Name: 측정 체외 HIV-1 사전 통합 단지의 통합 활동 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 학습하세요 HIV-1 사전 통합 단지(PIC)의 체외 통합 활성 측정 방법을 SupT1 세포를 이용하여. 이 기법은 항레트로바이러스 치료제 개발을 위한 새로운 표적 발굴에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 부분적으로 CD에 NIDA / NIH 보조금 DA024558, DA30896, DA033892 및 DA021471에 의해 지원됩니다. 우리는 또한 RCMI 부여 G12MD007586을 인정, 밴더빌트 CTSA는 UL1RR024975을 부여의 Meharry 중개 연구의 중앙에 NCRR / NIH의 NIMHD / NIH에서 U54 그랜트 MD007593, 그리고 테네시 CFAR 보조금 P30의 AI110527에서 (MeTRC) CTSA 부여 U54의 RR026140.

1. 바이러스 생산 참고 : 감염성 HIV-1의 높은 역가를 생성 활성화 된 덴드리머 기반의 형질 전환 시약을 사용하여 감염성 HIV-1 분자 복제와 인간 배아 신장 (HEK) 세포주 293T를 형질합니다. 이 인산 칼슘 트랜 스펙 션 방법은 유사한 결과를 얻을 수 있음이 관찰되었다. <ol><li> 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2) 실험실, 종자 8 10cm 접시 당 3 × 10 6 293T 세포 mL의 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 페니실린과 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM)의. 문화 37 ° C로 설정 배양기 5 %의 셀 CO 2 O / N. </li><li> 다음날, 각 10cm 접시에 세포를 형질 감염에 대한 혈청과 항생제가없는 DMEM 300 μL의 최종 볼륨에 pNL4-3 플라스미드 DNA (참조 자료 표)의 8 μg의 희석. 의 형질 전환 시약 80 μL를 추가 피펫으로 잘 혼합하고 실온에서 부화5 - 형질 전환 복합체 형성을위한 10 분. </li><li> 흡인하여 요리에서 배지를 제거하고 혈청과 항생제가 포함 된 신선한 DMEM의 접시 당 7 mL를 넣어. </li><li> , 트랜 단지에 DMEM 포함 된 혈청과 항생제 1 mL를 넣고 피펫으로 혼합하고, 세포 혼합물을 추가합니다. 조심스럽게 형질 단지의 균일 한 분포를 용이하게 접시를 소용돌이 친다. </li><li> 즉시 48 시간 동안 세포를 CO 2, 37 ℃, 5 %로 설정 인큐베이터에서 BSL3 실험실 배치하는 셀을 전송하고 배양. </li><li> 피펫을 이용하여 바이러스 - 함유 조직 배양 상등액을 수집 한 후 원심 분리 튜브로 옮긴다. 5 분 동안 300 × g으로 원심 분리는 세포 파편 펠렛 후, 0.45 ㎛의 공극 크기의 주사기 필터로 상청액을 필터링한다. </li><li> 이 무 세포 바이러스 제제의 임의 이월 플라스미드 DNA를 제거하기 위해 1 시간 동안 37 ° C에서 하나의 DNase (20 μg의 / mL)로 처리한다. </li><li> 을 정량화하기그것은 일상적인 사용 (22)에 대한 신속하고 의무 방법으로 HIV-1 역가,은 P24 특정 효소 면역 분석 (ELISA)를 사용합니다. 주 : P24 ELISA 물리적 역가 (바이러스 입자의 수)를 측정된다는 사실을 주목해야한다. 대안으로, 바이러스 관련된 RT 활동 (외인성 RT 분석) 또는 바이러스 감염 (TZM-BL 표시 세포주 계 감염성 분석)를 측정하는 감염성 바이러스 입자를 제외한 판독을 제공한다. </li></ol> 먹어 볼래요-T1 세포의 2. 바이러스 감염 (BSL3 실험실) <ol><li> BSL2 연구실에서 1 6 10 × 10 × 1.0 6 2.0 세포 / 로즈웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 10 % 열 - 불 활성화 FBS, 페니실린 보충 매체 및 스트렙토 마이신의 ㎖ (분할 비율 먹어 볼래요-T1 세포를 유지 : 2 매 2-3 D). 배양 플라스크로부터 섭-T1 세포 풀 피펫 팅하여 잘 혼합하고, 혈구 및 트리 판 블루 배제 성을 이용하여 생존 세포 수를 결정방법을 aining. <ol><li> 50 mL의 원뿔 원심 분리기 튜브에 (바이러스 감염 당) 80 × 10 6 세포의 분취 필요한 수를 준비합니다. </li><li> 500 XG에서 스윙 버킷 로터에서 세포를 원심 분리기, 5 분 동안 25 ° C. 세포 배양 배지를 제거하지 않고, 상기 처리를 위해 BSL3 실험실로 펠렛 세포를 함유하는 튜브에 옮긴다. 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고, 튜브로부터 세포 배양 배지를 흡인. </li></ol></li><li> 관의 세포의 DNase I 처리 된 바이러스 접종 물을 적당량 첨가하고 부드럽게 피펫 팅하여 잘 혼합한다. 80 × 10 6 세포의 경우, DNase의 I-처리 바이러스 (P24-해당하는 바이러스의 50 μg의) 30 ㎖를 사용합니다. 참고 : 기능 PICS는의 분리는 감염의 매우 높은 다중도 (MOI)와 표적 세포를 감염이 필요합니다. </li><li> 균일 즉이 6 잘 조직 배양 플레이트 (12 X 2.5 mL를 씩 사이의 혼합물을 배포, 감염되고 당이 판을 사용이온). </li><li> spinoculation를 들어, 스윙 버킷 480 XG에 로터와 2 시간 동안 25 ° C를 사용하여 플레이트 캐리어 원심 분리기의 문화 판을 놓습니다. </li><li> 5 시간 동안 CO (2)을 37 ° C에서 spinoculated 세포를 인큐베이션하고, 5 %. </li></ol> 감염된 세포의 3. 수확 및 용해 (BSL3 실험실) <ol><li> 한 50㎖ 원추형 원심 분리 튜브에 배양 플레이트에서 각각 감염에 대응하는 셀 (~ 총 30 ml)에 풀. </li><li> 300 × g으로 원심 분리하여 세포를 수확하고 10 분 동안 25 ° C. 조심스럽게 튜브에서 뜨는을 대기음 (또는, 피펫 사용). </li><li> 남아있는 바이러스 입자를 제거하려면 버퍼 K 2 ㎖를 추가하여 각각의 세포 펠렛을 씻어 - / - (150 밀리미터의 KCl, 20 mM의 HEPES, pH가 7.6, 5 밀리미터의 MgCl 2) 300 XG에 샘플 25 ° C에 대한 원심 분리 10 분. 그 후, 펠렛을 방해하지 않고, 조심스럽게 흡인에 의해 또는 피펫을 이용하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> Repeat 단계 3.3. </li><li> 조심스럽게 마이크로 피펫을 사용하여 남아있는 버퍼를 제거합니다. 빙냉 용해 완충액 K 2 ㎖에 각 세포 펠렛을 재현 탁 + / + (버퍼 K - / - 0.025 %의 디기 토닌, 1 mM의 DTT, 20 μg의 / ㎖ 아프로 티닌 보충) 부드러운 피펫 팅하여 내용물을 혼합하고, 편입 2 ML의 microcentrifuge 관. </li></ol> 세포질의 PICS는 4. 준비 (BSL3 실험실) <ol><li> 실온에서 10 분 동안 회전 진탕 기에서 샘플 락. </li><li> 1,500 XG에서, 4 ° C에 예비 냉각 로터와, 샘플을 원심 분리기 4 분 동안 4 ° C. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고, 신중 16,000 XG에서 새로운 microcentrifuge 관과 원심 분리기에 뜨는을 전송하고 1 분 4 ° C. </li><li> 조심스럽게 새로운 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. 30 분 (NO 요동)을 실온에서 20 μg의 내용 / ㎖ (찍어 2ml를 2 μL)의 최종 농도의 RNase A (20 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 배양한다. &lt;/ 리&gt; <li> 7 %의 최종 농도로 부드러운 피펫으로 잘 혼합 (- - / 버퍼 K에 w 60 % / v)의 크로스를 추가합니다. 액체 질소에서 동결 플래시 및 장소에서 -80 장기 보존 C 냉동기 °, 마이크로 원심 튜브에 분취 찍어 (예, 200 μL)를 준비한다. </li></ol> 체외 통합 5. (IVI) 분석 실험은 HIV-1 사진을 사용하여 <ol><li> 주문 제작 프라이머, phiX174-F와 phiX174-R을 사용하여 PCR로 phiX174 플라스미드 DNA에서 2.0 kb의 영역을 증폭하여 IVI 분석에 사용되는 타겟 DNA를 준비합니다. <ol><li> 표 1에 기재된 바와 같이 PCR 혼합물을 조립한다. 표 2에서 권장 열 사이클링 조건을 사용하여 열 순환기 PCR을 수행한다. (제조사 권장 프로토콜 다음) 겔 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 겔 - 정제하고, 사용시까지 -80 ℃에서 분취로 정제 된 타겟 DNA를 저장한다. </li></ol></li><li> (200)에 표적 DNA 600 ng의 추가 - &amp; #(181), PICS는의 L 나누어지는이 잘 혼합하고, 45 분 동안 37 ° C에서 품어. 참고 : 인테그라 제 억제제 (예를 들어, Raltegravir)을 대상 DNA를 생략하거나 포함 IVI 반응은 제어 반응을 권장합니다. </li><li> 0.5 %, 8 mm의 각각 0.5 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 SDS, EDTA, 및 프로 티나 제 K를 첨가하여 IVI 반응을 멈춘다. 철저하게 반응 내용을 혼합하고 하룻밤에 56 ° C를 품어. </li><li> 그 다음날, 페놀 / 클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 IVI 반응에서 전체 DNA를 정제. 16,000 XG 및 RT의 모든 원심 분리 단계를 수행하십시오. </li><li> 2 분 들어, 탈 단백 시료에 페놀의 동일한 볼륨을 추가 텍싱에 의해 격렬하게 혼합하고, 원심 분리기. 조심스럽게 위 수성 상을 제거하고 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 단계를 반복 5.5. 새로운 튜브로 위 수성 위상을 전송합니다. </li><li> , 클로로포름 혼합물 텍싱에 의해 격렬하게 혼합하고, 원심 분리 기용 : 1 페놀 : 1의 동일한 볼륨을 추가R 2 분. 새로운 튜브로 위 수성 위상을 전송합니다. </li><li> 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가 텍싱에 의해 격렬하게 혼합하고, 2 분 동안 원심 분리. 새로운 튜브로 위 수성 위상을 전송합니다. </li><li> , DNA를 침전 0.3 M의 최종 농도 0.1 μg의 / μL, 초산 나트륨 3 M의 최종 농도로 글리코겐을 추가하고, 100 % 에탄올 (빙냉) 2.5 볼륨. 소용돌이는 내용을 수집, 원심 분리기 간략하게 혼합하고, -80 ° CO / N에 튜브를 배치합니다. </li><li> 다음 날, 16,000 XG에서 30 분 동안 샘플을 원심 분리하고 30 분 동안 4 ° C. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. </li><li> 16,000 XG에서 펠렛 원심 분리기 80 % 에탄올 (얼음처럼 차가운) 500 μL를 추가하고 10 분 동안 4 ° C. RT에서 DNA 펠렛을 공기 - 건조하고 철저하게 클레아없는 물 50 μL에 재현 탁. -20 ° C에서 DNA 샘플을 저장합니다. </li></ol> 정량화 PIC 활동 6. PCR 분석 실험 <ol><li> 통합 된 HIV-1 DNA의 접합을 증폭 (각각 LTR 및 phiX174 프라이머) 바이러스 LTR과 phiX174 DNA를 대상으로 프라이머를 사용하여 1 라운드 기존의 PCR을 수행합니다. <ol><li> 표 3에 기재된 바와 같이 1 라운드 PCR 혼합물을 조립한다. 템플릿 DNA를 제외한 모든 구성 요소의 마스터 믹스를 조립, 별도의 PCR 튜브에 45 μL 씩 분배하고, 템플릿 DNA 또는 클레아없는 물 (제어)의 5 μL를 추가합니다. </li><li> 표 4에서 권장 열 사이클링 조건을 사용하여 열 순환기 PCR을 수행한다. </li></ol></li><li> 상기 제 1 로로부터 집적 vDNA 서열을 증폭 바이러스 LTR (LTR-R 및 LTR-U 프라이머)의 짧은 영역의 측면에 프라이머를 사용하여 두 번째 라운드 qPCR을 수행싶게 PCR 제품. 통합 vDNA 숫자를 복사 확인하려면 알려진 사본 번호의 10 배 연속 희석을 사용하여 표준 곡선을 생성 (예를 들어, 10 0-10 8) HIV-1 분자 클론의. <ol><li> 표 5에 기재된 바와 같이 2 라운드 qPCR의 혼합물을 조립한다. 96 웰 PCR 반응 플레이트에 웰의 적절한 수에 25 μL 씩 분배주의, 템플릿 DNA를 제외한 모든 구성 요소의 마스터 믹스를 조립 한 후 정제되지 않은 1 라운드의 PCR 제품이나 클레아없는 물을 5 μL를 추가 (제어). 세중의 모든 qPCR에 반응을 수행합니다. </li><li> 실시간 PCR 장비로 PCR 플레이트를 넣고 표 6에 추천 사이클링 조건을 사용하여 qPCR을 수행합니다. </li><li> 적합한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD4+antigen%3A+physiological+ligand+and+HIV+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor.</a> Cell. 52 (5), 631-633 (1988).</li>
<li>Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+HIV+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of HIV entry.</a> Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).</li>
<li>Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nucleoprotein+complex+mediates+the+integration+of+retroviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA.</a> Genes Dev. 3 (4), 469-478 (1989).</li>
<li>Bukrinsky, M. I., Sharova, N., Dempsey, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+nuclear+import+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+preintegration+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes.</a> Proc Natl Acad Sci. 9 (14), 6580-6584 (1992).</li>
<li>Hansen, M. S., Smith, G. J. 3rd, Kafri, T., Molteni, V., Siegel, J. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+complexes+derived+from+HIV+vectors+for+rapid+assays+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro.</a> Nature biotechnol. 17 (6), 578-582 (1999).</li>
<li>Farnet, C. M., Haseltine, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+DNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Integration of human immunodeficiency virus type 1 DNA in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci. 87 (11), 4164-4168 (1990).</li>
<li>Fujiwara, T., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration%3A+structure+of+an+integration+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate.</a> Cell. 54 (4), 497-504 (1988).</li>
<li>Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correct+integration+of+retroviral+DNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correct integration of retroviral DNA in vitro.</a> Cell. 49 (3), 347-356 (1987).</li>
<li>Lewinski, M. K., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration--mechanism+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration--mechanism and consequences.</a> Adv Genet. 55, 147-181 (2005).</li>
<li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+DNA+integration%3A+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).</li>
<li>Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+retroviral+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+rev+gen%22%5BJournal%5D)">Genetics of retroviral integration.</a> Ann rev gen. 26, 527-544 (1992).</li>
<li>Panganiban, A. T., Temin, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terminal+nucleotides+of+retrovirus+DNA+are+required+for+integration+but+not+virus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The terminal nucleotides of retrovirus DNA are required for integration but not virus production.</a> Nature. 306 (5939), 155-160 (1983).</li>
<li>Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+HIV-1+virion+genesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+microbe%22%5BJournal%5D)">The cell biology of HIV-1 virion genesis.</a> Cell host microbe. 5 (6), 550-558 (2009).</li>
<li>Sherman, P. A., Fyfe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+integration+protein+expressed+in+Escherichia+coli+possesses+selective+DNA+cleaving+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity.</a> Proc Natl Acad Sci. 87 (13), 5119-5123 (1990).</li>
<li>Katzman, M., Katz, R. A., Skalka, A. M., Leis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+retroviral+integration+protein+cleaves+the+terminal+sequences+of+linear+viral+DNA+at+the+in+vivo+sites+of+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration.</a> J Virol. 63 (12), 5319-5327 (1989).</li>
<li>Craigie, R., Mizuuchi, K., Bushman, F. D., Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+in+vitro+assay+for+HIV+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+acid+res%22%5BJournal%5D)">A rapid in vitro assay for HIV DNA integration.</a> Nucl acid res. 19 (10), 2729-2734 (1991).</li>
<li>Bushman, F. D., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+human+immunodeficiency+virus+%28HIV%29+integration+protein+in+vitro%3A+specific+cleavage+and+integration+of+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA.</a> Proc Natl Acad Sci. 88 (4), 1339-1343 (1991).</li>
<li>Pauza, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+bases+are+deleted+from+the+termini+of+HIV-1+linear+DNA+during+integrative+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination.</a> Virology. 179 (2), 886-889 (1990).</li>
<li>Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+HIV-1+preintegration+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes.</a> Meth Mol Biol. 485, 135-149 (2009).</li>
<li>Engelman, A., Oztop, I., Vandegraaff, N., Raghavendra, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+HIV-1+preintegration+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of HIV-1 preintegration complexes.</a> Methods. 47 (4), 283-290 (2009).</li>
<li>Addai, A. B., Pandhare, J., Paromov, V., Mantri, C. K., Pratap, S., Dash, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+modulates+HIV-1+integration+in+primary+CD4%2B+T+cells%3A+implications+in+HIV-1+pathogenesis+in+drug-abusing+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leuk+Biol%22%5BJournal%5D)">Cocaine modulates HIV-1 integration in primary CD4+ T cells: implications in HIV-1 pathogenesis in drug-abusing patients.</a> J Leuk Biol. 97 (4), 779-790 (2015).</li>
<li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12 (4), 288-293 (1997).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재무 및 비재무 이익을 선언합니다.

레트로 바이러스 PICS는의 생화학 적 분석은 레트로 바이러스 DNA 통합의 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 레트로 바이러스 찍어 통합 활성 측정은 플라크 형성 분석법, 서던 블롯 분석, 및 중첩 qPCR에 의해 달성 될 수있다. 플라크 분석의 실험적 전략은 힘든이고 통합 6, 7, 18를 측정하는 간접 방법을 이용한다. 남부 오점 기반 분석 측정 통합은 직접하지만 PICS는 6, 7, 18의 비교적 높은 금액을 필요로한다. 이 보고서는 시험관 내에서 HIV-1 PIC 관련된 통합 활동을 측정하기위한 중첩 qPCR의...

초기와 후기 이벤트 : 표적 세포에서 HIV-1 복제는 크게 두 단계로 구분 여러 단계를 포함한다. HIV-1을 순차적으로 표적 세포 표면 수용체 CD4 및 두 개의 공동 수용체 (CCR5 또는 CXCR4 1) 중 하나에 결합 할 때 초기 이벤트는 시작한다. 따라서, 바이러스 세포막 퓨즈 및 바이러스 캡시드는 (CA) 코어는이 세포질로 방출된다. 칼슘 코어는 바이러스와 기원 세포 모두 바이러스 게놈의 단일 가닥 RNA (ssRNA) 및 여러 가지 단백질을 포함하고 있습니다. 칼슘 - 관련 바이러스 성 단백질은 역전사 효소 (RT) 및 인테그라 (IN), 바이러스 복제의 초기 발생시 중요한 단계를 매개이 효소를 포함한다. 역전사 및 핵 단백질 복합체, 즉 역전사 착체 (RTC) 및 사전 통합 복합체 (PIC)는 각각 3, 4, 5의 문맥 함수 IN &lt;SUP&gt; 6. &quot;(말 3에서) (끝 U3 바이러스 ssRNA 게놈 항구 터미널 반복 (R) 5시) &#39;고유 시퀀스 U5에 인접 요소의 끝. RTC는 이중 가닥 (DS) DNA 사본 (vDNA)에 바이러스 ssRNA 게놈 변환합니다. 이 역전사 과정은 따라서 vDNA (7, 8)의 양단의 긴 말단 반복 (LTR)을 생성하는 U5 및 U3 서열의 중복을 초래한다. 이어서, PIC 관련 IN 호스트 염색체 9, 10, 11로 vDNA의 통합을 가능하게 두 개의 연속 생화학 적 반응을 촉매한다. 우선, 세포질, 다량 모두의 LTR (12)와 결합 및 3&#39;- 말단의 각각으로부터 뉴클레오티드를 절단. 이것은 3&#39;- 말단 처리가 각 3&#39;- 단부 vDNA의 (CA OH)에 수산기를 생성한다.IN은 지그재그 방식으로 염색체 DNA의 두 가닥을 절단하는 친핵체로서 오 vDNA CA를 사용하는 것을 특징이어서, PIC는 핵 트래 피킹. 동시에, IN은 배위 염색체 DNA의 반대쪽 가닥에 생성 된 포스 포디 에스테르 결합에 vDNA의 양 단부를 접합한다. 이 스트랜드 전사 공정 후, 숙주 세포 기계 통합 사이트의 교차점에서 5 &#39;를 vDNA의 단부 및 수리 계속되는 본쇄 갭의 2 개의 비 결합 (unpaired) 뉴클레오타이드를 제거한다. 초기 이벤트는 따라서 HIV-1 게놈의 통합 DNA 사본 (프로 바이러스)의 설립과 함께 절정에 달하다. 프로 바이러스는 바이러스 - 인 코드 된 단백질의 발현을 포함하여 이후의 이벤트를 시작 효율적인 바이러스 유전자 발현에 적합한 환경을 제공하고; 미성숙 바이러스의 조립; 감염성 비리 (13)에 신진, 릴리스 및 성숙. 정제 된 재조합 레트로 바이러스의 IN은에 능력이시험관 내에서, 수행, 모두 3&#39;- 말단 처리 및 가닥 전송 활동에 외생 적 LTR 같은 기판 DNA 제공. 이러한 정제 된 재조합의 IN을 사용하여 생화학 연구 vDNA 통합 14, 15, 16, 17의 중요한 측면을 계시했다. 그러나, 자연 감염과는 달리,이 시험 관내 생화학 적 반응은 표적 DNA에 기판 DNA의 양 단부의 공동의 통합을 지원하지 않는다. 대조적으로, 심하게 감염된 세포로부터 단리 레트로 찍어 concertedly 이종 대상 DNA로 내인성 vDNA의 양단을 통합한다. 이것은 고립 된 원시 사진을 사용하여 널리 채택 및 I n은 체외 통합 (IVI) 분석의 후속 개선되었다. 처음에 레트로 바이러스 IVI 분석, 재조합 쥐에 감염된 세포로부터 세포질 추출물을보고그 LTR의 대장균 supF 유전자 형질 백혈병 바이러스 (MLV)는 IN 활성 소스 및 용균 성장 결함이 외생 대상 DNA로 공급 하였다 돌연변이 람다 파지 DNA 역임. 재조합 MLV DNA의 성공적인 통합은 파지 DNA에 복사하고 supF 다음의 표현은 재조합 파지의 플라크 형성 능력의 복원되었다. 그러나이 실험 전략은 간접적 인 방식으로 힘들고 조치 통합이다. 이러한주의 사항을 해결하기 위하여, 외인성 선형 박테리오 phiX174 DNA에 통합 내인성 vDNA의 척도로서 PIC 관련 IVI 활성을 정량화 서던 블롯 기반 간접 단부 라벨링 분석은, 18 (7), (6)을 개발 하였다. 이 방법은 통합 이벤트의 직접적인 측정을 제공하지만, PIC 제제의 상대적으로 높은 양의 기술적 도전 유지하는 필요노력. 이 문제를 회피하기 위해, PICS는의 적당한 양을 필요로하는 중첩 된 PCR 기반의 분석은, 19 (5), 4 개발되었다. 이 보고서에서 우리는의 업데이트 된 버전을 설명 중첩 된 자연 감염시 발생하는 HIV-1 PIC 매개 통합 활동을 요점을 되풀이하기 위해 고안 체외 방법에서 PCR 기반. 이 방법은 실시간 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에)로 측정 PIC 내인성 활성 소스로서 HIV-1 감염 표적 세포의 세포질 추출물을 사용한다. 자신의 통합 활동을 사진을 분리하고 측정하기위한 절차는 Engelman 실험실 (20)에 의해 출판 프로토콜에서, 수정과, 적응하고 있습니다. 이 방법에서, PIC 관련된 통합 활동 외인성 선형 표적 DNA (21)로부터 생성 된 DNA의 제품을 제공함으로써 개시된다이러한 통합 반응으로 정제 이후 PCR 기반 정량 용 원료로서 사용된다. 제 1 라운드 PCR 통상적으로, 바이러스 표적 DNA 접합은 적절한 프라이머를 사용하여 증폭된다. 두 번째 라운드에서 qPCR에가, LTR 특정 프라이머는 특히 1 라운드 PCR 제품에서 vDNA 인구를 풍부하게하는 데 사용됩니다. 이 방법에 대한 자세한 설명을위한 프로토콜 섹션을 참조하십시오. 레트로 바이러스 찍어와 시험관 연구에서 레트로 바이러스 DNA 통합의 메커니즘에 대한 우리의 이해와 IN 억제제의 개발에 상당한 발전을 주도하고있다. HIV-1 통합 바이러스 및 호스트 요인의 역할을 결정하고, 약물 내성 퇴치를 향해 새로운 항 바이러스 약물을 개발, 매핑 HIV-1 통합 사이트에서 최근 증가 초점을 바탕으로, 우리는 IVI 분석의 증가 된 관심과 광범위한 사용을 직시 이 보고서에 설명 된 것과 같은. 이 차례로 이어질 것상기 방법은 향후 개선함으로써, 그 응용 범위를 다양.

<table><tbody><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 소 태아 혈청 (Hi-FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10438-026 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco' s 변형 된 독수리' s medium (DMEM) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11995-065 < </td><td></td></tr><tr><td> p>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS) (1x)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 20012-027 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신-EDTA (0.25%) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린-스트렙토마이신 용액 (100x) </td><td> Cellgro/Mediatech </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> HEK293T 세포 (293T) </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> CRL-3216 < </td><td></td></tr><tr><td> p>HIV-1 프로비랄 분자 클론 pNL4-3 </td><td> NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램 < </td><td> p>114 </td><td></td></tr><tr><td> PolyFect 형질주입 시약 </td><td> Qiagen </td><td> 301107 </td><td></td></tr><tr><td>DNase 1 </p</td><td>> Calbiochem/Merckmillipore </td><td> 260913 </td><td></td></tr><tr><td>Sup-T1 세포</td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> CRL-1942 </td><td></td></tr><tr><td>Hepes pH 7.2 - 7.5 (즉시 사용 가능한 용액)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> 염화칼륨(KCl) 용액 </td><td> Sigma-Aldrich< > </td><td> 60142 </td><td></td></tr><tr><td> 염화마그네슘(MgCl2) 용액 </td><td> 시그마-알드리치 </td><td> M1028 </td><td></td></tr><tr><td> 디티오트레이톨 (DTT) </td><td> 시그마-알드리치 </td><td> 43815 </td><td></td></tr><tr><td> 아프로티닌 </td><td> 시그마-알드리치<> /p> </td><td> A6106 </td><td></td></tr><tr><td> 디지토닌 </td><td> 시그마-알드리치 </td><td> D141 </td><td></td></tr><tr><td> <pRNase A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091-021 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 < </td><td></td></tr><tr><td> p>phiX174 복제 형태 1 DNA </td><td> Promega </td><td> D1531 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX174-F 프라이머: 5'-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3' PhiX174-R 프라이머: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Invitrogen 및/또는 IDT-DNA </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> dNTP mix </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> Go Taq DNA 중합효소 </td><td> Promega </td><td> M3005 </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick 젤 추출 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 28706 </td><td></td></tr><tr><td> 초순수 증류수 </td><td> Invitrogen </td><td> 10977-015 <</td><td></td></tr><tr><td>p>Tris-EDTA (TE) 버퍼 (100x)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데실 황산염(SDS)</td><td> 시그마-알드리치 </td><td> L3771 </td><td></td></tr><tr><td> 에틸렌디아민 테트라아세트산, 디소듐 염(EDTA) 용액, 0.5M, pH 8.0 </td><td> 시그마-알드리치 </td><td> E7889 <</td><td></td></tr><tr><td>p>Proteinase K(즉시 사용 가능한 용액) </td><td> Qiagen </td><td> 19131 </td><td></td></tr><tr><td> 페놀 (10&nbsp; mM 트리스 HCl, pH&nbsp; 8.0 및 1&nbsp; mM EDTA) </td><td> 시그마-알드리치 </td><td> P4557 </td><td></td></tr><tr><td> 클로로포름 </td><td> 시그마-알드리치 </td><td> 288306 <</td><td></td></tr><tr><td>p>글리코겐(5mg/mL 용액)</td><td> Ambion/Invitrogen </td><td> AM9510 </td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨(3M, pH 5.2)</td><td> 시그마-알드리치</p</td><td>> S7899</td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 시그마-알드리치 </td><td> E7023 </td><td></td></tr><tr><td>1차 LTR 프라이머: 5'-GTGCGCGCGCTTCAGCAAG-3' 첫 번째 라운드 phiX174 프라이머: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Invitrogen 및/또는 IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td>2차 LTR-R 프라이머: 5'-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3' 2라운드 LTR-U 프라이머: 5'-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3' 2차 Taqman 프로브: &nbsp; 5'-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3' </td><td> Invitrogen 및/또는 IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td> iQ Supermix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td></td></tr></tbody></table>

측정 체외 hiv-1 사전 통합 단지의 통합 활동

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 외피 단백질은 세포질로의 바이러스 캡시드 (CA) 코어의 박리 하였다 바이러스 세포 막 융합을 유도하는 표적 세포의 표면에 동족 수용체 결합. 이어서, 바이러스 성 역전사 효소 (RT)를하는 딴 핵 단백질 복합체의 일부로서 복합 역전사 (RTC)를 이중 - 가닥 DNA 카피 (vDNA)에 바이러스의 단일 가닥 RNA 게놈을 변환 불린다. 이것은 다른 핵 단백질 복합체의 생물 발생에 이르게 상기 vDNA과 관련된 바이러스 단백질, 숙주 인자 이루어지는 사전 통합 복합체 (PIC)를 불린다. PIC는 관련 바이러스 인테그라 제 (IN)은 시간적 및 공간적으로 조절 두 단계에서 호스트 염색체 DNA 내로 vDNA의 통합을 조정한다. 우선, IN은 PIC의 핵 트래 피킹 후에는 염색체 DNA 내로 통합 처리 vDNA을 매개, 둘째, 세포질에서 vDNA의 3 &#39;말단을 처리하고. 찍어 절연그들이 이종 외생 첨가 타겟 DNA에 관련된 vDNA를 통합하는 능력이 급격 같이 HIV-1 감염 표적 세포에서 시험 관내 기능이다. 이러한 PIC 기반 체외 통합 분석에서 크게 레트로 바이러스 통합의 기계적인 세부 사항을 서술 및 억제제 년에 발견에 기여했다. 이보고에서는 절연 기본 찍어 관내 통합 활동을 측정하기위한 중첩 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에) 기반 전략을 채택 업데이트 HIV-1 PIC 분석에 상세히.

HIV-1 PICS는의 분리 급성 감염 섭-T1 세포에서 HIV-1 찍어 분리에 사용되는 프로토콜의 개략도는도 1에 도시되어있다. 이 프로토콜은 Engelman 등에 의해 기술 된 방법에서 파생됩니다. 19, 20. HIV-1 감염 세포 찍어 조립하고 역전사 vDNA 구성되어 핵 단백질 복합체 바이러스 단백질, 및 세포 인자 (19), (20)이다. 이 보고서에 기술 된 방법은 PIC 관련된 통합 활성 소스로서 HIV-1 감염 세포의 세포질 추출물을 사용한다. <p cl...

이 보고서는 급성 감염 세포의 세포질 추출물에서 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1) 사전 통합 복합체(PIC) 관련 통합 활성을 측정하기 위한 체외 분석에 대해 설명합니다. PIC 관련 HIV-1 DNA를 이종 표적 DNA에 통합하는 것은 중첩된 실시간 중합효소 연쇄 반응 전략을 사용하여 정량화됩니다.

측정 체외 HIV-1 사전 통합 단지의 통합 활동

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

이 절차의 전반적인 목표는 HIV-1에 감염된 SupT1 세포에서 분리된 사전 통합 복합체(PIC)의 체외 통합 활성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 HIV 생물학의 몇 가지 주요 질문, 특히 특정 숙주 인자 및 바이러스 인자(예: 바이러스 캡시드)가 HIV-1 DNA 통합에서 어떤 역할을 하는지 해답할 것이며, 이를 통해 항레트로바이러스 요법을 위한 새로운 표적을 설계하거나 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 이 방법의 주요 장점은 in vitro에서 통합 활성을 측정하기 위해 상대적으로 적은 양의 사전 통합 복합체(pre-integration complex, PIC) 준비가 필요하다는 것입니다.이 기술의 의미는 HIV-1 AIDS의 진단 및 치료로 확장될 수 있으며, 이는 이 기술의 초기 버전이 오늘날 임상적으로 사용되는 주요 항 HIV 약물 중 하나인 HIV-1 인테그라제 억제제의 발견에 중요했기 때문에 이 방법은 HIV-1 통합을 이해하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 그러나 RSV 및 MLV와 같은 다른 레트로바이러스를 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 시연하는 사람은 실험실의 박사 후 연구원인 Dr.Muthukumar Balasubramaniam이 될 것입니다. SupT1을 HIV-1에 감염시키려면 BSL-2 실험실에서 SupT1 세포를 Roswell Park Memorial Institute 또는 10%FBS 및 Pen-Strep이 보충된 RPMI 배지에서 10배에서 10배에서 6배 사이로 유지합니다.텍스트 프로토콜에 따라 높은 역가의 감염성 HIV-1을 생성한 후, 배양 플라스크에서 SupT1 세포를 풀링하고 피펫팅으로 잘 혼합한 다음 혈구계에서 트리판 블루 배제 염색을 사용하여 생존 가능한 세포 수를 측정합니다. 50 밀리리터 원뿔형 원심 분리 튜브에서 바이러스 감염 당 106 개의 세포를 8 번 분취 한 다음 500 배 g과 섭씨 25 도의 스윙 버킷 로터에서 5 분 동안 세포를 원심 분리합니다. 세포 배양 배지를 제거하지 않고 펠릿 세포가 들어있는 튜브를 추가 처리를 위해 BSL-3 실험실로 옮긴 다음 펠릿을 방해하지 않고 튜브에서 배지를 조심스럽게 흡입합니다.다음으로, 30ml의 DNase I 처리 바이러스 접종물을 세포에 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 혼합한 다음 2개의 6웰 조직 배양 플레이트 사이에 혼합물을 고르게 분배합니다. Spinoculation을 위해 배양판을 플레이트 캐리어에 넣고 480배 g과 섭씨 25도에서 2시간 동안 스윙 버킷 로터에 원심분리기를 넣은 다음 섭씨 37도에서 5시간 동안 이산화탄소 5%로 세포를 배양합니다. 감염된 세포를 채취하여 용해하려면 각 감염에 해당하는 세포를 50ml 원추형 원심분리기 튜브에 모읍니다.세포를 300배 g 및 섭씨 25도에서 10분 동안 원심분리한 다음 상등액을 조심스럽게 흡인하거나 피펫팅합니다. 잔류 바이러스 입자를 제거하려면 2ml의 버퍼 K 마이너스 마이너스를 추가하여 각 펠릿을 세척하고 샘플을 다시 회전시킨 다음 펠릿을 방해하지 않고 세척을 한 번 더 반복하기 전에 흡인 또는 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 마이크로피펫으로 잔류 완충액을 조심스럽게 제거한 후 얼음저온 용해 완충액 K plus plus를 사용하여 각 펠릿을 부드럽게 다시 현탁하고 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.세포질 사전 통합 복합체(PIC)를 준비하려면 실온에서 10분 동안 샘플을 흔든 다음 튜브를 섭씨 4도로 사전 냉각된 로터에 넣고 4분 동안 섭씨 1, 500배 g 및 섭씨 4도에서 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 새 마이크로 원심분리기 튜브에 조심스럽게 옮기고 1분 동안 16, 000회 g 및 섭씨 4도에서 회전합니다. 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브에 조심스럽게 옮긴 다음 RNase A를 밀리리터당 20마이크로그램의 최종 농도로 추가하고 내용물을 30분 동안 흔들지 않고 실온에서 배양합니다.자당을 최종 농도 7%까지 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 잘 혼합한 다음 마이크로 원심분리기 튜브에서 PIC의 부분 표본을 준비합니다. 액체 질소에서 급속 동결하고 장기 보관을 위해 섭씨 80도의 음의 냉동고에 넣습니다. in vitro integration 또는 IVI assay에 사용되는 타겟 DNA를 준비하기 위해 맞춤형 프라이머 phiX174-Forward 및 phiX174-Reverse를 사용하여 PCR 혼합물을 조립하여 phiX174 플라스미드 DNA에서 2.0 kilobase 영역을 증폭하고 텍스트 프로토콜에 따라 프로그램을 사용하여 PCR을 수행합니다.겔 정제 및 샘플 분취 후 200마이크로리터의 PIC에 600나노그램의 표적 DNA를 첨가합니다. 잘 섞어 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. SDS, EDTA 및 proteinase K를 첨가하여 IVI 반응을 중지한 다음 반응 내용물을 철저히 혼합하고 섭씨 56도에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, IVI 반응에서 총 DNA를 정제하기 위해 탈단백질화된 샘플에 동일한 부피의 페놀을 첨가합니다. 볼텍싱과 원심분리기로 2분 동안 격렬하게 혼합합니다. 페놀 추출을 반복하기 전에 상부 수성상을 조심스럽게 제거하고 새 튜브로 옮긴 다음 동일한 부피의 페놀 클로로포름을 첨가하십시오.와류로 샘플을 혼합하고 튜브를 2분 동안 원심분리한 다음 상부 수성상을 새 튜브로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 클로로포름으로 추출한 후 마이크로리터당 0.1마이크로그램의 글리코겐, 0.3몰의 아세트산나트륨 및 2.5부피의 얼음처럼 차가운 100% 에탄올을 첨가하여 수성상에서 DNA를 침전시킵니다. 튜브를 밤새 섭씨 영하 80도에 놓습니다.다음날, 30 분 동안 16의, 000 시간 g 그리고 4 섭씨 온도에 표본을 분리기, 그 후에 주의깊게 펠릿 교란하지 않고 상등액을 제거하십시오. PIC 활성을 정량화하기 위한 PCR을 수행하려면 바이러스 LTR과 phiX174 DNA를 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 통합된 HIV-1 DNA의 접합부를 증폭하는 기존 PCR의 첫 번째 라운드부터 시작합니다. 여기에 설명된 대로 템플릿 DNA를 뺀 마스터 믹스를 조립한 다음 45마이크로리터 부분 표본을 별도의 PCR 튜브에 분주하고 5마이크로리터의 템플릿 DNA 또는 뉴클레아제 자유수를 대조군으로 추가합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 프로그램을 사용하여 열순환기에서 반응을 실행한 다음 두 번째 정량 PCR을 수행하고 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석합니다. 이 IVI 분석법에서 SupT1은 HIV-1 치료제인 DNAse와 HIV-1 인테그라제 억제제인 랄테그라비르(Raltegravir)의 부재 또는 존재를 이용하여 스핀 접종하였다. 배양 후, PIC를 분리하고 정제된 DNA를 분석하여 바이러스 DNA의 통합을 확인했습니다.여기에서 볼 수 있듯이, HIV-1 PIC는 관련 바이러스 DNA를 표적 DNA에 강력하게 통합하고 PIC의 IVI 효율은 Raltegravir로 보충된 반응에서 크게 감소했으며, 이는 이 분석에서 측정된 HIV-1 인테그라제에 대한 통합 활성을 강력하게 암시합니다. 대조군 반응은 어떠한 적분 활동도 보이지 않았습니다. 또한, PCR의 첫 번째 라운드에서 Taq 중합효소를 배제한 대조군은 통합 산물을 증폭시키지 않았습니다.특히, PIC 단독 대조군의 데이터는 중첩된 qPCR 전략이 통합 바이러스 DNA를 특이적으로 측정했지만 PIC 관련 바이러스 DNA는 측정하지 않았음을 나타냅니다. 이러한 데이터는 총체적으로 PIC 관련 통합 활동을 보여줍니다. 일단 마스터하면 PIC 활성을 정량화하기 위한 바이러스 준비 및 PCR 분석을 일주일 안에 완료할 수 있습니다.SupT1 세포의 감염 및 감염된 세포로부터 PIC의 분리는 하루 만에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 HIV-1 PIC를 분리하고 체외 통합 활동을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 감염성이 높은 HIV-1 역가를 가지고 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 앞치마와 가운과 같은 보호복, 이중 장갑 및 보호 안경을 포함한 적절한 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

measurement-vitro-integration-activity-hiv-1-preintegration

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Uncoating는 HIV - 1 수명주기의 초기 단계에 필수적인 단계이며 capsid 쉘의 해체와 바이러스 ribonucleoprotein 복합 (vRNP)의 출시로 정의됩니다. 여기, 우리는 HIV - 1 virions에서 그대로 코어를 분리 및 그들의 uncoating을 quantifying 기술을...

HIV - 1 코어의 시험 관내 Uncoating에서

이 문서는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경에 의한 유리를 지원 평면 bilayers에서 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성을 시각화하는 방법을 설명합니다. 메소드는 또한 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성시 발생하는 신호 전달 분자의 활성화 및 재배포를 탐지하기 immunofluorescence 염색법과 결합 할 수 있습니다.

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

이 비디오는 HIV-1에 감염된 CD4+ T 세포에 의한 형질세포(plasmacytoid dendritic cell)의 자극 후 방출되는 I형 인터페론(IFN)을 정량화하기 위해 HEK-Blue 인터페론-α/β 리포터 세포를 사용하여 분비된 배아 알칼리 인산가수분해효소 분석을 보여줍니다.

Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase Reporter Assay를 사용한 Bioactive Type-I 인터페론의 정량화

항체 중화를 평가하고 효과적인 백신 면역원의 설계를 안내하려면 바이러스 표면 항원 구조를 이해하는 것이 필요합니다. 여기에서는 특정 anti-Env 항체에 의해 transfection된 세포의 표면에서 발현되는 trimeric HIV-1 Env의 인식에 대한 연구를 가능하게 하는 세포 기반 ELISA 분석에 대해 설명합니다.

셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가

인간 면역결핍 바이러스(HIV) 입자에서 엑소좀을 분리하는 그래디언트 절차를 설명하는 기술을 설명합니다. 이 절차는 HIV에 감염된 사람의 인간 혈장에 있는 HIV 입자로부터 엑소좀을 분리하는 데 사용되었습니다. 분리된 엑소좀은 사이토카인/케모카인 함량을 분석했습니다.

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

HIV-1 복제 주기의 통합 후 단계를 표적으로 하는 RNA 분자의 효능 및 독성을 평가하는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 방법은 새로운 분자를 스크리닝하고 기존 분자의 형식을 최적화하는 데 유용합니다.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

이 원고는 상향 및 하향 벡터 - 숙주 접합 DNA를 동시에 분석 할 수있는 양방향 통합 사이트 분석을위한 실험 절차 및 소프트웨어 분석을 설명합니다. 양방향 PCR 제품은 모든 다운 스트림 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 결과 데이터는 통합 DNA 표적의 높은 처리량, 정량적 비교에 유용합니다.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

인간의 조직 비보 전 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 감염 바이러스 병의 귀중 한 3D 모델을 제공합니다. 여기, 우리는 프로토콜 처리 및 조직 표본에서 인간의 편도 에이즈-1 여성 생식 기 거칠어 감염과 액체 공기 인터페이스에 문화에서 그들을 유지 하는 것을 설명 합니다.

전 비보 인간 면역 결핍 바이러스 1와 Histoculture 인간 림프 조직 및 여성 생식 기 점 막의 감염

우리 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 감지 식 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 그것은 셀 및 셀 감염 시스템에서 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다.

높은 처리량 Cre Lox 활성화 에이즈-1 바이러스 막 융해의 억제제를 식별 하기 위해 바이러스 막 융합 분석 결과

여기에서는 특히 HIV-1 감염에 중점을 두고 소포체(ER) 스트레스 및 풀린 단백질 반응(UPR) 활성화를 측정하기 위한 몇 가지 확립된 방법에 대해 설명합니다. 이 기사에서는 또한 ER 스트레스/UPR이 HIV-1 복제 및 바이러스 감염성에 미치는 영향을 조사하기 위한 일련의 프로토콜에 대해 설명합니다.

HIV-1에 감염된 T 세포에서 소포체 스트레스 및 풀린 단백질 반응을 측정하고 HIV-1 복제에서 그 역할을 분석합니다.

학습하세요 HIV-1 사전 통합 단지(PIC)의 체외 통합 활성 측정 방법을 SupT1 세포를 이용하여. 이 기법은 항레트로바이러스 치료제 개발을 위한 새로운 표적 발굴에 활용됩니다.

측정 체외 HIV-1 사전 통합 단지의 통합 활동

더 많은 동영상 탐색