조정 나노 기공을 통해 나노 입자 전좌 속도를 통해 제타 전위의 측정 : 예를 들어 DNA 변성 입자를 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 TRPS(Tunable Resistant Post Sensing)를 사용하여 나노 입자의 표면 화학을 특성화하고 물질의 제타 전위를 결정하는 것입니다. 이것은 DNA 변형 나노 입자를 특성화하여 입증하고 있습니다. 이 방법은 나노 물질의 특성화 및 생물학적 분석 개발의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 입자 분석을 통해 입자를 완료할 수 있다는 것입니다. 각 DNA 입자 신호는 제타 전위 측정으로 변환되어 분석 중인 샘플에 대한 완전한 그림을 제공합니다. 가장 오래된 방법은 재료의 특성화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 세포, 바이러스, DNA 및 단백질 검출을 위한 생물학적 분석 개발과 같은 다른 응용 분야에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로이 방법을 처음 접하는 개인은 간단한 샘프를 주입 한 다음 대답을 기다리는 것이 아니기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 과학자의 의견이 필요합니다.

이 절차를 시작하기 위해 와류 스트렙타비딘은 단일 분산성을 보장하기 위해 80와트에서 2분 동안 초음파 처리 전에 30초 동안 입자를 코팅했습니다. 스트렙타비딘 코팅된 입자를 PBST 완충액에서 100분의 1로 희석하여 10분의 1 입자에서 밀리리터당 9개의 입자의 농도를 얻습니다. 그런 다음 30초 동안 입자를 소용돌이치십시오.

10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 및 210 나노몰의 결과 농도를 위해 입자에 대한 DNA의 적절한 농도에서 밀리그램당 352 피코몰의 결합 용량을 기반으로 합니다. 샘플을 10초 동안 볼텍싱한 후 실온에서 30분 동안 회전하는 휠에 올려 DNA가 스트렙타비딘 비오틴 상호 작용을 통해 입자 표면에 결합할 수 있도록 합니다. 포획된 DNA가 추가되고 입자와 함께 배양된 후, 샘플을 30분 동안 마그네틱 랙에 올려 자기 분리를 통해 여분의 DNA와 용액을 제거합니다.

그런 다음 상층액을 제거하고 자석에 가장 가까운 새로 형성된 입자 클러스터를 방해하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 상층액을 동일한 부피의 새 PBST 완충액으로 교체합니다. 이제 각 샘플에 필요한 양의 타겟 DNA를 추가하여 가능한 최대 타겟 결합에 도달했는지 확인합니다.

10초 동안 샘플을 소용돌이칩니다. 그리고 실온에서 30분 동안 회전 휠에 올려 놓습니다. 혼성화가 완료되면 샘플을 마그네틱 랙에 30분 동안 올려 자기 분리를 통해 초과 타겟 DNA를 제거합니다.

다음으로 상층액을 제거하고 자석에 가장 가까운 새로 형성된 입자 클러스터를 방해하지 않도록주의하십시오. 그런 다음 상층액을 동일한 부피의 새 PBST 완충액으로 교체합니다. 중복 샘플에 대해 이전 단계를 반복한 후 샘플을 실온에서 16시간 동안 회전 휠에 올려 놓고 DNA 혼성화 시간을 조사합니다.

이 시점에서 TRPS 기기를 소프트웨어가 있는 컴퓨터 시스템에 연결합니다. 캘리퍼를 사용하여 두 개의 평행한 턱 바깥쪽 사이의 거리를 측정합니다. 기기 설정 탭의 스트레치 필드에 거리를 입력하고 탭 아래에 있는 calibrate stretch를 클릭합니다.

그 후, 나노포어 ID 번호가 위쪽을 향하도록 턱에 분석을 위해 적절한 크기의 폴리우레탄 나노기공 멤브레인을 측면으로 맞춥니다. 그런 다음 기기 측면의 스트레치 조정 핸들을 사용하여 분석에 필요한 스트레치까지 죠를 늘립니다. 80마이크로리터의 PBST 완충액을 나노기공 아래의 하부 유체 셀에 배치하여 측정에 영향을 줄 수 있는 기포가 없는지 확인합니다.

이제 상부 유체 셀을 클릭하여 제자리에 끼우고 40마이크로리터의 버퍼를 추가하여 기포가 없는지 확인합니다. 그런 다음 시스템 위에 패러데이 케이지를 배치하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 외부 압력을 가합니다. 40마이크로리터의 보정 입자를 상부 유체 셀에 배치한 후 세 가지 적용된 전압에서 TRPS 측정을 완료합니다.

소프트웨어의 기기 설정 탭에서 전압 스케일의 더하기 및 빼기 버튼을 클릭하여 전압을 변경합니다. 세 개의 전압이 적절한 배경 전류를 반환하는지 확인하십시오. 그리고 중간 전압에서 보정 입자가 최소 0.3나노암페어의 평균 차단 크기를 생성하는지 확인합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 조건이 달성되면 데이터 수집 탭의 소프트웨어에서 시작을 클릭하여 실행을 시작합니다. 측정을 완료하려면 데이터 수집 탭에서 중지를 클릭하고 데이터 파일을 저장합니다. PBST 버퍼가 있는 40마이크로리터의 보정 입자를 상부 유체 셀로 여러 번 교체하여 시스템을 세척합니다.

또한 더 이상 봉쇄 이벤트가 없을 때까지 다양한 압력을 가하여 잔류 입자와 교차 오염이 없는지 확인합니다. 적절한 기준선 전류에 도달한 후 상부 유체 셀의 전해질을 40마이크로리터의 샘플로 교체합니다. Data Acquisition 탭에서 start를 클릭하여 샘플 실행을 시작합니다.

최소 500개의 입자를 기록하고 실행 시간이 최소 30초인지 확인합니다. 측정을 완료하려면 데이터 수집 탭에서 중지를 클릭하고 데이터 파일을 저장합니다. 변형이 없는 스트렙타비딘 코팅 입자와 표면의 단일 가닥 DNA로 포화된 스트렙타비딘 코팅 입자의 크기 및 제타 전위 분석의 예가 여기에 나와 있습니다.

두 샘플은 비슷한 크기였지만 DNA가 입자 표면에서 기능화되었을 때 제타 전위는 상당히 달랐고 훨씬 더 컸습니다. 스트렙타비딘 코팅 입자에 혼성화된 DNA의 농도가 가장 낮고 가장 높은 샘플에 대해 표시된 크기 및 제타 전위 데이터가 여기에 표시됩니다. 더 높은 농도의 DNA와 혼성화된 입자에 대해 더 큰 제타 전위 값이 기록됩니다.

포획 프로브 DNA에 대해서만 측정된 제타 전위의 변화, 완전히 상보적인 DNA 표적, 중간 결합 DNA 표적, 말단 결합 DNA 표적 및 돌출된 DNA 표적에 대해 측정된 제타 전위의 변화가 여기에 나와 있습니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 20분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 각 보정과 샘플 사이에 나노폴을 철저히 세척하여 샘플 간에 교차 오염이 없는지 확인하고 나노폴 차단을 방지하는 것이 중요합니다.

개발 후 이 기술은 바이오센스 분야의 연구자들이 멀티플렉스 분석에서 단백질-단백질 및 단백질-DNA 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 TRPS를 사용하여 제타 전위를 얻고 생물학적 분석을 위해 DNA 변형 입자를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.