Name: CD4의 준비 + 현미경으로 GD3 및 GD2 강글 리오 시드 멤브레인 식의 분석을위한 T 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 배우세요 인간 CD4+ T 세포 표면의 GD3 및 GD2 강글리오사이드 국소화를 현미경으로 시각화하는 방법을. 소량 세포 분석이 가능한 이 기술은 T 세포 백혈병 연구와 진단에 활용될 수 있습니다.

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의견을 주신 José Luis Daniotti 박사님께 감사드립니다. 컨포칼 이미지 획득을 위해 J. Arturo Pimentel 박사와 Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM의 도움에 감사드립니다. 아이엠-디. 및 T.M.V.C.는 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C.의 157634 및 253596 보조금으로 지원되었습니다. CONACYT.로부터 장학금(245192)을 받았습니다. 또한 Red Temática Glicociencia en Salud - CONACYT(253596)의 지원에 감사드립니다.

건강한 남성 기증자로부터 말초 혈액 동의하고 센트로 드 Investigaciòn 엔 DINAMICA Celular- 대학교 자치시 델 에스 타도 데 모렐 로스의 생명 윤리위원회의 승인을 얻었다. 1. 분리 및 인간 나이브 CD4 + T 세포의 활성화 <ol><li> 동의서를 통해 건강한 인간 기증자로부터 유래 말초 혈액 2 ㎖를 수집하고 멸균 PBS-EDTA 2 ㎖로 희석 (1 배 인산염 완충 식염수 (PBS), 2 mM의 EDTA, pH를 7.4). 이전 8 설명한 바와 같이 1.077 밀도 자당 용액 3 ㎖의 상단에 천천히 희석 혈액을 추가합니다. 주 : 밀도 차이에 의한 원심 분리시 차등 마이그레이션 적혈구 침강 완전히 발생할 덜 조밀 한 단핵 세포의 층 위에 형성된다. 말초 혈액 2 ㎖를 purificati 후 약 0.5 × 106 나이브 CD4 + T 세포를 렌더링단계에. </li><li> 더 휴식 21 ° C (30mm의 고정 된 각도 둥근 바닥 튜브를 사용 로터) 250 XG에 원심 분리기 30 분 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 기울기를 생성합니다. 원심 분리 후, PBMC를 명확히 백색 링으로서 관찰 될 수있다. 피펫으로 PBMC를 수집하고 세척 멸균 튜브에 전송합니다. </li><li> 10 분 동안 250 XG에 PBS-EDTA 용액으로 세척 한 후 세 나이브 CD4 + T 세포의 정제를 진행. 정렬 방법 또는 정제 키트 여러 종류의 이러한 목적으로 사용할 수있다. 바람직하게는, 정제&gt; 1 × 10 7 PBMC를 사용합니다. <ol><li> 자기 구슬과 음의 선택에 의해 순진한 CD4 + T 세포를 정화. 안티 CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, 안티 TCRγ / δ, 안티 HLA-DR 및 CD235a (글리코 포린의 A) 항체와 부정적인 선택을 수행합니다. F 통한 CD4 + CD45RA + 세포를 측정하여 순도의 비율을 평가낮은 세포 계측법. 주 : 선택적으로, 밤새 37 ° C, 5 % 단핵 세포 부착을 촉진하고 나이브 CD4 + T 세포를 정제하여 계속 보충 된 10 ml의 배지에 1 × 106 세포 / ml의 농도로 CO 2에서 한 PBMC 배양 진행. 말초 혈에서 나이브 CD4 + T 세포의 효율적인 복구가 크게 정화 시스템에 의존한다. </li></ol></li><li> 5 μg의 / ㎖의 항 CD3 모노클로 날 항체와 PBS의 웰 당 250 μL를 첨가하여 24 웰 세포 배양 플레이트를 준비하고, 37 ℃에서 적어도 2 시간 동안 배양한다. 참고 : 96 웰 플레이트와 함께 사용할 수있다 나이브 CD4 + T 세포로부터 작은 수를 사용하는 경우 (예를 들어, X10 -1 2 × 105 (4)). </li><li> 24도 또는 96 웰 플레이트에서 항 CD3 항체 희석을 제거하고 두 번 멸균 1X PBS를 이용하여 접시를 씻으십시오. </li><li> + 순도&gt; 95 %로 나이브 CD4 + T 세포 (CD4 희석소 태아 혈청을 3 %로 보충 고급 RPMI 1640 배지에 1 × 106 세포 / ml의 밀도 CD45RA +)가 (혹은 RPMI 혈청의 10 %), 2 mM의 글루타민 및 항생제 (1 U / ㎖ 페니실린, 1 보충 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신). 참고 : 강글 리오 시드 현지화가 PBMC를 요구하는 경우 아래에 설명 된대로, 희석 및 자극에 대해 동일한 프로토콜을 따릅니다. </li><li> 항 CD3 코팅 우물과 24 웰 플레이트에서 비 코팅 된 웰 (대조군 세포)에 세포 희석 500 μl를 추가합니다. 대안 적으로, 상기 96 웰 플레이트에 세포 희석액 100 ㎕를 추가한다. </li><li> 항 CD28 항체 1 μg의 / ㎖를 첨가하여 항 CD3 피복 웰 나이브 CD4 + T 세포의 자극 조건을 완료. </li><li> 항 CD28 항체를 첨가하지 않은 웰의 코팅 대조군으로서 휴지 CD4 + T 세포를 유지한다. 37 °의 표준 조건 하에서 72 시간 0의 휴식과 활성화 된 CD4 + T 세포를 품어C, 5 % CO 2. </li><li> 37 ° C에서 배양 순진한 CD4 + T 세포를 휴식의 CD69 초기 활성화 마커 (16 시간 포스트 활성화) 또는 CD25 늦은 활성화 마커 (48 시간 포스트 활성화)의 발현 유동 세포 계측법에 의해 평가하고 활성화 적절한 활성화를 확인하려면 5 % 없거나 항 CD3 / CD28 항체 9,10의 존재하에 CO 2. </li></ol> 2. 휴식의 준수 및 활성화 나이브 CD4 + T 세포 <ol><li> 적어도 15 분간 고압 증기 멸균 및 자외선 노출에 의해 12mm 라운드 커버 슬립을 소독. </li><li> 멸균 24 웰 세포 배양 접시에 배치 된 커버. 주 : 1 미만 × 105 세포 배양의 경우는 커버 슬립에 세포의 분산을 방지하도록 작은 우물와 슬라이드 챔버를 사용하는 것이 바람직하다. </li><li> 코팅 된 커버 폴리 -L- 라이신으로 200 μL (또는 슬라이드 챔버) (MW 150-300 KDa의) 0.1 % (w / v)의 용액을 (R)에서 5 분 동안 배양움 온도 (RT)는 실온에서 적어도 1 시간 동안 제거하고 건조. </li><li> 신중하게 혼합하고 24 웰 플레이트에서 휴식 및 활성화 순진한 CD4 + T 세포를 수집합니다. 세포를 세어 필요한 경우 폴리 -L- 리신 코팅 된 커버 슬립을 1 × 105 세포를 전송할 새로운 보충 배지로 조정한다. 37 O C에서 6 시간의 최소 5 % CO 2 세포를 품어. </li></ol> 3. 나이브 CD4 + T 세포를 수집 및 휴식의 고정 및 활성화 <ol><li> 조심스럽게 배양 휴식 및 활성화 순진한 CD4 + T 세포에서 매체를 제거합니다. </li><li> RT 멸균 PBS 500 μl를 천천히를 추가합니다. 참고 : 우물에서 솔루션의주의 추가 및 제거는 커버 슬립에서 세포의 분리를 방지 할 수 있습니다. </li><li> PBS를 폐기하고 철저하게 문화 매체를 제거하기 위해 또 다른 500 μl의 PBS를 추가합니다. </li><li> 500 μL 여과하고 4 % 파라 포름 알데히드의 첨가 (FILT하여 세포를 고정배급은 현미경 분석에 방해) 및 (선호) 또는 밤새 4 ° C에서 RT에서 30 분 동안 배양 할 수 미립자를 제거합니다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 독성 및 휘발성 화합물이다. 인간 발암 물질로 알려져있다. 적절한 안전 프로토콜을 신중하게 사용합니다. </li><li> 정착액을 제거하고 RT에서 PBS로 두 배 이상 씻는다. </li><li> 다음 단계로 진행 또는 염색까지 몇 일 동안 4 ° C에서 PBS 500 μL와 함께 접시 우물을 유지한다. 참고 :이 과정에서 불임은 미생물의 성장을 방지 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 염색, 공 초점 현미경에 의해 설치 및 시각화 <ol><li> 우물에서 PBS를 제거합니다. 차가운 블로킹 완충액 500 ㎕를 추가 (1X PBS, 0.5 %의 표준 등급의 소 혈청 알부민, 1 % 소 태아 혈청의 pH 7.4). 얼음에 20 분 동안 품어. </li><li> 신중하게 차단 버퍼를 제거하고 일차 항체 추가 (항 강글리오사이드 GD3 클론 R24을, GD2 클론 14G2a)PE-복합 항 CD25 및 APC - 복합 안티 TCR 및 2.5 μg의 / ㎖로 버퍼를 차단에 희석 컨트롤을 아이소 타입. </li><li> 얼음에 2 시간 또는 밤새 4 ° C를 품어. 주 : 느린 오비탈 교반이 바람직하다. </li><li> 조심스럽게 항체를 제거하고 PBS의 천천히 500 μl를 추가합니다. 두 번 반복합니다. </li><li> 이차 항체 0.1 μg의 / ㎖로 버퍼를 차단에 희석 (R24 안티 GD3, 알렉사 플 루어 14G2a 방지 GD2에 대한 488 공역 또는 알렉사 플 루어 647 - 복합 안티의 IgG2a에 대한 FITC 복합 항 IgG3)를 추가합니다. </li><li> 흔들림없이 어둠 속에서 얼음에 1 시간 동안 품어. </li><li> 4.4에 설명 된대로) PBS에 세 번 씻으십시오. 샘플의 탈수를 피하기 위해 충분한 PBS로 우물을 유지합니다. </li><li> 0.1 ㎍ / ml의 PBS에 희석 훽스트 333258 얼룩을 추가합니다. </li><li> 실온에서 15 분을 품어 제거합니다. PBS로 세 번 씻으십시오. </li><li> 종이 타월에 슬라이드를 삽입하고 설치 솔루션 (PBS에 50 % 글리세롤) 또는 상업적 장착 용액 20 μl를 추가들 페이딩 및 샘플에서 담금질 방지 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 고급 핀셋으로 커버 슬립을 선택하고 설치 솔루션에 놓습니다. 세포가 부착 된 커버 슬립의 측면이 용액과 접촉에 있는지 확인합니다. 매니큐어로 된 커버를 밀봉 형광 또는 공 초점 현미경을 사용하여 분석 할 수 있습니다. </li></ol> RNA의 5 격리 <ol><li> 항 CD3 항체 (5 μg의 / ㎖) 코팅 된 96 웰 플레이트를 준비합니다. 자극을 완료하기 위해 4 × 104 나이브 CD4 + T 세포 / 웰의 항 CD28 항체 (1 μg의 / ㎖)이 보충 된 배양 배지 100 μl를 부화. 0 ~ 72 시간 동안 CO 2를 37 ° C에서 품어 5 %. </li><li> 다른 후 활성화 시간 후 microcentrifuge 관에 세포를 배치합니다. </li><li> RT에서 5 분 250 XG에 500 PBS의 μL와 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 1ml의 트리 졸 시약을 추가합니다. </li><li> RT에서 5 분 동안 품어에서 샘플을 유지 -8076 적어도 24 시간 동안 C. 필요할 때 RNA 분리를 진행합니다. 참고 : 최소 24 시간 동안 -80 ° C에서 샘플을 떠난다는 RNA 수율을 향상시킨다. 또한, 손 장갑 RNases 사용하여 RNA 분해를 방지하는 데 필수적이다. </li><li> 수욕에서 2 분 동안 37 ℃에서 항온 처리 샘플을 해동. </li><li> 200 μl의 클로로포름을 추가하고 30 초 (텍싱에 의해 RNA의 적극적인 혼합을 방지하기 위해)을 위해 손으로 격렬하게 흔들어. 실온에서 5 분 품어. </li><li> 4 ℃에서 12,000 XG에 원심 분리기 15 분. </li><li> 새로운 microcentrifuge 관에 수상을 복구 할 수 있습니다. </li><li> 500 ㎕의 이소프로판올을 추가하고 튜브를 세 번 반전. </li><li> 4 ° C에서 12,000 XG에 10 분 동안 10 RT에서 분 원심 분리기를 품어. </li><li> 반전에 의해 상층 액을 버린다. </li><li> 4 ℃에서 12,000 XG에 얼음 차가운 75 % 에탄올과 원심 분리기 10 분의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 완전히 뜨는을 버리고 오픈 튜브의 캡을 떠나는하여 RNA 펠렛을 건조. 아니E :이 시점에서 펠릿을 명확하게 표시되지 않습니다. 어쨌든 진행합니다. </li><li> 분자 수준의 물 20 μL에 펠렛을 재현 탁. nanodrop를 사용하여 260 nm 내지 280 nm의 흡광도를 측정함으로써 농도 및 핵산의 순도를 계산한다. </li><li> 임의의 통상적 인 역전사 키트를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성 심하게 진행. 주 : 약 0.5 μg의 RNA는 4 × 104 나이브 CD4 + T 세포로부터 얻어진다. cDNA를 RNA 100에서 NG synthetized 낮은 RNA 입력 장비의 필요없이 실시간 PCR 반응에서 사용될 수있다. </li></ol>

<ol><li>Mazzon, C., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+tango+to+quadrilla%3A+current+views+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse.</a> Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).</li>
<li>Hamann, D., Pa Baars,, Hooibrink, B., van Lier, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+human+CD4%2B+T-cell+population%3A+two+distinct+CD4%2B+T-cell+subsets+characterized+by+coexpression+of+CD45RA+and+CD45RO+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms.</a> Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).</li>
<li>Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSOM+%2F+QD-Based+Visualization+of+GM1+Serving+as+Platforms+for+TCR+%2F+CD3+Mediated+T-Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation.</a> Biomed Res Int. , 276498(2013).</li>
<li>Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNAS+Plus%3A+CD4+and+CD8+T+cells+require+different+membrane+gangliosides+for+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Procs+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation.</a> Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).</li>
<li>Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acids+in+the+brain%3A+gangliosides+and+polysialic+acid+in+nervous+system+development%2C+stability%2C+disease%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration.</a> Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).</li>
<li>Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+na%C3%AFve+Th+cells+increases+surface+expression+of+GD3+and+induces+neoexpression+of+GD2+that+colocalize+with+TCR+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters.</a> Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).</li>
<li>Müthing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLC+in+structure+and+recognition+studies+of+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids.</a> Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).</li>
<li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li>
<li>O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+of+surface+and+intracellular+protein+expression+by+T+cells+after+stimulation+in+the+presence+of+monensin+or+brefeldin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).</li>
<li>Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation%2C+proliferation+and+apoptosis+in+primary+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection.</a> Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).</li>
<li>Marconi, S., Acler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-GD2-like+IgM+autoreactivity+in+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler%22%5BJournal%5D)">Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients.</a> Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).</li>
<li>Park, J. E., Wu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+specificity+of+natural+killer+T+cells+against+GD3+ganglioside+and+identification+of+GM3+as+an+inhibitory+natural+killer+T-cell+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand.</a> Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).</li>
<li>Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disialoganglioside+GD3+is+released+by+microglia+and+induces+oligodendrocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis.</a> Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).</li>
<li>Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poliovirus+infection+blocks+ERGIC-to-Golgi+trafficking+and+induces+microtubule-dependent+disruption+of+the+Golgi+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex.</a> J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).</li>
<li>Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+apparatus+immunolocalization+of+endomannosidase+suggests+post-endoplasmic+reticulum+glucose+trimming%3A+implications+for+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control.</a> Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).</li>
<li>Yamashiro, S., Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%28GD3+synthase%29+gene+in+human+cancer+cell+lines%3A+high+level+expression+in+melanomas+and+up-regulation+in+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes.</a> Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).</li>
<li>Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+regulated+expression+of+9-O-acetyl+GD3+%28CD60b%29+and+7-O-acetyl-GD3+%28CD60c%29+during+differentiation+and+maturation+of+human+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes.</a> Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).</li>
<li>Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GD3%2C+a+prominent+ganglioside+of+human+melanoma.+Detection+and+characterisation+by+mouse+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).</li>
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기술 된 프로토콜은 CD4 + T 세포 또는 세포의 수가 적은부터 다른 면역 세포 (예 PMBCs,도 5)의 세포 현탁액 갱글 또는 단백질 지역화하는데 사용될 수있다. 때문에 T 세포 비 접착 특성의 작은 크기의 불량 정보 또는 낮은 품질의 형광 현미경 사진의 결과를 취득 셀이 올바르게 부착되지 않은 경우. 이 선도, 치료 중 강글리오사이드의 공간 지역화 및 역학 (예를 들면, T 세포 활성화)를 보여준다 때문에 양질 초점 현미경 분석과 결합이 프로토콜은 강글리오사이드의 검출을 위해 박층 크로마토 그래피와 같은 기술의 사용에 비해 중요한 장점 생물학적으로 관련 데이터 11,12,13의 취득. 또한,이 프로토콜은 갱글 표현의 평가가 CD4 + T 세포의 소수 (2 × 104부터 허용) 그 복제 또는 상이한 검정 (6)의...

CD4 + T 세포는 항원 제시 세포에 의해 활성화 한 후 자신의 이펙터 기능을 통해 면역 반응을 조율. 활성화 과정에서 변조 된 세포 메커니즘 연구는 면역 기능의 기본 과정에 대한 통찰력을 할 수 있습니다. 그들이 주변 혈액이 세포의 매우 작은 모집단을 대표하기 때문에, 나이브 CD4 + T 세포의 연구는 복잡해질 수있다. 형광 현미경을 통해 여러보고 CD4 + T 세포 활성화에 관여하는 다른 분자 플라즈마 막 (3)에 주로 연관 단백질의 위치 파악을 연구 하였다. 강글리오사이드는 시알 산 함유 글리 고스되어 있으며 광범위가 같은 면역 세포로서 풍부한 다른 세포 인 신경 세포 연구되었지만 또한 생물학적으로 중요한 기능과 4,5- 강글리오사이드를 표현한다. 우리는 이전에 그쪽을보고ST8Sia 1 (GD3 합성 효소)과 GM2 / GD2 합성 효소 시알 산 전이 효소 α2,8의 상향 조절이 인간의 순진한 CD4 + T 세포의 활성화 동안 t, 즉 GD2의 중요한 표면 neoexpression 및 GD3의 강글 리오 시드 (6)의 상향 조절을 유도한다. 면역 세포 GD3, GD2 강글 리오 시드 등의 추가의 연구는 면역 기능의 단백질 기반의 부분도를 보완 할 필요가있다. 일반적 갱글 발현 연구는 박층 크로마토 그래피 (TLC) (7)과 같은 기술에 기초하지만, 이러한 기술은 생물학적 분석을 제한하는 세포막 또는 세포 내 구획 강글리오사이드의 공간적 위치 파악을 허용하지 않는다. 이 작품에서 우리는 항 CD3 / 안티 CD28 활성화 후 인간의 순진한 CD4 + T 세포와 PBMC를에 GD3 및 GD2 강글리오사이드의 항체 매개 식별 및 위치 파악을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 IT 내가 함께림프구의 작은 크기 (9 μm의)을 고려하여, 고품질의 화상 (6)의 획득과, 현탁액 중의 세포의 낮은 숫자의 강글리오사이드의 유전자 발현 및 분자를 분석하는 것도 가능하다.

<table><tbody><tr><td>고급 RPMI 1640&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>3% FBS</td></tr><tr><td>마우스 anti human CD3 항체</td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 클론</td></tr><tr><td>마우스 anti human CD28 항체</td><td>ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6 클론</td></tr><tr><td>마우스 anti human GD3&nbsp; 항체</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24 클론</td></tr><tr><td>마우스 anti human GD2 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53831</td><td>14G2a 클론</td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-mouse IgG3 항체</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 conjugated antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl; tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 공액 안티마우스</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl; tific</td><td>A-21241</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 333258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol 시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ T 세포 분리 키트 II, 인간</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>분류&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek 챔버 슬라이드 시스템</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV 1000 레이저 컨포칼 현미경 (Olympus)&nbsp;</td><td>올림푸스</td><td></td><td>업라이트 BX61WI 및 IX81&nbsp;</td></tr><tr><td>순방향 서열 프라이머 GD3 synthase</td><td>5&acute;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&acute;</td><td></td><td>참조 7</td></tr><tr><td>역 서열 프라이머 GD3 synthase</td><td>5&acute;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&acute;</td><td></td><td>참조 7</td></tr><tr><td>순방향 서열 프라이머 GM2/GD2 synthase</td><td>5&acute;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&acute;</td><td></td><td>참조 7</td></tr><tr><td>역 서열 프라이머 GM2/GD2 synthase</td><td>5&acute;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&acute;</td><td></td><td>참조 7</td></tr></tbody></table>

cd4의 준비<sup&gt; +</sup&gt; 현미경으로 gd3 및 gd2 강글 리오 시드 멤브레인 식의 분석을위한 t 세포

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

서스펜션의 순진한 CD4 + T 세포의 활성화를 위해 본원에 기술 된 방법 및 공 초점 현미경 분석 된 커버에서의 준수는 실험을 프로파일 링하는 보수 표현 유동 세포 계측법 등의 CD4 + T 세포 활성화에 관여하는 강글리오사이드의 공간 현지화 및 시각화를 허용, 서부 블 롯팅 또는 실시간 PCR. 유동 세포 계측법 및 현미경을 통해 세포 지역화 통해 강글리오사이드 발현의 정량화는 높은 친화력과 특이성 안티 - 강글리오사이드 항체의 사용에 의해 얻을 수있다. 그럼에도 불구하고, 현탁액 중의 세포의 적절한 처리가 형광 또는 초점 현미경 취득 요구 필요한 접착 성을 촉진하는 배양 플레이트의 치료를 포함한다. 이 작품에서 우리는 순진한 CD4 + T 세포 활성화하는 동안 GD3 및 GD2 강글 리오 시드의 표현과 TCR와 colocalization을 결정하기위한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 리얼 t&lt;40,000 세포를 사용 IME PCR 실험은 세포의 낮은 숫자 및 추가 저 입력 RNA 키트의 필요없이 수행 될 수있는 유전자 분석 실험을 보여주는 상기 GD3 및 GM2 / GD2 합성 효소 유전자의 결정을 위해 설명된다.

이 논문에 기술 된 프로토콜은 배양의 좋은 품질과 접착 휴식 및 활성화 인간의 순진한 CD4 + T 세포 (그림 1) 렌더링합니다. 활성화 된 CD4 + T 세포는 휴면 상태 (도 1A)와 비교하여 특징적인 증식 프로파일 (도 1B)를 도시한다. CD25 늦은 활성화 마커 공 초점 현미경 (그림 1C)에 의해 관찰 72 시간의 효율적인 활성화를 평가하는 데 유용합니다. CD69 마커는 유동 세포 계측법 또는 현재 현미경 조기 활성화 마커로서 사용된다. 폴리 -L- 라이신으로 코팅 된 커버 슬립에 휴식의 준수 및 활성화 순진한 CD4 + T 세포는 안티 GD3 및 안티 TCR 항체 (그림 2)와 이중 라벨로 보여 GD3 및 TCR의 발현 및 현지화를 연구하는데 유...

우리는 쉬고 강글리오사이드 활성화 인간 나이브 CD4 + T 세포의 세포막 발현 및 위치 파악을 결정 현미경에 사용하기위한 표준 항체 염색 프로토콜을 설명한다. 또한 실시간 PCR 실험은 &lt;추가 낮은 입력 RNA 키트를 필요로하지 않는 40,000 세포를 사용하는 기술.

CD4의 준비<sup&gt; +</sup&gt; 현미경으로 GD3 및 GD2 강글 리오 시드 멤브레인 식의 분석을위한 T 세포

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 적은 수의 세포를 사용하여 세포 표면의 GD3 및 GD2 강글리오사이드 국소화를 시각화하기 위한 CD4+T 세포 현탁액의 준비 과정을 보여주는 것입니다. 이 방법은 단핵 세포와 같이 작은 현탁 세포의 수가 적은 경우의 막 당지질 시각화에 유용합니다. 이 기술의 주요 장점은 시료 사용을 최적화함으로써 소량의 CD4+T 세포에서 강글리오사이드 발현 및 국소화를 평가할 수 있다는 점입니다.이 기술의 함의는 일부 유형의 T 세포 백혈병 연구 및 진단으로 확장될 수 있습니다. 확인한 바와 같이, 일부 백혈병 세포주는 GD3 및 GD2 강글리오사이드 발현을 상향 조절합니다. 건강한 인간 기증자의 말초혈 2 mL를 멸균 PBS EDTA 2 mL로 희석하는 것으로 시작하십시오.희석된 혈액을 1.077 밀도의 sucrose 용액 3 mL 위에 천천히 분주합니다. 그 다음, 말초혈액 단핵구(PBMC) 농도 구배를 형성하기 위해 21 °C에서 250 ×g로 30분 동안 감속 없이 원심분리합니다. 원심분리 후, PBMCs는 흰색 링 형태로 명확하게 관찰됩니다.피펫으로 PBMC를 수집하여 세척을 위해 멸균 튜브로 옮깁니다. PBS EDTA로 세포를 세척한 후, 시판되는 키트를 사용하여 마그네틱 비드 기반의 음성 선택법(negative selection)으로 naive CD4+T 세포를 정제합니다. 95% 이상의 순도로 CD4+T 세포군이 확보되면, 각 웰에 5 µg/mL 농도의 anti-CD3 단클론 항체가 포함된 PBS 250 µL를 첨가하여 24웰 세포 배양 플레이트를 준비합니다.플레이트를 37°C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 배양 후, 플레이트에서 anti-CD3 항체 희석액을 제거하고 멸균된 1x PBS로 2회 세척합니다. 그다음, naive CD4+T 세포를 첨가제가 포함된 advanced RPMI 1640 배지로 희석하여 1 × 10⁶ cells/mL의 밀도로 맞춥니다.다음으로, 희석된 세포 500 µL를 24-웰 플레이트의 anti-CD3 코팅 웰에 첨가합니다. 그 후, anti-CD28 항체를 1 µg/mL 농도로 첨가하여 anti-CD3 코팅 웰 내 naive CD4+T 세포의 자극을 완료합니다. 휴지기 및 활성화된 CD4+T 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 0~72시간 동안 배양합니다.정해진 배양 시간이 지난 후, 24웰 플레이트에서 휴지기 및 활성화된 naive CD4+T 세포를 수집합니다. 세포 수를 측정하고, 필요한 경우 신선한 보충 배지로 희석하여 1 × 10⁶ cells/mL 농도로 맞춥니다. poly-L-lysine이 코팅된 커버슬립이나 슬라이드 챔버가 포함된 24웰 플레이트의 웰에 희석된 세포 500 µL를 분주하고, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 최소 6시간 동안 배양합니다.배양 후, CD4+T 세포는 커버슬립에 부착됩니다. 웰에서 배지를 조심스럽게 제거한 다음, 멸균된 PBS 500 microliters를 천천히 첨가합니다. 세척 과정 중 PBS 첨가는 매우 주의해서 수행해야 하며, 특히 웰당 세포 수가 50, 000개 미만인 슬라이드 챔버를 준비할 때 더욱 주의가 필요합니다.PBS를 흡입하여 제거하고, 배양액을 완전히 제거하기 위해 웰에 PBS 500 µL를 추가로 넣습니다. 모든 PBS를 제거한 후, 여과된 4% paraformaldehyde 500 µL를 넣고 상온에서 30분 동안 배양하여 세포를 고정합니다. 고정 후, 고정액을 제거하고 PBS로 최소 2회 세척합니다.필요한 경우, 각 웰에 500 µL의 PBS를 채워 4 °C에서 며칠 동안 플레이트를 보관할 수 있습니다. 먼저, 고정된 세포에서 PBS를 제거하고 500 µL의 차가운 블로킹 버퍼를 추가합니다. 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.배양하는 동안 플레이트를 세게 흔들면 세포가 떨어져 나갈 수 있으므로 주의해야 합니다. 블로킹 버퍼를 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 2.5 µg/mL의 일차 항체 중 하나 또는 PE 결합 anti-CD25, APC 결합 anti-TCR, 또는 이소타입 대조군(isotype control)이 포함된 블로킹 버퍼를 첨가합니다. 얼음 위에서 빛을 차단하여 2시간 동안 배양하거나 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.배양 후 항체 용액을 조심스럽게 제거하고 500 µL의 PBS를 천천히 첨가합니다. 그 다음 블로킹 버퍼에 0.1 µg/mL 농도로 희석한 적절한 2차 항체를 첨가합니다. 빛을 차단한 상태에서 흔들리지 않도록 주의하며 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다.이전과 같이 PBS로 3회 세척한 후, PBS에 0.1 µg/mL로 희석한 Hoecht 염색액을 첨가하고 빛이 차단된 상태에서 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 세척된 슬라이드를 종이 타월 위에 놓고, 형광의 퇴색 및 소광을 방지하기 위해 20 µL의 봉입제 또는 상용 봉입제를 첨가합니다. 마지막으로, 정밀 핀셋으로 커버 슬립을 집어 아래쪽으로 돌려 봉입제 위에 올려놓아, 세포가 부착된 커버 슬립 면이 봉입제와 접촉하도록 합니다.커버슬립을 매니큐어로 밀봉한 후 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 분석합니다. 이 이미지는 활성화 72시간 후 고정된 CD4+T 세포의 명시야 시각화 모습을 보여줍니다. 염색 후 효율적인 활성화 여부의 검증은 빨간색으로 표시된 anti-CD25 항체를 사용하여 평가합니다.초록색으로 표시된 anti-GD3 항체 염색으로 확인한 결과, GD3 ganglioside는 활성화된 CD4+T 세포의 세포 내 및 세포 표면에 위치합니다. 다시 초록색으로 표시된 GD3는 anti-GD3 및 anti-TCR 항체 염색으로 분석했을 때, 빨간색으로 표시된 TCR과 공국소화(co-localize)되지 않습니다. 그러나 초록색으로 표시된 anti-GD2 및 빨간색으로 표시된 anti-TCR 항체 염색으로 분석한 결과, GD2 ganglioside는 TCR 및 CD4+T 세포와 공국소화됩니다.GD3 강글리오사이드 염색은 활성화된 PBMC의 일부 하위 집합에서 세포 내 및 세포 표면 국소화를 보여줍니다. 반면, GD2 강글리오사이드 염색은 모든 활성화된 PBMC에서 세포 내 및 세포 표면 국소화를 보여줍니다. CD4+T 세포의 부착 및 조작 절차를 거친 후, 강글리오사이드의 구체적인 세포 내 국소화 또는 처리 과정과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 세포 내 구획 염색과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 강글리오사이드 발현을 분석하기 위해 고품질의 형광 현미경 이미지를 얻는 CD4+T 세포의 소량 처리 및 부착 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

preparation-cd4-t-cells-for-analysis-gd3-gd2-ganglioside-membrane

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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CD4의 준비

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