마우스 Jejunal과 대장 세그먼트에서 장간막 구 심성 신경 활동의 생체 외 녹음에서

이 기술의 전반적인 목표는 램프 팽창(ramp distension) 및 화합물 적용에 반응하여 단일 공장 또는 결장 신경 다발로부터 체외(in vitro) 내장 신경 구심성 활동을 기록하는 것입니다. 이 방법은 위장관에 분포하는 구심성 신경이 다양한 질환 상태 동안 과민해지거나 둔감해지는지 여부와 같이 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신경 방전을 체외에서 기록할 수 있다는 점과 중추신경계의 조절이나 입력 없이 신경 활동을 정량화할 수 있다는 점입니다.

신경 감작이 병태생리에 중요한 역할을 하기 때문에, 이 기술의 함의는 과민성 대장 증후군과 같은 여러 통증 증후군의 치료나 진단으로 확장됩니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 신경다발의 해부와 기록된 신호의 단일 단위 분석에 상당한 양의 훈련이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 희생시킨 마우스를 앙와위로 배치하십시오.

메스를 사용하여 검상돌기부터 치골까지 피부와 복근층을 통해 복부 정중선 절개를 수행합니다. 그 후, 복강 내 조직이 건조해지는 것을 방지하기 위해 차가운 Krebs 용액으로 복강을 헹굽니다. 그런 다음, 십이지장공장 굴곡부부터 시작하여 소장의 약 20cm를 제거함으로써 공장 전체를 날카로운 가위로 빠르게 절제합니다.

주변 구조물이 손상되지 않도록 주의하고, 공장 혈관과 구심성 신경이 포함된 장간막을 온전하게 유지하십시오. 다음으로, 적출한 공장을 얼음 위에 놓인 차가운 Krebs 용액에 넣고 Carbigen으로 지속적으로 산소를 공급하십시오. 그런 다음, 공장을 약 3 cm 길이의 루프 형태로 절단하십시오.

장 루프를 기록 챔버에 장착하기 용이하도록, 각 루프의 중앙 부근에서 혈관과 내장 신경이 포함된 장간막 다발을 찾습니다. 이어서, 루프 내의 내용물과 소화액은 체외(in vitro)에서 조직 샘플의 손상을 가속화하는 소화 효소를 포함하고 있으므로, 둔탁한 카테터를 사용하여 각 분절을 Krebs 용액으로 세척하여 이를 제거합니다. 그 후, 구심성 신경 활성을 측정할 분절을 선택하여 실리콘 엘라스토머 층이 코팅된 기록 챔버에 배치합니다.

기록 챔버 내 Krebs 용액의 온도를 34 °C로 유지하십시오. 그런 다음 공장 분절을 기관 목욕조(organ bath)에 장착하여, 구측(oral end)은 내강 흐름을 제공하는 시린지 드라이버에 연결하고 항측(aboral end)은 유출구에 연결하십시오. 분절을 약간 늘려주되, 과도한 장력이 가해지지 않도록 주의하십시오.

실크 결찰사를 사용하여 양끝을 유입구와 유출구 포트에 단단히 고정하십시오. 그 후, 구강측 끝단에 시린지 드라이버를 연결하고 공장 분절의 관강 내로 Krebs 용액을 10 milliliters per hour의 속도로 관류시키십시오. 고정된 장 분절의 장간막을 실리콘 엘라스토머 바닥층에 평평하게 핀으로 고정하십시오.

그런 다음, 장간막 다발의 시각화를 최적화하기 위해 장간막을 넓게 펼칩니다. 다음으로, 장 분절의 관내압이 60 mmHg에 도달할 때까지 배출 포트를 닫아 램프 팽창(ramp distension) 테스트를 수행하여, 고정된 분절에서 관내 Krebs 용액이 누출되지 않는지 확인합니다. 관내압이 중단 없이 부드럽게 상승하는지 관찰하십시오.

초기 팽창 단계 동안 분절의 작은 수축이 발생할 수 있습니다. 필요한 경우, Krebs 용액에 1 µmol의 L-형 칼슘 채널 차단제인 nifedipine을 첨가하여 연동 운동을 억제하십시오. 실체 현미경 하에서 두 개의 작은 핀셋으로 지방 조직을 살살 당겨 장간막에서 조심스럽게 제거하며, 이때 지방 조직 내에 묻혀 있는 혈관과 구심성 신경이 손상되지 않도록 주의하십시오.

공장과 떨어진 지점부터 지방 조직을 벗겨내어 장간막 다발 내의 두 혈관을 노출시킵니다. 두 혈관 사이에 지방 조직으로 둘러싸인 가느다란 흰색 실 형태의 수입 공장 신경(afferent jejunal nerve)을 확인합니다. 그다음 핀셋을 사용하여 지방 조직을 조심스럽게 벗겨내며 공장 쪽으로 더 근위부까지 박리합니다.

다음으로, 신경에 부착된 지방 조직을 제거하여 해당 분절의 공장 장간막 신경을 박리합니다. 날카로운 조직 가위를 사용하여 신경을 절단합니다. 필요한 경우, 신경집을 비롯한 잔여 지방 및 결합 조직을 가볍게 당겨 제거합니다.

본 절차에서는 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 흡입 전극의 팁을 장기 욕조(organ bath) 안으로 내립니다. 그 다음, 전극 팁이 Krebs 용액에 잠길 때까지 장기 욕조에서 Krebs 용액을 천천히 흡입합니다. 이때 흡입 전극 내부의 와이어 전극이 Krebs 용액으로 덮여 있는지 확인하십시오.

다음으로, 흡입 전극의 팁을 절단된 구심성 신경 가닥 바로 옆에 위치시키고, 절단된 신경 가닥 전체가 모세관 안으로 빨려 들어가도록 유도합니다. 전극의 팁을 지방 조직 쪽으로 조정한 후, 플런저를 이용해 이를 유리 모세관 내부로 흡입하여 신경이 오간 배스의 내용물로부터 기계적으로 밀봉되도록 합니다. 주변 지방 조직 일부를 모세관 안으로 흡입하여 기록 챔버로부터 유리 모세관을 적절히 밀봉하는 것은, 최종 분석을 방해하는 불필요한 배경 소음을 최소화하는 데 매우 중요합니다.

구심성 신경 활동의 기록을 확인하려면, 출력 포트를 닫아 장 분절 내의 압력을 점진적으로 상승시켜 램프 팽창(ramp distension)으로 인한 구심성 발화 증가를 유도하십시오. 3회 연속의 램프 팽창에서 재현 가능한 다단위 방출(multi-unit discharge)이 나타나는 경우에만 원하는 실험 프로토콜을 수행하십시오. 신경 분리 후, 실제 실험을 수행하기 전에 안정적인 자발적 구심성 신경 활동을 얻기 위해 표본을 15분 동안 안정화하십시오.

여기 기계적 민감도 프로필에 따른 다양한 구심성 섬유 단위의 도식적 표현이 나와 있습니다. 저역치 섬유는 주로 낮은 팽창 압력에서 신경 활동의 증가를 보이며, 그 결과 LT 비율이 55% 이상으로 나타납니다. 반대로 고역치 단위는 유해 압력에서만 발화율의 증가를 보입니다. 광범위 역동적 범위 섬유는 전체 팽창 과정 동안 신경 활동이 점진적으로 증가하는 반면, 기계적 비민감성 섬유는 증가하는 팽창 압력에 반응하지 않습니다.

이 그림은 램프 팽창(ramp distension) 중 야생형 마우스의 장간막 구심성 신경 방출을 보여줍니다. 이상성 팽창 프로파일에서 신경 방출의 초기 상승은 저역치 및 광범위 역동적 범위(wide dynamic range) 섬유에 의한 것이며, 고역치 및 광범위 역동적 범위 섬유는 두 번째 방출 증가에 기여한다는 점에 유의하십시오. 숙련된 경우, 적절하게 수행한다면 공장 신경의 분리와 초기 기선 기록을 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.

장기조(organ bath)에 투여된 화합물의 효과를 연구할 때는 더 많은 시간이 필요합니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 실험에서 동일한 분절을 일관되게 식별하는 것과 같이 잘 표준화된 접근 방식을 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는, 여러 질병의 병태생리에 어떤 위장 신경계 중계 지점이 관여하는지 평가하기 위해 배측 신경절(dorsal root ganglia)의 분리 및 후속 칼슘 이미징과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 개발 이후 신경과학 분야의 연구자들이 위장관 연구에서 여러 통증 증후군의 병태생리를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 마우스 위장관에서 공장 구심성 신경을 분리하고, 점진적 팽창 동안 해당 신경의 활성을 기록하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.