Name: 항체 단편의 라이브러리를 스크리닝에 대한 세균 내부 멤브레인 디스플레이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 배우세요 대장균 twin-arginine translocation 경로를 활용한 항체 단편 라이브러리 스크리닝 방법으로, 세포질 내에서 항체의 올바른 접힘과 결합 능력을 동시에 평가할 수 있습니다. 이 기술은 신경퇴행성 질환 및 암 치료 연구에 활용됩니다.

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scFv 스크리닝 및 특성화 분석에 대한 작업에 대해 Tomer Zohar에게 감사드립니다. 이 연구의 일부는 미국 국립암연구소(National Cancer Institute)로부터 AJK에 수여하는 수상 번호 F32CA150622의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 미국 국립암연구소(National Cancer Institute) 또는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 대변하는 것은 아닙니다.

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

세포질 행위 항체 엔지니어 인해 이황화 결합 -6,7- 안정화의 형성을 방해 세포질의 환원 환경에 어려운 작업이다. 이것은 그들이 결합 친 화성을 위해 설계되는 이외에 세포질에서 안정성 및 용해도를 위해 설계되지 않는 비활성 세포질 대부분 항체를 야기한다. 파지 디스플레이, 박테리아 표면 디스플레이, 효모 표면 디스플레이 방법은 기존의 방법은 모든 설계 항체의 표시 분비 경로 14-16를 사용하지만, 이러한 방법은 세포 내 접힘 엔지니어링 할 수단이 없다. 타트 경로의 폴딩 품질 관리가 잘못 접힌 세포질 불안정 항체의 전위를 방지하기 때문에 내부 멤브레인 디스플레이를 사용하여 조작 된 항체는 세포 내 안정성 및 용해도를 개선했다. 이 방법은 친 화성 A에 대한 엔지니어링 세포 내 항체의 반복적 인 프로세스를 단순화차 용해도, 두 특성이 한 단계로 설계되어있다. 이 방법은 감소 세포 환경에서 용해도와 항체 공학적 설계되었지만, 또한 단백질이 방법은 페리 플라 즘의 산화성 환경에서 폴딩을 유지하여 설계되기 때문에, 비 환원성 조건에서 작동하도록 설계 항체에 적용될 수있다. 이 기술은 높은 친 화성이 높은 세포질 용해도 항체 엔지니어링 프로세스를 간소화 있지만, 몇 가지 제한 사항이 프로토콜을 사용할 때 고려해야 할 중요하다. 보조 화면 ELISA 신호를 분석 할 때의 scFv 변종 약속 확인하려면, 적절한 항원 결합을 전시하지 않을 수 잠재적으로 흥미 변형과 그 사이의 안목에 대한 임계 값은 몇 클론 추가 특징으로 한 때까지 알 수있을 것 같지 않다. 이 모 항체에 걸쳐 개선 된 결합을 찾기 위해 중요하다; 하나,비정상적으로 높은 신호는 결합력 29 또는 응집 효과 (30), 내부 멤브레인 디스플레이 검사 방식에 고유하지 않은 문제를 나타내는 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 패닝 후 spheroplasts를 복구 할 수없는 경우가 아닌 실행 가능한 (게시되지 않은 데이터)만큼 키 제한은 기억한다. 이 항체를 코딩하는 플라스미드를 복구하는 DNA 증폭 및 변환 단계를 필요로한다. 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 접는과 항체의 결합의 동시 공학을 할 수 있습니다. 심사에 성공하려면, 상영되는의 scFv 라이브러리는 ssTorA 신호 펩타이드 융합으로 표현해야합니다. 이 순서없이, 항체는 문신 경로로 이동하지 않으며, 따라서 페리 플라 즘 (19)에 전좌되지 않습니다. 또한,이 C 말단 에피토프 태그는 bin에 기재된 항체의 검출을 허용하는 항체에 융합하는 것이 필수적이다땡 분석. 분명히, E. 대장균은 또한 필요한 경로 문신 기계가 있어야 scFvs를 표현하는 데 사용하지만, 이는 통상적으로 사용 된 E. 마찬가지다 대장균 균주. 이 프로토콜에 대한 수정이 원하는 특성을 가진 항체를 분리 할 가능성을 향상시킬 수 있습니다. 감산 패닝 단계 전에 원하지 않는 구성 요소의의 scFv 라이브러리를 고갈 표적 항원에 대해 패닝을 완료 할 수있다. 라이브러리 spheroplasts 비 목적 단백질 단독 또는 코팅 BCCP 피복 자성 비드와 함께 배양 할 수 있고, 이러한 비드에 결합하는 spheroplasts 원하는 표적에 대한 결합에 대한 나머지 바운드 spheroplasts 선별 전에 폐기 될 수있다. 대표 결과에 언급 된 바와 같이, 방법은 고립 된 scFv의 친 화성이 spheroplasts에 표시 scFvs과 경쟁 패닝 반응 가용성 선수를 포함하는 개선한다. 가용성 빌려 때문에etitor에는 DNA가 spheroplasts에 표시 scFvs 그렇게 만 서열은 PCR 반응에서 회수되며, 그것에서 증폭되지 않는, 정제 된 단백질이다. 또한,이 방법은 항체 또는 비 - 항체 결합 단백질에 대한 다른 유형의 엔지니어링 확장 될 수있다. 대장균 내부 멤브레인 디스플레이는 높은 친 화성 및 세포 내 용해도가 높은 수준의 엔지니어링 항체를위한 강력한 플랫폼입니다. 이 방법은 세포 내 환경에서 작동하도록 설계 항체의 효율적인 엔지니어링에 특히 적합하다. 이러한 세포 내 항체는 이미 신경 퇴행성 질환, 암 및 바이러스 감염 (31)를 포함하는 필드의 수의 잠재적 치료제로 모색되고있다. 이 기술은 연구와 의학 이러한 필드 및 동일계에서 단백질 표적이 요구된다 공부 다른 필드 도구와 같은 세포 내 항체의보다 광범위한 사용을 가능하게 할 것이다.

접는 및 세포 내 환경에서 작동 할 수있는 항체는 연구 및 치료 응용 프로그램 모두를위한 유망한 도구입니다. 이들은 단백질 - 단백질 상호 작용을 방지 단백질 - 핵산 상호 작용을 방해하거나 효소 1-5 기판 액세스를 방지하기 위해 셀 내부의 표적 단백질에 결합하여 단백질의 활성을 조절하는 능력을 갖는다. 항체가 세포 내 애플리케이션 많은 잠재력을 가지고 있지만, 표적 항원에 결합하는 능력을 유지하면서 세포 내 환경의 적절한 폴딩 및 용해성을 설계하는 것은 어려운 것이다. 환원 세포질 환경은 일반적으로 전장 항체의 단일 사슬 가변 단편 (scFv를) -6,7- 항체를 포함한 항체 단편의 폴딩 안정에 필요한 이황화 결합의 형성을 방지한다. 지향 진화 접근 방법은 시간과 함께 항체를 엔지니어에게 이용되어왔다대상에 대한 고등학교의 친화력은 8-10 항원. 이러한 접근은 일반적으로 11-13 항체의 대규모 라이브러리를 선별, 파지 디스플레이, 효모 표면 디스플레이, 박테리아 표면 디스플레이를 사용한다. 이러한 방법은 대상에 결합하는 항체를 식별하기위한 강력하고 효과적이다, 그러나 그들은 14 ~ 16을 표시됩니다 단백질을 수송하기 위해 분비 경로에 따라 달라집니다. 분비 경로는 효모 나 박테리아의 페리 플라 즘에 소포체 내강으로 감소 세포질에서 펼쳐진 단백질으로 전위. 단백질은 산화 조건 하에서 접어 세포 표면 상에 표시하거나 친화 17,18 래핑 선별 파지 입자로 패키징된다. 그 결과, 이들 기술을 이용하여 분리 된 항체는 반드시 세포질에서 잘 접하지 않으며, 항체는 세포 내 용도로 사용할 경우, 세포 내 용해도는 종종 개별적으로 설계되어야한다. 개선하기또한 세포질에 접어 공학 항체의 효율성, 우리는 이전 MAD-TRAP (연관 단백질 타트 기반 인식 막 - 고정 디스플레이)의 성공 대장균 inner- 사용 된 scFv 항체 라이브러리를 스크리닝하기위한 방법을보고 막 디스플레이 19. 세균 내 멤브레인 디스플레이 분비 경로를 사용하는 다른 공통의 표시 방법과 대조적으로, 표시된 항체 수송 트윈 아르기닌 전좌 (TAT) 경로에 의존한다. 타트 경로는 수용성 정확하게 접힌 단백질은 E.에서 이송 될 수 있도록하는 품질 제어 메커니즘을 포함 막을 가로 지르는 내측 및 주변 세포질 (20, 21)에 대장균의 세포질. 잘 세포질에 접어합니다 (문신 신호 펩타이드 ssTorA에 N- 말단 융합과 문신 경로를 대상으로 예. 단백질)가 과발현 문신 기판은 N 말단에 중간 긴 수명 전위를 형성 전세포질 및 주변 세포질 (19)의 C 말단 N. 이는 E.의 세포질 표면에 항체 단편을 포함 올바르게 접혀 타트 기판의 표시를 허용 대장균 내부 막. spheroplasts를 생성 효소 절단에 의해 상기 외부 막을 제거한 후, 항체는 세포 외 공간 (도 1)에 노출된다. 이 내막에 표시 문신 기판이 특정 대상에 대한 결합에 대해 스크리닝 할 수 있습니다. 중요한 것은, 세포 표면 디스플레이를 위해 문신 경로를 활용하는 것은 아니라 세포질에 접어 라이브러리 만 항체 친 화성 세포 폴딩 결합 동시 엔지니어링을 가능 바인딩 심문 될 것임을 보장한다. 이 프로토콜에서, 우리는 E.에서의 scFv 라이브러리를 표시하는 방법에 대해 설명합니다 콜라이 내막은 표적 항원에 대한 라이브러리를 패닝 및 라이브러리의 가장 유망한 성분을 식별하기위한 보조 스크린을 수행한다. 우리는 초점 동안<html> scFvs의 프로토콜은,이 방법은 그 응용 결합하고 세포 내 접힘이 필요한 단백질을 설계에 적용 할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig1.jpg" /> 그림 1. 문신 내부 멤브레인 표시됩니다. E.에서 대장균은 ssTorA 신호 서열에 융합으로 표현 올바르게 세포질 접어의 scFv 항체는 내막을 가로 질러 전송된다. scFvs가 세포질에서 N 말단 및 주변 세포질의 C- 말단과 내부 막에 고정되는 전위의 중간 형태. E. 대장균 세포 외막 효소는 이에 외 공간에 고정 된 항체를 노광 및 디스플레이 항체의 C 말단 융합 된 에피토프 태그에 결합하는 항체를 사용하여 검출하기에 사용할 수 있도록 spheroplasts을 형성하도록 분해된다.로드 / 54583 / 54583fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

<table><tbody><tr><td>scFv 라이브러리</td><td>는 다양함</td><td></td><td>적절한 scFv 라이브러리는 상업적 또는 학술적 출처에서 얻어야 합니다.</td></tr><tr><td>MC4100 E. coli 세포</td><td>Coli Genetic Stock Center</td><td>6152</td><td>세포는 선택한 형질전환 방법에 따라 화학적 또는 전기 적질이 있어야 합니다.</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Difco 탈수 배양 배지 LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>클로람페니콜 (Cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨, 이염기성(Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨, 일염기성(KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 0.5M</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘(MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>라이소자임</td><td>시그마 Aldrich</td><td>L3790-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>볼텍스 믹서</td><td>VWR</td><td>97043-564</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2646100</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 &beta;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-1</td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix (세포 용해 세제)</td><td>EMD Millipore</td><td>71456</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 MWCO, 3,000&nbsp; daltons</td><td>GE Healthcare Sciences</td><td>28932240</td><td></td></tr><tr><td>Target antigen</td><td>Varies</td><td>N/A</td><td>정제된 표적 항원을 구매하거나 생산/정제할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Dynabeads, MyOne, Streptavidin T1</td>, <td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr>, <tr><td>Dynamag-2 magnet</td>, <td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>, Tube rotator</td><td>, VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>, IDT</td><td>N/A</td>, <td>Primer sequences는 프로토콜에 기술된 바와 같습니다.</td></tr><tr><td>10x T4 DNA 리가제 반응 버퍼</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리누셀로타이드 키나아제 (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td>프라이머 인산화 반응에 사용된 T4 리가제 버퍼가 1 mM ATP를 포함하고 있는지 확인하십시오.</td></tr><tr><td>5x Phusion HF 버퍼 팩</td><td>New England BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) 용액 혼합물, 각 10 mM</td><td>dNTP New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA 중합효소</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td>다른 고충실도 중합효소를 대안으로 사용할 수 있지만 <강>표 3</강>의 어닐링 온도를 조정해야 합니다.</td></tr><tr><td>듀얼 48/48 고속 반응 모듈이 있는 C1000 터치 열 순환기</td><td>Bio-Rad</td><td>185-1148</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV gel and PCR clean-up system</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Microdialysis 멤브레인 필터</td><td>EMD Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 폴리스티렌 둥근 바닥 세포 배양 플레이트</td><td>VWR</td><td>10062-902</td><td></td></tr><tr><td>Costar 일반 폴리스티렌 분석 플레이트 뚜껑</td><td>Corning</td><td>3931</td><td></td></tr><tr><td>Microtitre 플레이트 셰이커</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 well EIA/RIA Easy Wash 투명 플랫 바텀 폴리스티렌 하이 바인드 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>3369</td><td></td></tr><tr><td>Bel-blotter 폴리카보네이트 96웰 복제 도구</td><td>Bel-Art Products</td><td>378760002</td><td></td></tr><tr><td>Instant nonfat dry milk</td><td>Quality Biological</td><td>A614-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polysorbate 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>PopCulture 시약 (집중 세포 용해 세제)</td><td>EMD Millipore</td><td>71092-3</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP) 항체 마우스 Sigma</td><td>Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast OPD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9187-50SET</td><td></td></tr><tr><td>황산 (H2SO4), 10&nbsp; N 해결책</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>레이놀즈 랩 알루미늄 호일</td><td>VWR</td><td>89079-075</td><td></td></tr><tr><td>BioTek 에포크 마이크로플레이트 분광 광도계</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>11120570</td><td></td></tr></tbody></table>

항체 단편의 라이브러리를 스크리닝에 대한 세균 내부 멤브레인 디스플레이

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

세포 내 기능을 위해 조작된 항체는 표적 항원에 대한 친화력을 가져야 할 뿐만 아니라 세포질에 용해되고 올바르게 접혀야 합니다. 재조합 항체 라이브러리의 표시 및 스크리닝에 일반적으로 사용되는 방법은 세포 내 단백질 접힘 품질 관리를 통합하지 않으므로 이러한 방법을 사용하여 엔지니어링된 항체의 항원 결합 능력과 세포질 접힘 및 용해도를 별도로 설계해야 하는 경우가 많습니다. 여기에서는 항원 결합과 적절한 세포질 접힘을 동시에 위해 scFv(single-chain variable fragment) 항체의 재조합 라이브러리를 스크리닝하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 대장균 쌍-아르기닌 전좌(Tat) 경로의 고유한 세포 내 접힘 품질 관리 메커니즘을 활용하여 대장균 내막에 scFv 라이브러리를 표시합니다. Tat 경로는 용해되고 잘 접힌 단백질만 세포질 밖으로 운반되어 내막에 표시되도록 하여 항원 결합에 대한 조사 전에 잘 접힌 scFv를 제거합니다. 외막을 제거한 후, 내막에 표시된 scFv는 표적 항원에 결합하는 scFv를 분리하기 위해 자성 비드에 고정된 표적 항원에 대해 패닝됩니다. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 기반 2차 스크리닝을 사용하여 추가 특성 분석을 위해 가장 유망한 scFv를 식별합니다. 항원 결합 및 세포질 용해도는 세포 내 응용 분야를 위한 높은 친화력과 높은 세포질 용해도를 가진 항체를 엔지니어링하기 위해 후속 돌연변이 유발 및 스크리닝을 통해 개선할 수 있습니다.

E.에 문신 경로의 세포 내 단백질 접힘 품질 제어 메커니즘 대장균 잘 환원 세포질 환경에 접어 단백질 내부 세포 막에 걸쳐 전송을 제한합니다. ssTorA 신호열 (자연스럽게 타트 통로 (20)에 의해 반송되는 토라 단백질로부터의 신호 서열)에 scFv를 융합 과발현으로 전좌가 내막 19 scFvs 표시 결과 스톨된다. 외막 효소의 중단 후, 표시 항체는 항원 - 결합 활성을 스크리닝 가능하게한다. scFv를 표시 용 타트 경로를 이용할 수있는 능력은 칼슨 등으로 도시 하였다. (19) (도 6). scFv가 항체 및 scFv13 scFv13.R4는 인식 아르기닌 - 아르기닌 잔기 쌍을 결여 네이티브 ssTorA 서열 또는 변성 ssTorA 중 하나에 융합 된문신 경로. scFv13.R4는 직접 진화의 네 라운드를 통해 scFv13에서. 마티 등에 의해 설계되고 세포질 9 잘 배 것으로 알려져있다. 이 scFv를는 내막에 표시 되었으나 네이티브 ssTorA 신호 서열에 융합으로 표현 만 (도 6). 반대로, scFv13 잘 세포질 9 절첩 아니므 관계없이 신호 서열의 어떤가 융합하는 내막 잘 표시되지 않는다. 또한, 경우 scFvs은 디스플레이 내부 멤브레인 디스플레이와 문신 경로 사이의 중요한 연결을 보여 관찰되지 않았다는 TatC 단백질의 문신 기계 20,28의 중요한 구성 요소를 결여 세포에서 발현되었다. 이러한 결과는 세포 FOL위한 화면으로서 기능 할 타트 경로를 통해 전송을 허용하는 문신 신호 펩티드를 포함하는 단백질만을 정확하게 내막에 표시되는 세포질 접어 입증땡땡. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig6.jpg" /> 도 내막 표시 scFvs 6. 검출. 유동 세포 계측법 분석은 내막에 잘못 접힌 scFv13 잘 접혀진 scFv13.R4의 표시를 검출하기 위해 수행 하였다. scFvs는 ssTorA 시퀀스에서의 Arg, 인수 쌍리스 -리스로 수정 된 기본 ssTorA 또는 ssTorA (KK)에 융합되었다. scFvs의 C 말단 FLAG 에피토프 태그는 형광 염료 (FITC)로 검출 하였다는 항 FLAG 항체를 π 공역. 플래그 태그없이 TatC 단백질 (ΔtatC) 및 ssTorA-scFv13없이 세포는 대조군으로 시험 하였다. M은 평균 형광 값을 나타냅니다. 허가 기준 19 일부터 재판. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> (19)을 향상시킨다. 이를 설명하기 위해, β 갈 락토시다 제에 대한 결합 친화도가 낮은 레벨이 scFv13에 기초하여 에러가 발생하기 쉬운 PCR 라이브러리는, 프로토콜에 기재된 방법을 표시하여 패닝 표적 항원 β 갈 락토시다 제에 대해 패닝 하였다. scFv를 1-4 돌연변이 및 패닝 중 하나 라운드 후에 단리하고 scFv13 (도 7a)보다 세포질 용해도보다 높은 레벨 (도 7b) β 갈 락토시다 제를 더 높은 결합 친화도를 나타냈다. scFv를 1-4을 기반으로하는 새로운 라이브러리는 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 사용했고, 대해이 2 세대 라이브러리의 패닝했다β - 갈 락토시다 제는 설명 프로토콜의 변형을 사용하여 수행 하였다. 진화의 두 번째 라운드를위한 β 갈 락토시다 제에 대해 패닝의 scFv 1-4보다 높은 친화 클론 분리의 가능성을 개선하기위한 경쟁자로 정제 용해 scFv를 (14)의 존재하에 수행 하였다. 돌연변이 유발 및 패닝의 두 번째 라운드 후, scFv를 2-1 scFv를 2-3은 ELISA 기반 차 심사를 사용하여 분리 하였다. 이러한 scFvs은 scFv13보다 β - 갈 락토시다 아제에 대한 높은 결합 친 화성을 전시뿐만 아니라 1 라운드 클론의 scFv 1-4보다 더 바인딩 전시 없습니다. scFv를 2-1 scFv13.R4 (도 7A)에 필적 결합 β 갈 락토시다 제를 나타냈다. scFv를 2 ~ 3도 용해도 및 항원 결합의 동시 공학을 강조하는 scFv (14)에 비해 세포질 용해도 추가 증가를 보여줍니다. scFvs의 친 화성 및 수용성식이 동시에 스크리닝하기 때문에, 선택된의 scFv는 모드 (mod) 것을 가능생이 용해도하지만 높은 결합 또는 그 반대의 경우도 마찬가지. 예를 들어, 2-1의 scFv의 scFv 2-3보다 낮은 수용성 발현을 가지고 있지만 베타 - 갈 락토시다 제를 더 높은 결합력을 나타낸다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig7.jpg" /> 그림 7. 대상 바인딩과의 scFv의 세포질 발현이 내부 멤브레인 디스플레이를 사용하여 격리 변형. (A) scFvs는 E.의 세포질에서 발현되었다 대장균 a를 헥사 히스티딘 (6 × -His) 태그합니다 (ssTorA 신호 순서없이 예.) 전지와 니켈 - 니트릴 로트리 아세트산 스핀 컬럼을 사용하여 정제. - 갈 락토시다 아제와 β 정제 scFvs의 결합은 ELISA로 측정 하였다. 정제 scFvs는 β 갈 락토시다 제 - 코팅 ELISA 플레이트 상에 로딩하고, 바인딩은 scFvs 항 6 × -His 항체를 검출 하였다. 데이터는 여섯 복제의 평균이며, 오차 막대는 평균값의 표준 오차를 나타낸다.(B) 세포질 항 6 × -His 항체로 프로빙 웨스턴 블롯에 의해 분석 하였다 scFvs를 발현하는 세포로부터의 세포 용 해물의 가용성 및 불용성 분획. 총 단백질 농도는 시료의 로딩을 표준화 하였다. (A) 재판 및 허가 기준 (19)에서 (B) 적용. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

세포 내 단백질 접힘에 대한 고유한 품질 관리 메커니즘을 가진 Escherichia coli twin-arginine translocation pathway를 사용하여 항체 단편 라이브러리에서 결합 친화도 및 세포질 용해도를 동시에 스크리닝하여 내막에 항체 단편을 표시하는 방법을 제공합니다.

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

이 절차의 전반적인 목표는 twin-arginine translocation 경로의 접힘 품질 제어 기능을 활용하여 항체 단편의 결합과 세포 내 접힘을 단일 단계로 엔지니어링하는 것이며, 이는 세포 내에서 작동하는 항체를 엔지니어링하는 데 응용될 수 있습니다. 이 방법은 환원성 세포질 환경에서 항체가 적절하게 접히고 기능하도록 엔지니어링하는 것의 어려움을 극복하는 것과 같이, 항체 엔지니어링 분야의 주요 과제들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포질 내에서 잘 접히는 항체만이 디스플레이되어 결합 능력이 분석됩니다.분비 경로에 의존하는 효모 및 파지 디스플레이보다 이점이 있습니다. 이 기술의 영향은 신경퇴행성 질환, 암 및 바이러스 감염의 치료까지 확장되는데, 이러한 질환들은 항체로 표적화할 수 있는 세포 내 병인 기전을 포함하고 있기 때문입니다. 스페로플라스트(spheroplasts)를 생성하고 다루는 방법을 이해하는 것은 까다롭기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다.scFv 라이브러리를 ssTorA 신호 서열에 융합하고 37 °C에서 3시간 동안 진탕 배양한 후, 20 °C, 225 rpm 조건에서 15~22시간 동안 하룻밤 동안 scFv 라이브러리를 발현시킵니다. 배양 후, 분광광도계를 사용하여 600 nm에서 광학 밀도를 측정합니다. 그런 다음 계산된 부피의 유도 배양액을 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣고 12,000 ×g, 상온에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고 100 µL의 얼음처럼 차가운 분획 완충액(fractionation buffer) 또는 fB를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 12,000 ×g, 실온에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 3.5 µL의 10 mg/mL 라이소자임(lysozyme)이 첨가된 350 µL의 얼음처럼 차가운 fB를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.다음으로, 튜브를 천천히 볼텍싱하면서 1 mM EDTA 700 µL를 한 방울씩 가한 후, 시료가 혼합되도록 튜브 회전 장치(tube rotator)를 이용하여 상온에서 20분 동안 배양합니다. 회전 장치에서 튜브를 꺼냅니다. 각 튜브에 얼음처럼 차가운 0.5 M MgCl2 50 µL를 첨가하고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.그런 다음 샘플을 11,000 ×g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 이제 마이크로피펫과 1 mL 팁을 사용하여 펠릿의 일부를 천천히 끌어올립니다. 그 다음, 튜브를 기울여 입구가 새 1.5 mL 튜브 바로 위에 오도록 잡은 상태에서, 피펫 팁을 상층액 밖으로 천천히 들어 올려 펠릿을 새 튜브로 미끄러뜨려 옮깁니다.과잉 상청액을 제거한 후, 1 mL의 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하여 구상세포(spheroplasts)를 재현탁합니다. 응집체 내에 존재하는 비결합 scFv는 패닝(panning) 과정에서 위양성 결과를 초래하므로, 패닝 전 구상세포를 완전히 재현탁해야 합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 표적 항원을 비오틴화한 후, 스트렙타비딘 코팅 자성 비드를 원래의 바이알에서 재현탁합니다.그런 다음 7~10 × 10⁹개의 비드를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 비드가 튜브 벽면에 모이도록 비드 튜브를 자석 랙에 2분 동안 둔 다음, 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 자석에서 튜브를 꺼내고 PBS를 사용하여 기포가 생기지 않게 비드를 재현탁합니다.그 다음 튜브를 자석에 다시 붙이고 버퍼를 제거한 후, PBS로 비드를 두 번 더 세척합니다. 비드에 비오틴화 항원이 포함된 용해물을 1 mL 첨가하고, 부드럽게 회전시키며 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 1% BSA가 포함된 PBS를 사용하여 비드를 다섯 번 세척합니다.그 다음 1% BSA가 포함된 PBS를 사용하여 비드를 재현탁합니다. scFv 라이브러리를 스크리닝하려면, 멸균된 15 mL 튜브에 4 × 10⁹개의 구상세포(spheroplasts)와 8 × 10⁸개의 비드를 넣는 것으로 시작합니다. 총 부피가 4 mL가 되도록 1x PBS(1% BSA 포함)를 추가합니다.그 다음 용액을 1.5 mL 튜브 4개에 각각 1 mL씩 나누어 담고, 4 °C에서 천천히 회전시키며 5시간 동안 반응을 배양합니다. PCR을 위해 비드에 결합된 spheroplast를 준비하려면, 패닝 반응 튜브를 자석 위에 3분 동안 둡니다. 상층액을 제거하고 이전과 동일하게 1% BSA가 포함된 1x PBS로 비드를 4회 세척합니다.그 다음 튜브당 25 µL의 ddH20를 사용하여 비드를 재부유시킵니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로, 비드 결합 scFv 유전자를 증폭하기 위해 전체 플라스미드 PCR을 수행한 후 PCR 생성물로부터 플라스미드를 재환형화합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 전체 반응물을 MC4100 equalized cells에 형질전환합니다.ELISA를 사용하여 클론을 식별하려면, 패닝된 서브라이브러리 한 튜브를 해동하여 LB 한천 배지에 도말합니다. 라운드 바텀 96웰 배양 플레이트의 각 웰에 20 µg/mL의 chloramphenicol이 포함된 LB 200 µL를 넣습니다. 피펫 팁을 사용하여 한천 배지에서 개별 콜로니를 채취합니다.그런 다음 팁을 96-웰 플레이트의 첫 번째 웰에 넣고 부드럽게 저어 접종합니다. 각 웰에 단일 콜로니를 하나씩 접종하는 과정을 반복합니다. 마이크로플레이트 쉐이커에서 37 °C로 20~24시간 동안 배양합니다.텍스트 프로토콜에 따라 표적 항원 코팅 용액을 준비한 후, 96-웰 고결합 투명 폴리스티렌 ELISA 플레이트의 각 웰에 용액 50 µL를 첨가합니다. 플레이트를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 따라 96-웰 배양 플레이트의 콜로니를 한천 플레이트로 복제합니다.그런 다음, ELISA 플레이트에서 코팅 용액을 비우고 텍스트 프로토콜에 따라 준비한 블로킹 용액 100 µL를 각 웰에 넣습니다. 실온에서 최소 2시간 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 라운드 바텀 배양 플레이트의 각 웰에 농축된 세포 용해 세제 20 µL를 첨가하고, 마이크로플레이트 쉐이커를 사용하여 실온에서 15~20분 동안 배양 플레이트를 반응시킵니다.ELISA 플레이트에서 블로킹 용액을 비우고, 텍스트 프로토콜에 따라 준비한 세척 버퍼 200 microliters로 웰을 4회 세척합니다. 마지막 세척액을 제거한 후, 세포 용해 플레이트의 각 웰에서 50 microliters를 ELISA 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 플레이트를 실온에서 1~2시간 동안 배양합니다.ELISA 플레이트에서 샘플을 비우고 웰을 4회 세척하십시오. 그 후, 텍스트 프로토콜에 따라 scFv를 검출하기 위한 항체 용액을 준비하십시오. 각 웰에 항체 50 µL를 첨가하고 실온에서 1~2시간 동안 배양하십시오.제조사의 프로토콜에 따라 준비한 HRP 기질을 웰당 200 microliters씩 넣기 전, ELISA 플레이트를 세척 버퍼로 4회 세척합니다. 플레이트를 실온의 암소에서 30~60분 동안 배양합니다. 반응을 정지시키기 위해 각 웰에 3 molar H2SO4 50 microliters를 첨가하고 피펫으로 부드럽게 섞어줍니다.마지막으로, 492 nanometers에서 플레이트 리더를 사용하여 흡광도를 측정합니다. 본 실험에서는 scFv 항체 scFv13 및 scFv13. R4를 천연 ssTorA 서열 또는 twin-arginine translocation 경로(Tat 경로라고도 함)에서 인식되지 않도록 수정된 ssTorA에 융합하였습니다.ScFv.R4는 적절하게 접히며, 야생형 ssTorA에 융합되었을 때 내막에 발현됩니다. ScFv13은 적절하게 접히지 않으며, 어떤 Tat 신호 펩타이드에 융합되더라도 내막에 전시되지 않습니다. 이러한 결과는 Tat 신호 펩타이드를 포함하고 세포질 내에서 올바르게 접힌 단백질만이 내막에 전시된다는 것을 보여주며, 이는 Tat 경로가 세포 내 접힘 상태를 확인하는 스크리닝 도구로 기능할 수 있음을 의미합니다.본 실험에서는 beta-galactosidase에 대해 낮은 결합 친화도를 갖는 scFv13 기반의 error-prone PCR 라이브러리를 이용하여 beta-gal에 대해 패닝(panning)을 수행하였다. 그 결과 scFv 1-4가 분리되었으며, 이는 scFv13보다 beta-gal에 대해 더 높은 결합 친화도와 더 높은 세포질 용해도를 나타냈다. scFv 1-4를 2세대 scFv 1-4 라이브러리에 대한 경쟁자로 사용하여 scFv 2-1과 2-3을 분리하였으며, 이들은 scFv13 1-4보다 훨씬 더 높은 beta-gal 결합 친화도를 보여줌으로써 용해도와 항원 결합능의 동시 공학적 개선이 가능함을 입증하였다.본 절차에 이어, 정제된 용해물을 이용한 ELISA와 같은 다른 방법들을 수행하여 항원 특이성을 검증하고 분리된 클론의 결합 친화도를 결정할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 Tat 경로를 통해 라이브러리를 발현시키고 자기 비드 패닝(magnetic bead panning)을 통해 항원 결합체를 농축 및 분리함으로써, 목적 항원에 결합하여 작동하는 항체를 스크리닝하는 방법을 이해하게 될 것입니다. 황산을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로 적절한 개인 보호 장구를 반드시 착용해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

방법은 항원 동시에 수백 대해 파지 디스플레이 조합 항체 라이브러리의 합성 확장, 고 스루풋 선택을 수행하기위한 시각적 반주하여 설명한다. 이 병렬 접근 방식을 사용하여, 우리는 표준 면역의 기능적인 다양한 항원에 대한 높은 친화력과 특이성을 나타내는 항체 단편을 격리했다.

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

여기에서 저자는 도트-블롯 하이브리드화를 통해 정제된 단클론 항체와 펩타이드 스캐닝을 사용하여 선형 항원 항원결정기를 정의하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 그런 다음 식별된 항원결정기를 치료 및 진단 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

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Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 항 체에 대 한 강력한 대안 펩 티 드 선호도 시 약의 발견에 대 한 검증 된 기술입니다. 여기에 반자동된 정렬 방법 biopanning 잘못 된 반응의 발생을 감소 간소화 했다. 여기 우리가 생각 과정 및 후보자를 평가 하 고 최소화 다운스트림 분석에 적용 되는 기술을 설명 합니다.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

설명 하는 프로토콜 건설, 특성화 및 DNA 소스에서 만든 "domainome" 라이브러리 (선택의 대상)에 대 한 선택 수 있습니다. 이것은 다른 기술을 결합 하 여 연구 파이프라인에 의해 달성: 파지 디스플레이, 접이식 기자와 다음 세대 시퀀싱 데이터 분석을 위한 웹 도구.

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