마우스 Jejunal과 대장 세그먼트에서 장간막 구 심성 신경 활동의 생체 외 녹음에서

장간막 구심성 신경은 위장관에서 뇌로 정상적인 항상성과 병태생리학에 관한 정보를 전달합니다. 위장 구심성 신경 활동은 구심성 신경이 부착된 분리된 장 분절을 장기 욕조에 장착하고, 신경을 분리하고, 기저 활동과 자극 활동을 평가하여 평가할 수 있습니다.

이 기술의 전반적인 목표는 램프 팽창 및 화합물의 적용에 대한 반응으로 단일 jejunal 또는 colonic 신경 다발에서 체외 splanchnic 구심성 신경 활동을 기록하는 것입니다. 이 방법은 위장관에 공급하는 구심성 신경이 다양한 질병 상태에서 과민증 또는 둔감화되는지 여부와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 체외에서 신경 방전을 기록할 수 있고 중추 신경계의 조절이나 입력 없이 신경 활동을 정량화할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 신경 감작이 발병에 중요한 역할을 하기 때문에 과민성 대장 증후군과 같은 여러 통증 증후군의 치료 또는 진단으로 확장됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 신경 다발을 해부하고 기록된 신호의 단일 단위 분석에 상당한 양의 훈련이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 희생된 마우스를 앙와위 위치에 놓습니다.

xiphoid process에서 치골까지 이어지는 메스를 사용하여 피부와 복부 근육층을 통해 복부 정중선 절개를 수행합니다. 그런 다음 복강 내 조직이 건조해지는 것을 방지하기 위해 차가운 크렙스 용액으로 복강을 헹굽니다. 그런 다음 날카로운 가위를 사용하여 십이지장 굴곡에서 즉시 시작하여 소장을 약 20cm 정도 제거하여 전체 제주넘을 빠르게 절제합니다.

주변 구조가 손상되지 않도록 주의하고, 제주널 혈관과 구심성 신경을 포함하는 장의 장간막을 온전하게 유지하십시오. 다음으로, 절제된 제주넘을 얼음 위의 차가운 크렙스 용액에 넣고 Carbigen으로 지속적으로 산소를 공급합니다. 그런 다음 약 3cm 길이의 고리로 제주눔을 자릅니다.

혈관과 스플랑크닉 신경을 포함하는 장간막 다발을 각 루프의 중앙 근처에 배치하여 기록 챔버에 루프를 쉽게 장착할 수 있도록 합니다. 그런 다음 뭉툭한 카테터를 사용하여 Krebs 용액으로 각 세그먼트를 세척하여 in vitro 조직 샘플의 열화를 가속화하는 소화 효소를 포함하는 내강 내용물과 chyme을 제거합니다. 그런 다음 구심성 신경 활동을 측정하기 위한 세그먼트를 선택하고 실리콘 엘라스토머 층으로 코딩된 기록 챔버에 배치합니다.

기록 챔버의 Krebs 온도를 섭씨 34도로 유지하십시오. 그런 다음 장기 욕조에 제주날 세그먼트를 장착하여 구강 말단이 내강 흐름을 제공하는 주사기 드라이버에 연결되고 복부 말단이 유출에 연결되도록 합니다. 세그먼트를 약간 늘리되 과도한 장력을 가하지 않도록 주의하십시오.

실크 합자를 사용하여 양쪽 끝을 유입 및 유출 포트에 단단히 부착합니다. 그 후, 주사기 드라이버를 구강 말단에 부착하고 시간당 10밀리리터의 속도로 크렙스 용액으로 제주널 세그먼트를 광내 관류합니다. 장착된 장 분절의 장간막을 실리콘 엘라스토머 바닥층에 평평하게 고정합니다.

그런 다음 장간막 다발의 시각화를 최적화하기 위해 장간막을 늘립니다. 다음으로, 장착된 세그먼트에서 Krebs 내 용액이 누출되지 않는지 확인하기 위해 장 세그먼트의 내강 내 압력이 60mm의 수은에 도달할 때까지 출력 포트를 닫아 램프 팽창에 대한 테스트를 수행합니다. 중단 없이 루미날 내 압력이 완만하게 상승하는 것을 관찰합니다.

초기 팽창 단계에서 세그먼트의 작은 수축을 예상하십시오. 필요한 경우, Krebs 용액에 L형 칼슘 채널 차단제 니페디핀 1마이크로몰을 첨가하여 연동 활성을 차단합니다. 실체 현미경으로 두 개의 작은 핀셋으로 장간막의 지방 조직을 부드럽게 잡아당겨 지방 조직에 묻혀 있는 혈관과 구심성 신경이 손상되지 않도록 주의하면서 지방 조직을 부드럽게 떼어내기 시작합니다.

장간막에서 멀리 떨어진 곳에서 지방 조직을 벗겨내기 시작하여 장간막 다발의 두 혈관을 노출시킵니다. 두 혈관 사이에 있는 구심성 제주널 신경(centerent jejunal nerve)을 지방 조직에 캡슐화된 얇은 흰색 실로 식별합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 지방 조직을 부드럽게 벗겨내어 제주눔 쪽으로 더 가깝게 해부합니다.

다음으로, 신경에 부착된 지방 조직을 제거하여 분절의 장간막 신경을 절개합니다. 날카로운 조직 가위를 사용하여 신경을 절제합니다. 필요한 경우 남아 있는 지방과 결합 조직, 표신경초를 부드럽게 잡아당겨 벗겨냅니다.

이 절차에서는 미세 조작기를 사용하여 흡입 전극의 끝을 장기 수조로 내립니다. 그런 다음 장기 수조에서 일부 크렙스 용액을 부드럽게 흡인하여 전극 끝이 크렙스 용액에 잠기도록 합니다. Krebs 용액이 흡입 전극 내부의 와이어 전극을 덮고 있는지 확인하십시오.

다음으로, 흡입 전극의 끝을 transected afferent nerve strand 바로 옆에 놓고 transection된 신경 가닥을 전체 길이에 걸쳐 모세혈관으로 끌어당깁니다. 전극의 끝을 지방 조직 쪽으로 움직이고 플런저를 사용하여 유리 모세관으로 흡인하여 장기 욕조의 내용물로부터 모세혈관의 신경을 기계적으로 밀봉합니다. 주변의 일부 지방 조직을 모세관으로 흡인하여 기록 챔버에서 유리 모세관을 적절하게 밀봉하는 것은 궁극적으로 최종 분석을 방해하는 중복 배경 소음을 최소화하는 데 매우 중요합니다.

구심성 신경 활동의 기록을 확인하려면 출력 포트를 닫아 구심성 발사를 증가시키는 램프 팽창을 수행하여 장 분절의 압력을 점진적으로 상승시킵니다. 3회 연속 램프 팽창이 재현 가능한 다중 장치 방전을 생성하는 경우에만 원하는 실험 프로토콜을 수행합니다. 신경 분리 후, 실제 실험을 수행하기 전에 안정적인 자발적 구심성 신경 활동을 얻기 위해 15분 동안 준비를 안정화합니다.

여기에 표시된 것은 기계에 민감한 프로파일을 기반으로 하는 다양한 구심성 섬유 단위의 개략적인 표현입니다. 낮은 역치 섬유는 주로 낮은 팽창 압력에서 증가된 신경 활동을 나타내므로 55% 이상의 LT 비율이 발생합니다.반대로 높은 문턱 단위는 유해한 압력에서 발사 속도의 증가만 표시합니다. Wide Dynamic Range 섬유는 전체 팽창 동안 신경 활동이 점진적으로 증가하는 반면, 기계적으로 둔감한 섬유는 증가하는 팽창 압력에 반응하지 않습니다.

이 그림은 램프 팽창 중 야생형 마우스의 장간막 구심성 신경 방전을 보여줍니다. biphasic dis팽ness 프로파일에서 신경 방전의 초기 상승은 낮은 역치와 넓은 동적 범위 섬유로 인한 반면, 높은 임계값과 넓은 동적 범위 섬유는 방전의 두 번째 증가에 기여합니다. 일단 숙달되면 제주널 신경의 격리와 초기 기준선 기록은 적절하게 수행되면 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.

장기 욕조에 투여되는 화합물의 효과를 연구할 때 더 많은 시간이 필요합니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 실험에 대해 동일한 세그먼트를 일관되게 식별하는 것과 같이 잘 표준화된 접근 방식을 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 위장 신경계의 어떤 중계소가 여러 질병의 발병에 관여하는지 평가하기 위해 후속 칼슘 영상과 함께 등쪽 뿌리 신경절의 분리와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

개발 후, 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 위장 연구에서 여러 통증 증후군의 발병 기전을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 쥐의 위장관에서 제주널 구심성 신경을 분리하고 램프 팽창 중에 활동을 기록하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.