Name: 조정 나노 기공을 통해 나노 입자 전좌 속도를 통해 제타 전위의 측정 : 예를 들어 DNA 변성 입자를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 학습하세요 조정 가능한 저항성 펄스 감지(TRPS)를 사용하여 DNA 변성 나노입자의 표면 화학을 특성화하고 제타 전위를 측정하는 방법을. 이 기술은 개별 입자 분석을 통해 바이오어세이 개발에 필수적인 나노물질 특성화에 중요한 통찰을 제공합니다.

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저자는 그들의 지원을 위해 Izon 과학 (주) 감사합니다. 이 연구는 연구 (PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio)에 대한 유럽위원회 (European Commission)에 의해 지원되었다.

1. 트윈 20 (PBST) 완충액으로 포스페이트 완충 염수 만들기 <ol><li> 200 ml의 탈 이온수 (18.2 MΩ cm)을 하나의 정제 PBS (0.01 M 인산염 완충액, 0.0027 M 염화칼륨, 0.137 M 염화나트륨, pH 7.4의)을 녹인다. </li><li> 계면 활성제로 200 ㎖의 완충 용액 100 μL (0.05 (v / v)의 %) 트윈 (20)를 추가합니다. </li></ol> 2. 카르 복실 폴리스티렌 입자 표준을 준비 <ol><li> 단 분산 입자를 만들 80w에서 2 분 동안 초음파 처리 전 30 초 동안 교정 입자 소용돌이. </li><li> 30 초 동안 PBST 버퍼 소용돌이에 1 × 10 입자 / ml의 농도로 조정 입자 (100)에 제 1 희석. </li></ol> 3. 준비 스트렙 타비 딘 코팅 입자 <ol><li> 단 분산을 보장하기 위해 80w에서 2 분간 초음파 전에 30 초 동안 입자를 소용돌이. </li><li> AC에 PBST 버퍼 (100)에서 스트렙 타비 딘 코팅 입자를 1 희석30 초에 대한 결과 1 × 9 입자 / ml의 농도와 소용돌이를 hieve. 참고 : 일반적인 샘플 볼륨이 200 μL입니다. 예를 들면, 조사하는 경우 다섯 DNA 농도는 희석 된 스트렙 타비 딘 코팅 입자를 1 ㎖를 준비한다. </li></ol> 올리고 뉴클레오티드 4. 제조 <ol><li> 100 μM의 결과 농도로 탈 이온수로 올리고 뉴클레오티드를 복원합니다. </li></ol> 스트렙 타비 딘 코팅 입자에 캡처 프로브 (CP) DNA 5. 추가 <ol><li> DNA 결합 이전에, 와류 80w에서 2 분간 초음파 처리 한 다음 30 초 동안 스트렙 타비 딘 코팅 된 입자 (200 μL 샘플 량). </li><li> 보조 장비 (4352 pmol의 ㎎ /)에 의해 제공되는 결합 용량에 기초하여, 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140, 210 나노 DNA의 얻어진 농도에 대한 입자에 DNA의 적절한 농도를 추가한다. </li><li> 실온에서 회전 바퀴에 10 초와 장소에 대한 샘플을 와동DNA를가 스트렙 타비 딘 - 바이오틴 상호 작용을 통해 입자 표면에 결합하는 30 분을 허용하기 위해. </li><li> 캡처 DNA를 첨가하고, 스트렙 타비 딘 코팅 된 입자와 함께 배양 한 후, 30 분 동안 자기 랙 상에 샘플을 배치하여 자기 분리를 통해 용액에 과량의 DNA를 제거한다. </li><li> 자석에 가장 가까운 입자의 새로 형성된 클러스터를 방해하지 않도록주의하면서 상층 액을 제거하고 새로운 PBST 버퍼의 동일한 볼륨으로 교체합니다. </li></ol> 6. CP 입자 상보 DNA 혼성화 <ol><li> 도달 한 결합 가능한 최대 목표를 위해 (500 nm에서 초과) 대상 DNA의 필요한 양을 추가합니다. </li><li> 볼텍스 30 분 동안 실온에서 회전 바퀴 10 초 및 장소 샘플. </li><li> 혼성화가 완료된 후 30 분 동안 자기 랙 상에 샘플을 배치하여 자기 분리를 통해 과량의 표적 DNA를 제거한다. </li><li> 상층 액을 제거주의하면서 자석에 가장 가까운 입자의 새로 형성된 클러스터를 방해하고, 새로운 PBST 버퍼의 동일한 볼륨으로 대체 할 수 없습니다. </li><li> 반복 중복 샘플 6.1 6.4 단계 및 DNA 혼성화 회 조사 실온에서 16 시간 동안 회전 휠이 샘플을 놓는다. </li></ol> 7. TRPS 설치 <ol><li> 대신에 소프트웨어를 컴퓨터 시스템에 기기를 연결합니다. </li><li> 캘리퍼스를 사용하여 초기 스트레칭을 보정합니다. <ol><li> 두 개의 평행 한 턱의 외측 사이의 거리를 측정한다. </li><li> &#39;장비 설정&#39;탭에서 &#39;스트레칭&#39;필드에서 스트레칭을 입력하고 탭 아래 &#39;스트레칭 교정&#39;을 클릭하여 소프트웨어에 입력. </li></ol></li><li> 옆으로 나노 기공의 ID 번호가 위로 향하게하여 턱에 분석을 위해 적절한 크기의 폴리 우레탄 나노 기공 막에 맞게. 그 후, 분석은 사용에 필요한 신장에 조우 스트레칭악기의 측면에 스트레치 조정 핸들입니다. (43)와 48mm 사이의 턱을 스트레칭. 참고 : 스트레칭의 정확한 값은인가 전압과 함께 결정된다 교정 입자 봉쇄의 크기가 적어도 0.3 nA의를 그래서. 스트레칭은 이미 단계 7.2 소프트웨어에 입력하고 턱이 신장 될 때 자동으로 조정됩니다. </li><li> 보장, 나노 기공 아래, 낮은 유체 셀에 PBST 버퍼의 80 μl를 놓고 측정에 영향을 미칠 수있는 기포가 없습니다. 거품이 볼 수있는 경우 제거하고 버퍼를 교체합니다. </li><li> 제자리에 상부 유체 셀을 클릭하고 그것으로 버퍼의 40 μl를 놓고 다시 보장 기포가 존재가 없습니다. 기포가 상부 유체 세포에 존재하는 경우, 액체를 교체하여이를 제거한다. </li><li> 재현성 기준 전류 버퍼 상부 유체 셀 교체로부터 도달하면, ST &#39;를 클릭하여 상부 유체 셀 측정하는 시료의 40 μL를 추가소프트웨어 화면에서 데이터 수집 &#39;탭&#39;에 &#39;예술. 참고 :이이 &#39;분석한다 데이터&#39;탭을 통해 소프트웨어를 사용하여 변경 될 수 있지만 데이터 수집이 ( &#39;분석 설정&#39;과 &#39;저항 봉쇄&#39;아래), 0.05 nA의의 봉쇄 크기 하한 50 kHz의 주파수에서 완료 . </li><li> 측정에 전기적 배경 잡음을 줄이기 위해 상기 유체 전지 시스템의 맨 위에 패러데이 케이지를 놓는다. </li><li> 샘플에 압력 또는 진공을 적용 할 변수 압력 모듈 (VPM)를 사용합니다. <ol><li> 외부 압력이 상부 유체 셀에 노즐을 연결 적용하려면 다음 압력 팔을 회전 (양압 (PRE) 또는 진공 (VAC)이 적용됩니다 여부에 따라) 위치에 클릭합니다. </li><li> VPM의 상단에 위치한 압력 단계 노브를 사용하여 &#39;cm&#39;또는 &#39;mm&#39;규모에 압력을 적용합니다. t &#39;cm&#39;규모에 압력을 위쪽으로 당겨 아래로 노브를 누르면O를 &#39;mm&#39;규모에 압력을 적용합니다. </li></ol></li></ol> TRPS 분석 8. 준비 샘플 <ol><li> 이전 TRPS 분석에 80w에서 2 분 30 초와 초음파 처리를위한 소용돌이 샘플. </li></ol> 9. 제타 분석을위한 나노 기공 보정 <ol><li> 상부 유체 세포 내로 40 μL 교정 입자 (1 × 10 입자 / ㎖)를 배치 한 후, (3)이인가 전압에 (7에서와 같이 셋업)을 TRPS 측정을 완료. &#39;-&#39;버튼을 전압 규모에 소프트웨어의 &#39;장비 설정&#39;탭에서 &#39;+&#39;를 클릭하여 전압을 변경합니다. </li><li> nA의를 3 전압이 약 (140), (110)의 배경 전류를 반환 할 것을 확인하고 80. 중간 전압 교정 입자가 적어도 0.3은 Na 평균 봉쇄 크기를 생산하고 있는지 확인합니다. </li><li> 교정 입자의 평균 전체 폭 절반 최대 값 (FWHM) 기간 적어도 그래서 압력을 적용0.15 밀리 초. 수동 변압 모듈에 연결된 압력 아암을 이용하여 이렇게. 가 원하는 위치에 클릭하고 그에 따라 단계 7.8.2에서 지침을 설정, 다음이 적용됩니다 때까지 팔을 회전하여 선택 압력 (PRE) 또는 진공 (VAC). 이러한 조건이 달성 된 후에는 &#39;정보 수집&#39;탭에서 소프트웨어의 &#39;시작&#39;을 클릭하여 실행을 시작합니다. </li><li> 최소 500 입자 (측정하는 동안 소프트웨어 화면 하단의 &#39;입자 수를&#39;참조)로 측정되었으며 실행이 30 초를 초과 할 때 &#39;(참조&#39;데이터 수집 &#39;탭에서&#39;정지 &#39;를 눌러 실행을 완료 또한 화면의 아래쪽으로 실행 시간 &#39;). </li><li> 새로운 나노 기공이 도입 될 때마다 설명 또는 단계 9.1-9.4를 완료하여 분석의 각각의 새로운 하루로 보정 실행을 완료하여 시스템을 보정합니다. </li></ol> (10) 샘플을 실행 <ol><li> 최고에서 샘플을 실행하거나비슷한 (± 10 nA의)를 보장에서 교정 샘플로 두 번째로 높은 전압, 그렇지 않은 경우 동일 기준 전류. <ol><li> 적절한 기준 전류가 달성되면, 시료 40 μL와 상부 유체 셀에 전해질을 대체. 시료가 도입되는 경우, 봉쇄는 신호 트레이스 알 수있을 것이다. &#39;데이터 수집&#39;탭에서 &#39;시작&#39;을 클릭하여 실행 샘플을 시작하고 500 입자의 최소 기록 (신호 트레이스 아래에 위치한 &#39;입자 개수&#39;를 점검) 및 동작 시간을 보장하는 30 초 최소이다 ( &#39;실행을 참조하십시오 또한 신호 트레이스 아래에 위치 시간 &#39;). </li><li> 측정을 완료하려면 &#39;데이터 수집 탭&#39;에서 &#39;정지&#39;를 클릭하고 데이터 파일을 저장합니다. </li></ol></li><li> 파일, 입력 다음과 같은 형식의 파일 정보를 저장하려면; &#39;조사&#39;는 파일에 저장 될 폴더, &#39;나노 기공 ID&#39;는 기공의 일련 번호가 나는, &#39;부품 번호&#39;를 사용하고있다샘플을 희석 한 경우 &#39;희석&#39;사용이 교정 또는 샘플 측정,인지 &#39;교정 또는 샘플&#39;세부 기공의 유형 (즉, NP150 / NP200)은, &quot;샘플 ID &#39;는 샘플의 이름 S ( 샘플을 희석 한 경우 (100)를 입력 100 배) &#39;압력&#39;는 cm의 샘플에 가해진 압력 (인 - 섹션 7.8 참조), &#39;전해질 ID&#39;는 상기 샘플에서 만든 버퍼의 이름이고, 그리고 &#39; 참고 &#39;샘플 또는 실행에 대한 개인 노트입니다. </li><li> 각 샘플의 실행 사이까지 (-5 cm (진공), 5, 10 cm (양압) -10- 통상) 상부 유체 세포로 수회 PBST 40 ㎕의 버퍼를 배치하고 다양한 압력을 적용하여 시스템을 씻어 더 이상 봉쇄 이벤트가 시스템에 남아있는 잔여 입자와 샘플 사이 따라서없이 교차 오염이 없을 보장 존재한다. 각각의 반복 샘플 사이에 완성 된이 세척 단계와 세중의 실행 샘플을 아로 실행다른 샘플 사이와 같은 리터. </li></ol>

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<html> 제타 전위의 계산 Arjmandi 외. 21 일에 관련된 보정 기반 방법을 사용 하였다. 입자의 전위의 길이가 나노 기공이 규칙적 원추형 구멍의 전체에 걸쳐 평균 전계 입자의 속도를 이용하여,인가 전압의 함수로서 측정된다 이송있다. 전기 영동 이동성 감지 영역 길이의 제곱 L 곱한 전압에 대한 (T는 봉쇄 기간 임) 1 / T의 유도체이다. 감지 영역을 통해 다수의 기준 포인트의 평균 속도는이 방법을 사용하여 제타 전위를 계산하는데 최소한의 에러를 허용하도록 측정된다. 기공의 보정은 감지 지역에서 각 기준점에서의 전압, V, 대 1 / T의 선형성에 기초한다. 교정 및 샘플 입자들의 동전 기적 입자 속도,업로드 / 54577 / 54577eq2.jpg &quot;/&gt;와 <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/54577/54577eq3.jpg" /> 각각 자신의 ...

기능화 나노 입자는 의료 및 환경 분야 모두에서 바이오 센서로 점점 더 인기를 끌고있다. 능력은 예를 들어 표적 약물 전달 시스템 (1) 및 감시 DNA 단백질 상호 작용 2-4 유용 증명, DNA와 나노 입자의 표면 화학을 변경한다. 점점 일반적인 나노 입자의 특성은 생물 검정에서 활용 및 치료제의 전달에 초상 자성 5된다. 초상 자성 입자 (SPPS)를 식별하고 복잡한 혼합물에서 특정 분석을 제거하는데 매우 유용하며, 하나의 자석의 간단한 사용하여 수행 할 수 있습니다. 일단 제거 된 분석 결합 된 입자는 특징과 목적에 맞는 분석 할 수 있습니다. 나노 입자의 검출 및 특성화에 사용되는 이전의 방법은 달리 광자 상관 분광법으로 알려진 동적 광산란 (DLS) 등의 광학 기법을 포함한다. 안녕하세요 있지만GH 처리량 기술, DLS이 평균을 기반으로 기술되고 그리고 전문 소프트웨어의 추가없이 복합 시료를 분석하는 경우에 한정되어, 더 큰 입자는 -6,7- 완전히 알려지지 작은 입자의 일부를 남겨, 훨씬 더 우세 신호를 생성한다. 입자가 입자의 특성화 기술은 따라서 더욱 바람직한 나노 입자 및 나노 입자의 작용 화 시스템을 분석한다. RPS 기반 기술은 시료에 전기장을인가하고, 합성 또는 생물학적 나노 기공을 통해 입자의 반송기구를 감시를 기반으로한다. RPS에 기초한 비교적 최근 나노 검출 및 특성화 기법은 가변 저항 펄스 센서 (TRPS) 8-16이다. TRPS는 엘라스토머, 가변 기공 막에 의해 분리 된 두 개의 전극 시스템이다. 파장 가변 세공 방법은 트랜스를 통해 측정되는 도형 (17)의 크기의 범위의 분석을 허용기공을 통해 포트 메커니즘. 동조 기공 종전에는 투과형 전자 분광법 (TEM) (10)과 같은 다른 기술들에 비교 결과를 생성하는 작은 입자의 검출 (70 내지 95 nm의 직경)에 사용되어왔다. 전기장이인가되면, 이온 전류가 관찰되는 입자 / 분자가 공극을 통과 할 때, 이들은 일시적 &#39;봉쇄 이벤트&#39;로 정의 될 수있는 전류의 감소를 일으키는 원인이되는 기공을 차단. 샘플 내의 각각의 입자 특성을 개별적으로 봉쇄 진폭, Δ에 기초 할 수 있도록 각 차단 이벤트는 하나의 입자의 대표 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54577/54577eq1.jpg" /> 및 반값 폭, FWHM뿐만 아니라 다른 차단 특성. 그들은 나노 기공을 통과 할 때 개개의 입자를 분석하는 것은 입자 아몬 크기의 TRPS가 성공적으로 효과적으로 범위를 구별 할 수있는 복합 샘플에 유리하다하나의 샘플을 GST. 조정 저항 펄스 감지 크기 10, 단일 실행에서 동시에 제타 전위 12, 18, 20, 22 및 농도 (15) 측정을 완료하고 여전히 비슷한 샘플을 차별화 따라서 할 수있는 경우에 그 표면 전하 (19)에 의해하지 같은 크기; 대안 사이징 기술을 통해 장점. 제타 전위는 전단 (20)의면에 정전 전위로 정의되며, 그들은 기공 (19)로 이동할 때 입자 속도로부터 계산된다. 개별 입자의 제타 전위 측정 따라서 전위기구 및 솔루션의 나노 입자 시스템, 응용 프로그램의 범위에 대한 나노 입자 분석 디자인의 미래를위한 가치있는 정보의 행동에 대한 통찰력을 제공합니다. 이러한 자연의 입자에 의해 입자 분석은 또한 오 자세한 내용은 허용 표본 집단 사이에 확산 및 제타 전위 값의 분포를 탐험 할 수 있습니다용액 N의 반응 속도 (예를 들어, 이중 가닥 DNA를 단일 가닥) 및 입자 안정성이 달성된다. 여기서 우리는 감지하고 수정되지 않은 및 DNA 변성 SPP 표면 모두를 특징 짓는 기술을 설명합니다. 여기에 기술 된 프로토콜은 무기 나노 입자와 생체의 범위에 적용 할 수 있지만,이 때문에 애플리케이션들은 광범위한 DNA 변성 표면을 사용하는 절차를 보여준다. 이 기술은 사용자에 따라서 입자 전좌 기공 시스템을 통해 속도 및 제타 전위에 기초하여, 나노 입자 표면 상에 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 표적을 구별 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td> <td>Sigma Aldrich, UK</td><td>P4417</td><td>1 정제 200&nbsp; 완충 용액을 만들기 위한 ml 탈이온수.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>P1379</td><td>0.05% (v/v) PBS 완충액 계면활성제</td></tr><tr><td>Carboxyl 폴리스티렌 나노 입자</td><td>Bangs Laboratories, US</td><td>CPC200</td><td>공칭 직경 220&nbsp; nm, 1 x 1012 입자/ml의 원시 농도, 86 &micro의 비표면 전하; eq/g(표면 전하 밀도 3.2 x 1019 C/nm2와 동일).</td></tr><tr><td>Streptavidin 코팅 나노 입자</td><td>Ademtech, France</td><td>3121</td><td>Batch는 1.1 x 1011 입자/ml의 원시 농도에서 4,352 pmol/mg(188 nM 이론적 DNA 결합 용량)의 결합 용량을 가졌습니다.</td></tr><tr><td>비오틴화 올리고뉴클레오티드</td><td>Sigma Aldrich, 영국</td><td>VC00001</td><td>공급업체 사양: 역상 1 정제(0.05 스케일); 3' 말단에서 비오틴 변형; 동결 건조된 분말은 100&nbsp로 재구성되었습니다. &마이크로; M 탈이온수를 사용하고 필요에 따라 희석합니다. 서열: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC
GCGTGGC[Btn]3'</td></tr> <tr><td>표준 올리그노뉴클레오티드</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>VC00001</td><td>공급업체 사양: 역상 1 정제(0.05 스케일); 동결 건조된 분말은 100 &micro로 재구성되었습니다. M 탈이온수를 사용하고 필요에 따라 희석합니다. DNA 표적의 서열: 완전 상보적 - 5'GCCACGCGTAGTGA
GGTTTAACCAT3', 중간 바인딩 - 5'GTAGTGAGGT3', 말단 바인딩 - 5'GTTTAACCAT3', 부분 보완 돌출 - 5'GTGAGGTTTAACCAT
TTTTTTTTTTTTTTT3'.</td></tr><tr><td>Izon qNano</td><td>Izon Science, NZ</td><td></td><td>시스템에 대한 고유 압력 47&nbsp; Pa</td></tr><tr><td>Izon 가변 압력 모듈(VPM)</td><td>Izon Science, NZ</td><td></td><td>압력의 각 'cm'는 약 100Pa에 해당합니다.</td></tr><tr><td>폴리우레탄 나노포어 멤브레인</td><td>Izon Science, NZ</td><td>NP150</td><td>분석물 크기 범위 60-480 nm, 기공 직경은 45 mm 스트레치에서 799 nm로 계산됩니다.</td></tr><tr><td>Magrack 6</td><td>GE Healthcare, 영국</td><td>28-9489-64</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Bath</td><td>Fisher Scientific, 영국</td><td>10692353</td><td>80 와트</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>IKA, 독일</td><td>0003365000</td><td></td></tr><tr><td>로터리 휠&nbsp;</td><td>Labnet International, 미국</td><td>H5500-230 V</td><td></td></tr></tbody></table>

조정 나노 기공을 통해 나노 입자 전좌 속도를 통해 제타 전위의 측정 : 예를 들어 dna 변성 입자를 사용하여

Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example

저항 펄스 센서 (RPS)로 총칭 알려진 나노 기공 기술, 탐지, 정량화 및 단백질 분자와 나노 입자의 특성을 사용하고있다. 조정 가능한 저항 펄스 센서 (TRPS)는 실시간으로 변경 될 수있는 조정 가능한 공극을 포함 RPS 비교적 최근에 적응된다. 그들은 DNA 농도 및 구조의 함수로서 가변 기공 멤브레인을 통과 여기 우리 DNA 변성 나노 입자의 전위의 시간을 모니터링하는 TRPS를 사용하여 (즉, 단일 쇄 이중 가닥 DNA)이다. TRPS는 전계인가시 안정한 이온 전류를 설정 엘라스토머 기공 막에 의해 분리 된 두개의 Ag / AgCl을 전극에 기초한다. 각종 광학 기반 입자 특성 기술과 달리, TRPS는 복합 샘플 용이하게 분석 할 수 있도록하는 샘플 모집단 중에서 개개의 입자를 특성화 할 수있다. 여기, 우리는 제타 전위 측정을 보여공지 된 표준 입자 전위 속도 통해 따라서 이러한 분석의 제타 전위 측정 결과 피검 전좌 회 샘플링이 적용. 뿐만 아니라 평균 제타 전위 값을 획득하는 등, 샘플은 모든 예를 들어, 샘플 인구 분포를 통해 주어진 샘플에 대한 자세한 정보를 나타내는 입자에 의해 입자의 관점을 사용하여 측정하고 있습니다. 이러한 가운데,이 방법은 모두 의료 및 환경 분야에 대한 감지 애플리케이션 내에서 가능성을 보여줍니다.

<img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54577/54577fig1.jpg" /> 자기 정화 및 TRPS 측정 공정의 도식 표현도. 샘플을 함유하는 과량의 비 결합 캡쳐 프로브 DNA. B)로 시작 샘플 자기 정제) 실시 예는 측정 예를 TRPS I) 입자 일시적인 감소를 일으키는 나노 기공을 통과 II) 봉쇄 이벤트 세공의 입자를 일시적으로 폐색 이온으로부터 제조 전류; 입자 전위의 속도를 계산하는 데 사용되는 정보입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54577/54577fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 모든보고하지 같이 ...

여기에서는 개개의 나노 입자의 제타 포텐셜을 결정하는데 사용될 수있다 입자 전위 속도의 측정을 통해 나노 입자의 표면 화학을 특징 저항 펄스 감지 기술에 통합 된 폴리 우레탄 동조 나노 기공을 사용한다.

조정 나노 기공을 통해 나노 입자 전좌 속도를 통해 제타 전위의 측정 : 예를 들어 DNA 변성 입자를 사용하여

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and ...

본 절차의 전반적인 목적은 조정 가능한 저항 펄스 센싱(tunable resistant post sensing, TRPS)을 사용하여 나노 입자의 표면 화학적 특성을 분석하고, 해당 물질의 제타 전위(zeta potential)를 결정하는 것입니다. 이는 DNA로 변형된 나노 입자의 특성 분석을 통해 입증됩니다. 이 방법은 나노 물질의 특성 분석과 바이오어세이 개발의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 입자별 분석을 완료할 수 있다는 점입니다. 각 DNA 입자 신호는 제타 전위 측정값으로 변환되어, 분석 중인 시료에 대한 전체적인 정보를 제공합니다. 기존 방식은 물질 특성 분석에 대한 통찰을 제공할 수 있었습니다.또한 세포, 바이러스, DNA 및 단백질 검출을 위한 바이오어세이 개발과 같은 다른 응용 분야에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 단순히 시료를 주입하고 결과를 기다리는 방식이 아니기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 과학자의 어느 정도의 개입이 필요하기 때문입니다.이 절차를 시작하기 위해, 단분산성을 확보할 수 있도록 스트렙타비딘 코팅 입자를 30초 동안 볼텍싱한 후 80 W에서 2분간 초음파 처리하십시오. 스트렙타비딘 코팅 입자를 PBST 버퍼로 100배 희석하여 최종 농도가 1×10⁹ particles/mL가 되도록 합니다. 그 다음 입자를 30초 동안 볼텍싱하십시오.입자에 대한 DNA의 적절한 농도에서 mg당 4,352 picomols의 결합 용량을 기준으로 하여, 최종 농도가 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 및 210 nanomolar가 되도록 조절합니다. 샘플을 10초 동안 볼텍싱한 후, streptavidin-biotin 상호작용을 통해 DNA가 입자 표면에 결합할 수 있도록 상온의 로터리 휠에서 30분 동안 반응시킵니다. 포획된 DNA를 입자와 함께 첨가하고 배양한 후, 샘플을 마그네틱 랙에 30분 동안 놓아 자기 분리 방식으로 과량의 DNA와 용액을 제거합니다.그 다음, 자석에 가장 가까이 형성된 입자 집합체가 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다. 그런 다음 상층액을 동일한 부피의 신선한 PBST 버퍼로 교체합니다. 이제 각 샘플에 필요한 양의 표적 DNA를 첨가하여 가능한 최대의 표적 결합이 이루어지도록 합니다.샘플을 10초 동안 볼텍싱합니다. 그리고 실온의 로타리 휠에 30분 동안 둡니다. 하이브리드화가 완료되면, 샘플을 자석 랙에 30분 동안 놓아 자기 분리를 통해 과잉 타겟 DNA를 제거합니다.다음으로, 자석에 가장 가까이 형성된 입자 클러스터가 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다. 그런 다음 상층액을 동일한 부피의 신선한 PBST 버퍼로 교체합니다. 중복 시료에 대해 이전 단계들을 반복한 후, DNA 하이브리드화 시간을 조사하기 위해 시료를 상온의 회전 휠에 16시간 동안 둡니다.이 단계에서 소프트웨어가 설치된 컴퓨터 시스템에 TRPS 기기를 연결하십시오. 캘리퍼스를 사용하여 두 평행 죠(jaw) 외측 사이의 거리를 측정합니다. 기기 설정 탭의 stretch 필드에 해당 거리를 입력하고, 탭 아래의 calibrate stretch를 클릭하십시오.그 다음, 분석에 적합한 크기의 폴리우레탄 나노포어 막을 나노포어 ID 번호가 위를 향하도록 죠(jaws)에 측면으로 장착합니다. 그런 다음 기기 측면에 있는 신축 조절 핸들을 사용하여 분석에 필요한 만큼 죠를 늘려줍니다. 나노포어 아래의 하단 유체 셀에 80 µL의 PBST 완충액을 넣고, 측정에 영향을 줄 수 있는 기포가 없는지 확인합니다.이제 상단 유체 셀을 클릭하여 제자리에 고정하고, 기포가 생기지 않도록 주의하며 버퍼 40 µL를 추가합니다. 그런 다음 시스템 위에 패러데이 케이지를 씌우고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 외부 압력을 가합니다. 상단 유체 셀에 보정 입자 40 µL를 넣은 후, 세 가지 인가 전압에서 TRPS 측정을 완료합니다.소프트웨어의 기기 설정 탭에 있는 전압 스케일의 플러스 및 마이너스 버튼을 클릭하여 전압을 변경하십시오. 세 가지 전압에서 적절한 배경 전류가 돌아오는지 확인하십시오. 또한 중간 전압에서 캘리브레이션 입자가 최소 0.3 nanoamperes의 평균 차단 크기를 생성하는지 확인하십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 조건이 충족되면, 데이터 획득 탭의 소프트웨어에서 start를 클릭하여 실행을 시작하십시오. 측정을 완료하려면 데이터 획득 탭에서 stop을 클릭하고 데이터 파일을 저장하십시오. 캘리브레이션 입자를 40 µL의 PBST 버퍼로 교체하여 상단 유체 셀을 여러 번 세척함으로써 시스템을 세척하십시오.더 이상 블로케이드(blockade) 이벤트가 나타나지 않을 때까지 다양한 압력을 가하여 잔류 입자가 없고 교차 오염이 발생하지 않았음을 확인합니다. 적절한 기선 전류(baseline current)가 확보되면, 상부 유체 셀의 전해질을 40 µL의 샘플로 교체합니다. 데이터 획득 탭에서 시작(start)을 클릭하여 샘플 런을 시작합니다.최소 500개의 입자를 기록하고 측정 시간이 최소 30초가 되도록 하십시오. 측정을 완료하려면 데이터 획득 탭에서 정지(stop)를 클릭하고 데이터 파일을 저장하십시오. 아무런 수식을 가하지 않은 streptavidin 코팅 입자와 표면에 단일 가닥 DNA를 포화시킨 streptavidin 코팅 입자의 크기 및 제타 전위 분석 예시가 여기에 표시되어 있습니다.두 샘플의 크기는 비슷했지만, DNA가 입자 표면에 기능화되었을 때 제타 전위는 유의미하게 달랐으며 훨씬 더 컸습니다. 스트렙타비딘이 코팅된 입자에 하이브리드화된 DNA 농도가 가장 낮고 높은 샘플에 대해 나타난 크기 및 제타 전위 데이터가 여기에 표시되어 있습니다. 더 높은 농도의 DNA와 하이브리드화된 입자에서 더 큰 제타 전위 값이 기록되었습니다.포획 프로브 DNA 단독, 완전 상보적 DNA 타겟, 중간 결합 DNA 타겟, 말단 결합 DNA 타겟 및 오버행 DNA 타겟에 대해 측정한 제타 전위의 변화가 여기에 표시되어 있습니다. 숙련되면 이 기술은 적절히 수행했을 때 20분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 샘플 간의 교차 오염을 방지하고 나노포어 막힘을 예방하기 위해, 각 교정 및 샘플 측정 사이에 나노포어를 철저히 세척하는 것이 중요함을 기억하십시오.이 기술의 개발 이후, 바이오센서 분야의 연구자들은 다중 분석법(multiplex assays)을 통해 단백질-단백질 및 단백질-DNA 상호작용을 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다. 이 영상을 시청하고 나면 TRPS를 사용하여 제타 전위를 측정하는 방법과 바이오 분석을 위해 DNA가 수식된 입자를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

determination-zeta-potential-via-nanoparticle-translocation

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

무기 표면에 단백질이 아닌 구체적인 흡착을 모니터링하는 고체 nanopores를 사용하는 방법을 설명합니다. 방법은 실시간과 단일 분자 수준에서 탐색할 수 흡착 수있게 저항 펄스의 원칙을 사용합니다. 하나의 단백질 흡착 과정 멀리 평형에서이기 때문에, 우리는 양적 단백질 흡착의 상수 명백한 처음 주문 반응 속도의 결정뿐만 아니라 및 Langmuir 흡착 상수 사용, 합성 nanopores의 병렬 배열의 고용을 제안합니다.

고체 Nanopores와 모니터링 단백질 흡착

nanoparticle 추적 분석 (NTA)와 고분자 유전자 전달 나노 입자를 평가하기 위해 높은 처리량 유동 세포 계측법에 대한 프로토콜이 설명되어 있습니다. NTA는 nanoparticle 입자 크기 분포와 플라스미드 당 입자 분포를 특성화하기 위해 사용됩니다. 높은 처리량 유동 세포 계측법은 유전자 전달 biomaterials의 라이브러리에 대한 양적 transfection 효율 평가를 할 수 있습니다.

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

생명 전좌 실험 용액에 고체 상태의 나노 기공을 제조하는 방법이 제시된다. 높은 전기장의 짧은 펄스를인가함으로써, 나노 기공 직경이 나노 미터 이하로 제어 정밀도로 확대 될 수 있고 그 전기적 잡음 특성이 크게 개선되었다. 이 절차는 실험 조건 하에서 표준 실험실 장비를 사용하여 반응계 내에서 수행된다.

크기를 미세 조정 및 고체 나노 세공의 잡음을 최소화

제시된 프로토콜은 공극 스패닝 무용매 지질 이중층을 사용하여 단일 수송체 수준에서 막 단백질 매개 수송을 분석하는 방법을 설명합니다. 이는 대단히 병렬적인 데이터 수집 및 분석과 결합된 대량 생산된 나노포어 어레이 칩을 생성함으로써 달성되며, 향후 멤브레인 단백질 이펙터 스크리닝의 확립을 가능하게 합니다.

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

우리는 폴리디메틸실록산(PDMS)에서 두 마이크로채널 사이에 나노유체 접합을 생성하기 위해 실리카 콜로이드 나노입자의 간단한 자기 조립 기술을 제안합니다. 이 기술을 사용하여 기공 크기가 ~45nm인 나노다공성 비드 멤브레인을 마이크로채널 내부에 구축하고 DNA 샘플의 동전기 사전 농축에 적용했습니다.

콜로이드 입자의 자기 조립 과정을 통해 PDMS 미세 유체 칩의 하위 50 Nm의 나노 유체 접합 만들기

Semiflexible 폴리머 생명체가 광범위 하 게 적용 되는 독특한 기계적 속성을 표시 합니다. 그러나, biopolymers에 대 한 체계적인 연구는 폴리머 강성 같은 속성은 액세스할 수 없습니다 이후 제한 됩니다. 이 원고는이 제한 프로그래밍 가능한 DNA 나노튜브, 강성 필 라 멘 트의 영향에 대 한 실험 연구를 활성화 하 여 우회는 어떻게 설명 합니다.

Semiflexible 고분자 공부를 다양 한 도구로 DNA 나노튜브

이 프로토콜 자석 입자의 합성 및 역동적이 고 전기 이동 산란을 통해 그들의 DNA 바인딩 속성의 평가 설명합니다. 이 방법은 그들의 증가할수록 입자 크기에서 변화를 모니터링에 집중 하 고는 입자 표면의 제타 전위 주요 바인딩에 DNA와 같은 재료의 역할.

역동적이 고 전기 이동 산란 분석 바인딩 DNA-마그네틱 입자

여기서, 우리는 생물학적 나노기공 기반 전자 플랫폼을 사용하여 단일 분자 한계에서 이산 금속 산소 클러스터, 폴리옥소메탈레이트(POMs)를 검출하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 이러한 분자의 연구에 사용되는 전통적인 분석 화학 도구에 대한 보완적인 접근법을 제공합니다.

단일 금속 나노 입자의 고분해능 물리적 특성화

여기, 선물이 폐쇄 형 무선 nanopore 전극의 제조 및 단일 나노 입자 충돌의 후속 전기 측정에 대 한 프로토콜.

단일 나노 입자 분석에 대 한 폐쇄-타입 무선 Nanopore 전극

여기에서는 최대 1.2kHz의 속도로 힘에 민감한 생체 분자에 대한 나노기계적 측정을 수행하는 고속 자기 핀셋 설정에 대해 설명합니다. 우리는 모델 시스템으로 DNA 헤어핀과 SNARE 복합체에 대한 적용을 소개하지만 기계 생물학적 사건에 관여하는 다른 분자에도 적용 할 수 있습니다.

힘에 민감한 요소에 대한 나노 역학 측정을 위한 고속 자기 핀셋

플라즈몬 나노핀셋은 금 나노 구조에서 국부적인 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 나노미터 규모의 광학 필드 내에서 단백질을 포함한 단일 나노 입자를 가둡니다. 산란 신호의 변화는 단백질의 존재와 구조적 역학을 드러내므로 형광단 변형이나 표면 테더링 없이 모니터링할 수 있습니다.

플라즈모닉 나노핀셋을 사용한 단일 비변형 단백질의 구조적 역학 모니터링

학습하세요 조정 가능한 저항성 펄스 감지(TRPS)를 사용하여 DNA 변성 나노입자의 표면 화학을 특성화하고 제타 전위를 측정하는 방법을. 이 기술은 개별 입자 분석을 통해 바이오어세이 개발에 필수적인 나노물질 특성화에 중요한 통찰을 제공합니다.

조정 나노 기공을 통해 나노 입자 전좌 속도를 통해 제타 전위의 측정 : 예를 들어 DNA 변성 입자를 사용하여

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