측정 체외 HIV-1 사전 통합 단지의 통합 활동

이 절차의 전반적인 목표는 HIV-1에 감염된 SupT1 세포에서 분리된 사전 통합 복합체(PIC)의 체외 통합 활성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 HIV 생물학의 몇 가지 주요 질문, 특히 특정 숙주 인자 및 바이러스 인자(예: 바이러스 캡시드)가 HIV-1 DNA 통합에서 어떤 역할을 하는지 해답할 것이며, 이를 통해 항레트로바이러스 요법을 위한 새로운 표적을 설계하거나 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 이 방법의 주요 장점은 in vitro에서 통합 활성을 측정하기 위해 상대적으로 적은 양의 사전 통합 복합체(pre-integration complex, PIC) 준비가 필요하다는 것입니다.

이 기술의 의미는 HIV-1 AIDS의 진단 및 치료로 확장될 수 있으며, 이는 이 기술의 초기 버전이 오늘날 임상적으로 사용되는 주요 항 HIV 약물 중 하나인 HIV-1 인테그라제 억제제의 발견에 중요했기 때문에 이 방법은 HIV-1 통합을 이해하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 그러나 RSV 및 MLV와 같은 다른 레트로바이러스를 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 시연하는 사람은 실험실의 박사 후 연구원인 Dr.Muthukumar Balasubramaniam이 될 것입니다. SupT1을 HIV-1에 감염시키려면 BSL-2 실험실에서 SupT1 세포를 Roswell Park Memorial Institute 또는 10%FBS 및 Pen-Strep이 보충된 RPMI 배지에서 10배에서 10배에서 6배 사이로 유지합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 높은 역가의 감염성 HIV-1을 생성한 후, 배양 플라스크에서 SupT1 세포를 풀링하고 피펫팅으로 잘 혼합한 다음 혈구계에서 트리판 블루 배제 염색을 사용하여 생존 가능한 세포 수를 측정합니다. 50 밀리리터 원뿔형 원심 분리 튜브에서 바이러스 감염 당 106 개의 세포를 8 번 분취 한 다음 500 배 g과 섭씨 25 도의 스윙 버킷 로터에서 5 분 동안 세포를 원심 분리합니다. 세포 배양 배지를 제거하지 않고 펠릿 세포가 들어있는 튜브를 추가 처리를 위해 BSL-3 실험실로 옮긴 다음 펠릿을 방해하지 않고 튜브에서 배지를 조심스럽게 흡입합니다.

다음으로, 30ml의 DNase I 처리 바이러스 접종물을 세포에 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 혼합한 다음 2개의 6웰 조직 배양 플레이트 사이에 혼합물을 고르게 분배합니다. Spinoculation을 위해 배양판을 플레이트 캐리어에 넣고 480배 g과 섭씨 25도에서 2시간 동안 스윙 버킷 로터에 원심분리기를 넣은 다음 섭씨 37도에서 5시간 동안 이산화탄소 5%로 세포를 배양합니다. 감염된 세포를 채취하여 용해하려면 각 감염에 해당하는 세포를 50ml 원추형 원심분리기 튜브에 모읍니다.

세포를 300배 g 및 섭씨 25도에서 10분 동안 원심분리한 다음 상등액을 조심스럽게 흡인하거나 피펫팅합니다. 잔류 바이러스 입자를 제거하려면 2ml의 버퍼 K 마이너스 마이너스를 추가하여 각 펠릿을 세척하고 샘플을 다시 회전시킨 다음 펠릿을 방해하지 않고 세척을 한 번 더 반복하기 전에 흡인 또는 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 마이크로피펫으로 잔류 완충액을 조심스럽게 제거한 후 얼음저온 용해 완충액 K plus plus를 사용하여 각 펠릿을 부드럽게 다시 현탁하고 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

세포질 사전 통합 복합체(PIC)를 준비하려면 실온에서 10분 동안 샘플을 흔든 다음 튜브를 섭씨 4도로 사전 냉각된 로터에 넣고 4분 동안 섭씨 1, 500배 g 및 섭씨 4도에서 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 새 마이크로 원심분리기 튜브에 조심스럽게 옮기고 1분 동안 16, 000회 g 및 섭씨 4도에서 회전합니다. 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브에 조심스럽게 옮긴 다음 RNase A를 밀리리터당 20마이크로그램의 최종 농도로 추가하고 내용물을 30분 동안 흔들지 않고 실온에서 배양합니다.

자당을 최종 농도 7%까지 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 잘 혼합한 다음 마이크로 원심분리기 튜브에서 PIC의 부분 표본을 준비합니다. 액체 질소에서 급속 동결하고 장기 보관을 위해 섭씨 80도의 음의 냉동고에 넣습니다. in vitro integration 또는 IVI assay에 사용되는 타겟 DNA를 준비하기 위해 맞춤형 프라이머 phiX174-Forward 및 phiX174-Reverse를 사용하여 PCR 혼합물을 조립하여 phiX174 플라스미드 DNA에서 2.0 kilobase 영역을 증폭하고 텍스트 프로토콜에 따라 프로그램을 사용하여 PCR을 수행합니다.

겔 정제 및 샘플 분취 후 200마이크로리터의 PIC에 600나노그램의 표적 DNA를 첨가합니다. 잘 섞어 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. SDS, EDTA 및 proteinase K를 첨가하여 IVI 반응을 중지한 다음 반응 내용물을 철저히 혼합하고 섭씨 56도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, IVI 반응에서 총 DNA를 정제하기 위해 탈단백질화된 샘플에 동일한 부피의 페놀을 첨가합니다. 볼텍싱과 원심분리기로 2분 동안 격렬하게 혼합합니다. 페놀 추출을 반복하기 전에 상부 수성상을 조심스럽게 제거하고 새 튜브로 옮긴 다음 동일한 부피의 페놀 클로로포름을 첨가하십시오.

와류로 샘플을 혼합하고 튜브를 2분 동안 원심분리한 다음 상부 수성상을 새 튜브로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 클로로포름으로 추출한 후 마이크로리터당 0.1마이크로그램의 글리코겐, 0.3몰의 아세트산나트륨 및 2.5부피의 얼음처럼 차가운 100% 에탄올을 첨가하여 수성상에서 DNA를 침전시킵니다. 튜브를 밤새 섭씨 영하 80도에 놓습니다.

다음날, 30 분 동안 16의, 000 시간 g 그리고 4 섭씨 온도에 표본을 분리기, 그 후에 주의깊게 펠릿 교란하지 않고 상등액을 제거하십시오. PIC 활성을 정량화하기 위한 PCR을 수행하려면 바이러스 LTR과 phiX174 DNA를 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 통합된 HIV-1 DNA의 접합부를 증폭하는 기존 PCR의 첫 번째 라운드부터 시작합니다. 여기에 설명된 대로 템플릿 DNA를 뺀 마스터 믹스를 조립한 다음 45마이크로리터 부분 표본을 별도의 PCR 튜브에 분주하고 5마이크로리터의 템플릿 DNA 또는 뉴클레아제 자유수를 대조군으로 추가합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 프로그램을 사용하여 열순환기에서 반응을 실행한 다음 두 번째 정량 PCR을 수행하고 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석합니다. 이 IVI 분석법에서 SupT1은 HIV-1 치료제인 DNAse와 HIV-1 인테그라제 억제제인 랄테그라비르(Raltegravir)의 부재 또는 존재를 이용하여 스핀 접종하였다. 배양 후, PIC를 분리하고 정제된 DNA를 분석하여 바이러스 DNA의 통합을 확인했습니다.

여기에서 볼 수 있듯이, HIV-1 PIC는 관련 바이러스 DNA를 표적 DNA에 강력하게 통합하고 PIC의 IVI 효율은 Raltegravir로 보충된 반응에서 크게 감소했으며, 이는 이 분석에서 측정된 HIV-1 인테그라제에 대한 통합 활성을 강력하게 암시합니다. 대조군 반응은 어떠한 적분 활동도 보이지 않았습니다. 또한, PCR의 첫 번째 라운드에서 Taq 중합효소를 배제한 대조군은 통합 산물을 증폭시키지 않았습니다.

특히, PIC 단독 대조군의 데이터는 중첩된 qPCR 전략이 통합 바이러스 DNA를 특이적으로 측정했지만 PIC 관련 바이러스 DNA는 측정하지 않았음을 나타냅니다. 이러한 데이터는 총체적으로 PIC 관련 통합 활동을 보여줍니다. 일단 마스터하면 PIC 활성을 정량화하기 위한 바이러스 준비 및 PCR 분석을 일주일 안에 완료할 수 있습니다.

SupT1 세포의 감염 및 감염된 세포로부터 PIC의 분리는 하루 만에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 HIV-1 PIC를 분리하고 체외 통합 활동을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 감염성이 높은 HIV-1 역가를 가지고 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 앞치마와 가운과 같은 보호복, 이중 장갑 및 보호 안경을 포함한 적절한 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.