>객관렌즈 ; 배율 100X ; 개구수 1.40 ; 이머젼 오일</td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 (FireWire) 카메라</td><td>포토메트릭</td><td></td>스 <td>픽셀 크기 6.45 &마이크로; m x 6.45 &마이크로; m ; 정의 1,392 x 1,040 ; 14비트</td></tr><tr><td>Metamorph 7.7.5 소프트웨어로</td> 이미지 인코딩 <td>분자 장치</td><td></td><td>현미경 제어용</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>통계 분석용</td></tr></tbody></table>

hiv-1 감염 라이브 차 인간 대 식세포에서 측정 phagosome 마이그레이션 및 속도

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

대식세포는 선천면역과 특이면역 사이의 교차로에서 중요한 역할을 하는 식세포세포입니다. 이들은 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-1에 감염될 수 있으며, 세포병성 영향에 대한 내성 때문에 지속적인 바이러스 저장소로 간주될 수 있습니다. 또한 HIV에 감염된 대식세포는 기회감염성 질환의 발병에 기여하는 결함 있는 기능을 보인다.
HIV-1이 대식세포의 식세포 반응을 손상시키는 정확한 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. 우리는 이전에 대식세포가 HIV-1에 감염되었을 때 다양한 미립자 물질의 흡수가 억제된다는 것을 보여주었습니다. 이 억제는 부분적일 뿐이었고 HIV에 감염된 대식세포 내에서 식체가 형성되었습니다. 따라서 우리는 이러한 식체의 운명을 분석하는 데 집중했습니다. 식생체 성숙은 이러한 구획이 세포 중심을 향한 이동을 동반하며, 여기서 리소좀과 융합하여 섭취된 물질의 분해를 담당하는 식작용소체를 생성합니다. 우리는 IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells를 식세포작용의 표적으로 사용했습니다. 개별 HIV에 감염된 대식세포에서 식체의 구심 이동 속도를 측정하기 위해 명시야와 형광 컨포칼 현미경을 조합하여 사용했습니다. 우리는 핵을 향한 식체의 거리를 계산한 다음 식체의 속도를 계산하는 방법을 확립했습니다. HIV 감염된 세포는 GFP 표현 바이러스 덕분에 확인되었지만, 이 방법은 감염되지 않은 세포 또는 모든 유형의 감염 또는 치료에 적용할 수 있습니다.

HIV-1 감염과 감염되지 않은 hMDMs 의해 식세포 작용의 FcR 매개 초상권 타겟으로의 IgG - 옵 소닌 SRBCs (도 1)를 사용하여 여기에서 설명된다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 hMDMs의 준비 및 HIV-1 감염이다. 실제로, 차별화 된 대 식세포의 수율과 품질은 도너 사이 변화뿐만 아니라 10~40% 범위의 효율성과 감염율. 또한, IgG의-옵 소닌 - SRBCs의 준비는 이것이 그들의 인식을 유도하고 파편으로 대신 FcRγ 쇄 매개 식균 작용에 의해 통풍 관 수 있기 때문에, 적혈구의 손상을 방지하는 것이 중요하다. 최적의 옵 소닌은 효율적으로 식균 작용을 보장합니다. HIV에 감염된 대 식세포 거주 Phagosome 운동은 BSL -3- 실험실 회전 디스크 공 초점 현미경에 BF 채널을 실시간으로 분석한다....

우리는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 1형에 감염되거나 감염되지 않은 살아있는 세포에서 세포 중심을 향해 이동하는 식체체의 속도를 측정하는 방법을 설명하며, 회전 디스크 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 형광 감염 세포를 식별하고 명시야 현미경을 사용하여 식체를 검출합니다.

HIV-1 감염 라이브 차 인간 대 식세포에서 측정 Phagosome 마이그레이션 및 속도

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

본 분석의 전반적인 목적은 간단한 수동 추적 방법을 사용하여 HIV-1에 감염된 대식세포 내 파고솜의 속도를 정량화하는 것입니다. 이 프로토콜의 장점은 이동하거나 변형될 수 있는 세포 내 객체 그룹의 상대적 움직임을 계산하는 쉬운 방법을 제공한다는 점입니다. 이 방법은 GFP 양성 감염 대식세포 내 파고솜의 움직임에 대한 통찰을 제공하며, 형광 표지된 세포의 다른 세포 내 소기관 분석에도 활용될 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 따라 인간 단핵구 유래 대식세포를 감염시키고 양 혈액 세포를 옵소닌화한 후, 37 °C의 온도와 이산화탄소가 공급되는 가열 챔버가 장착된 스피닝 디스크 현미경과 같은 공초점 이미징 시스템을 사용하여 식세포 작용 분석을 설정하십시오. 실험 전, 가열 챔버를 켜서 현미경 스테이지의 온도를 37 °C로 가열하십시오. 그런 다음 현미경과 컴퓨터를 켜고 이미징 소프트웨어를 로드하십시오.시야당 최소 하나의 세포가 포함되도록 스캔 속도, 배율, 해상도 등의 이미지 설정값을 최적화하고, 60분에서 120분 사이의 시간 동안 1분마다 한 프레임을 촬영하도록 설정하십시오. 이미징 디쉬를 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 초점과 위치를 조절하여 시야 내에 HIV-1에 감염된 대식세포가 단 하나만 있도록 맞춥니다.사용하는 이미징 시스템과 프로브에 따라 적절한 여기 및 방출 설정을 사용하십시오. 명시야 채널을 포함하십시오. 노출 시간을 조정하여 이미지의 외관을 최적화하십시오.다음으로, 이미징 디쉬를 제거하고 0.7 × 10⁶ cells/mL 농도의 양 적혈구(SRBC) 현탁액 1 mL를 디쉬에 첨가합니다. 식세포 작용을 동기화하기 위해 실온에서 500 ×g로 2분간 원심 분리한 후, 원심 분리가 끝난 시간을 기록하고 디쉬를 다시 스테이지에 올립니다. 초점을 최적화하고 스텝 거리를 0.3 µm로 설정하여 스택의 상단과 하단을 지정합니다.세포 두께 전체에 걸쳐 GFP 및 BF 이미지의 Z-stack 획득을 시작하고, 이미지 시스템의 기본 파일 형식으로 타임랩스 비디오를 저장합니다. 비디오 편집을 수행하려면 비디오 편집 소프트웨어에서 Apps 드롭다운 메뉴를 클릭하고 Review Multidimensional Data 탭을 클릭합니다. 파일을 열려면 Select Base File을 클릭한 다음 Select Directory를 클릭합니다.데이터 세트(Data Sets) 상자에서 분석할 획득물을 선택하고 보기(View)를 클릭합니다. Z 투영(Z projection)으로 감염 상태를 나타내려면 파장(Wavelengths) 상자에서 491 nanometer 파장을 선택하고 모든 평면이 포함된 Z 투영(Z projection) 탭을 클릭합니다. 다음으로 시간 시퀀스를 분석하려면 파장(Wavelengths) 상자에서 BF 파장을 선택하고 Z축에서 외부 SRBC, 내부 SRBC 및 핵을 구별할 수 있는 최적의 평면을 선택합니다.Selection Xs 탭을 클릭한 다음 Load Images를 클릭하여 비디오 몽타주를 저장하십시오. 마지막으로, 불러온 이미지를 tif 형식으로 저장하십시오. Image J manual tracking 플러그인을 다운로드한 후, Image J에서 해당 플러그인을 열고 분석할 이미지 시퀀스를 여십시오.인접한 프레임 사이의 시간 간격을 나타내는 시간 간격(time interval) 및 픽셀당 거리를 나타내는 XY 보정(XY calibration) 등의 설정을 입력하십시오. 추적을 시작하려면 '추적 추가(Add Track)'를 클릭하고, SRBC가 처음으로 내재화되었을 때의 중심부를 클릭하십시오. 다음 프레임이 자동으로 나타납니다.편의를 위해 BF 채널에서 SRBC를 확인하려면, 추적하는 동안 밝기 및 대비 창을 사용하십시오. 시간에 따른 위치 변화를 기록하기 위해 모든 프레임에서 SRBC 중심을 계속해서 클릭하십시오. 각 SRBC 추적 사이에는 ‘End Track’을 클릭한 후 ‘Add Track’을 클릭하여 새로운 추적을 시작하십시오.결과 테이블의 두 번째 열에서 추적 번호가 변경됩니다. 이전에 수행한 것과 같이 핵의 중심을 클릭하여 모든 프레임에서 핵의 위치를 추적하기 시작하십시오. 데이터를 스프레드시트에 저장한 다음, 스프레드시트 소프트웨어에서 파일을 열어 새 스프레드시트 파일을 생성하십시오.이 새로운 파일로 시간과 SRBC 및 핵의 X, Y 좌표를 옮깁니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 SRBC를 포함하는 파고솜이 핵을 향해 이동한 거리와 SRBC 내재화 후 첫 5분 동안의 파고솜 속도를 계산합니다. 여기서는 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 살아있는 HIV 감염 대식세포 내 파고솜의 움직임을 실시간으로 분석하는 과정이 제시되어 있습니다.명시야 채널의 설정은 핵을 관찰하고 외부 SRBC와 내부로 유입된 SRBC를 구별하는 데 매우 중요합니다. 이 그래프는 SRBC가 내부로 유입된 후 첫 5분 동안 비감염 HMDM 내의 파고솜(phagosome)이 이동한 거리를 시간에 따라 나타낸 것입니다. 파고솜의 속도는 여기에 표시된 선형 회귀 곡선의 기울기입니다.마지막으로, 본 연구에서는 HIV에 감염된 HMDM의 경우 내부화 후 첫 5분 동안의 파고솜 속도가 비감염 HMDM에 비해 더 낮게 관찰되었습니다. 이러한 방법들을 통해 HIV 감염 대식세포에서는 세포 중심부로의 파고솜 이동, 즉 파고리소좀으로의 파고솜 성숙 과정이 저해되었음을 입증하였습니다. 시료를 확보한 후, 상관 전자현미경 관찰을 위해 추가 처리를 하거나, 고전적인 면역형광 현미경 관찰 및 통계 분석을 위해 전체 세포 집단을 고정할 수 있습니다.식세포 작용은 온도에 매우 민감하므로, 실험 과정 전반에 걸쳐 가열 챔버와 배양 접시 배지 내의 온도를 37°C로 일정하게 유지해야 합니다. 병원균을 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 지역 법규에 따라 생물 안전실 내 작업 및 개인 보호 장구 착용과 같은 주의 사항을 준수해야 함을 잊지 마십시오.

phagosome-migration-velocity-measured-live-primary-human-macrophages

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 시각 실험 라이브 공촛점 이미징 실험에 대한 HIV의 형광 분자 클론을 활용을위한 가이드입니다.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

phagokinetic 운동성 트랙 분석은 세포의 움직임을 평가하는 데 사용되는 방법입니다. 특히, 분석은 양적 방식으로 시간이 지남에 chemokinesis (임의의 셀 운동성)을 측정합니다. 검정은 콜로이드 골드 코팅 coverslips에 미치는 운동의 측정 트랙을 만들 수있는 세포의 능력을 활용합니다.

Phagokinetic 트랙 운동성 분석에 의한 세포 마이그레이션의 수량 평가

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

이 동영상은 골수 유래 대식세포(BMM)에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하는 분석을 보여줍니다. 대식세포 세포는 각각 리슈마니아(Leishmania)의 운동성 및 비운동성 침습 단계(motile and non-motile invasive stages), 메타고리 전구세포(metacyclic promastigotes) 및 무산소세포(amastigotes)에 감염되어 있습니다. 기생충은 대식세포에 침입하여 기생 액포(parasitophorous vacuole)로 내면화되어 내부에서 증식합니다. 세포 내 기생충 성장은 대식세포와 기생충 핵을 형광 염색할 때 현미경을 사용하여 정량화합니다.

대식세포에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하기 위한 In vitro 분석

우리는 라이브 세포 영상 현미경에 대한 방법을...

곰팡이 병원체 Phagocytosis의 라이브 셀 비디오 현미경

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

여기에서는 형광 측정 방법을 사용하여 부착 대식세포 세포주에 의한 형광 입자의 식세포작용을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 입자 내부화의 고처리량 정량화와 그에 따른 액틴 중합화를 용이하게 합니다.

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

모든 병원 성 Leishmania 종 있으며 그들의 척추 호스트의 세포 내부 복제. 여기, 선물이 Leishmania, 세포내 성장 속도의 정확한 정량화 다음으로 문화 murine 골 수 유래 세포를 감염 하는 프로토콜. 이 메서드는 호스트 병원 체 상호 작용 및 Leishmania 독성에 영향을 미치는 개별 요소를 공부 하는 데 유용.

대 식 세포 안의 세포내 성장의 정량화는 빠르고 Leishmania 기생충의 독성을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법

여기는 마우스 주민 복 막 대 식 세포에 의해 회전 디스크 confocal 현미경 이미지 단일 phagocytic 이벤트를 사용 하 여 방법에 설명 합니다. 프로토콜은 다른 phagocytic 세포를 확장할 수 있습니다.

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Leishmania 감염에서 식균작용과 관련된 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기에서, 우리는 숙주 세포와의 리슈마니아 상호작용 동안 발생하는 초기 사건을 평가하는 방법을 설명한다.

공초점 현미경을 사용하여 리슈마니아 의 식균작용 조사

학습하세요 HIV-1 감염 대식세포에서 파고솜 이동 속도를 측정하는 방법을. 스피닝 디스크 공초점 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 내 파고솜의 이동을 추적하고 정량화합니다.

HIV-1 감염 라이브 차 인간 대 식세포에서 측정 Phagosome 마이그레이션 및 속도

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