항체 단편의 라이브러리를 스크리닝에 대한 세균 내부 멤브레인 디스플레이

이 절차의 전반적인 목표는 쌍둥이 아르기닌 전좌 경로의 접힘 품질 관리를 활용하여 항체 단편 결합 및 세포 내 접힘을 단일 단계로 엔지니어링하는 것이며, 이는 항체가 세포 내에서 기능하도록 엔지니어링하는 데 응용될 것입니다. 이 방법은 항체 감소 세포질 환경에서 항체가 접히고 제대로 기능하도록 엔지니어링하는 어려움을 극복하는 것과 같은 항체 엔지니어링 분야의 주요 과제를 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포질에서 잘 접히는 항체만 표시되고 결합을 위해 분석됩니다.

디스플레이를 위해 분비 경로에 의존하는 효모 및 파지 디스플레이에 비해 이점을 제공합니다. 이 기술의 의미는 신경 퇴행성 질환, 암 및 바이러스 감염 치료로 확장되는데, 이러한 질병은 항체에 의해 표적이 될 수 있는 세포 내 발병을 포함하기 때문입니다. 이 방법의 바이살 시연은 스페로플라스트를 생성하고 사용하는 방법을 이해하는 것이 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

scFv 라이브러리를 ssTorA 신호 시퀀스에 융합하고 3시간 동안 흔들면서 섭씨 37도에서 성장시킨 후 15-22시간 동안 밤새 섭씨 20도 및 225rpm에서 scFv 라이브러리의 발현을 허용합니다. 배양 후 분광 광도계를 사용하여 600나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 그런 다음 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에서 12, 000 회 g과 실온에서 5 분 동안 유도 배양액의 계산 된 부피를 원심 분리합니다.

상층액을 제거하고 100마이크로리터의 얼음처럼 차가운 분별 완충액 또는 fB를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 다음 12의, 000배 g 및 1개 분 동안 실내 온도에 표본을 분리기로 만드십시오. 상층액을 제거한 후 350마이크로리터의 얼음처럼 차가운 fB에 10밀리그램당 10밀리그램의 라이소자임 3.5마이크로리터를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.

다음으로, 튜브를 천천히 와류로 가열하면서 700 마이크로 리터의 1 밀리 몰 EDTA를 적하 한 다음 실온에서 튜브 회전자에 튜브를 20 분 동안 배양하여 샘플을 혼합합니다. 회전기에서 튜브를 제거합니다. 각 튜브에 50마이크로리터의 얼음처럼 차가운 점 5대구치 MgCl2를 넣고 얼음에서 10분 동안 배양합니다.

다음 10 분 동안 11, 000 시간 g 및 4 섭씨 온도에 표본을 분리기화하십시오. 이제 마이크로피펫과 1밀리리터 팁으로 펠릿의 일부를 천천히 당겨 올립니다. 그런 다음 튜브를 잡고 새 1.5ml 튜브 바로 위의 개구부와 비스듬히 피펫 팁을 상층액에서 천천히 들어 올리고 펠릿을 새 튜브에 밀어 넣습니다.

과도한 상층액을 제거한 후 얼음처럼 차가운 PBS 1ml를 사용하여 스페로플라스트를 다시 현탁시킵니다. 스페로플라스트는 응집체에 존재하는 결합하지 않는 scFv가 패닝에서 위양성으로 이어질 수 있으므로 패닝 전에 완전히 재현탁해야 합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 표적 항원을 비오틴화한 후 스트렙타비딘으로 코팅된 마그네틱 비드를 원래 바이알에 재현탁합니다.

그런 다음 7-10 곱하기 10에서 9번째 비드를 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 비드 튜브를 마그네틱 랙에 2분 동안 놓고 튜브와 피펫 측면의 비드를 모아 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 자석에서 튜브를 제거하고 PBS를 사용하여 기포를 생성하지 않고 비드를 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 튜브를 자석에 다시 넣고 버퍼를 제거한 후 PBS로 비드를 두 번 더 세척합니다. 비오틴화 항원이 함유된 용해물 1ml를 비드에 첨가하고 부드럽게 회전하면서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 1% BSA가 함유된 PBS를 사용하여 비드를 5회 세척합니다.

그런 다음 1% BSA와 함께 PBS를 사용하여 비드를 재현탁합니다. scFv 라이브러리를 스크리닝하려면 먼저 멸균 15ml 튜브에 9번째 스페로플라스트에 10번 4배, 8번째 비드에 10번 8을 추가합니다. 1% BSA가 있는 1 x PBS를 추가하면 총 부피가 4밀리리터가 됩니다.

그런 다음 용액을 각각 1ml씩 1.5ml 튜브 4개로 분취하고 5시간 동안 부드럽게 회전하여 섭씨 4도에서 반응을 배양합니다. PCR을 위해 비드 결합 스페로플라스트를 준비하려면 패닝 반응 튜브를 자석에 3분 동안 놓습니다. 상층액을 제거하고 이전과 같이 1%BSA가 포함된 1 x PBS로 비드를 4회 세척합니다.

그런 다음 튜브당 25마이크로리터의 ddH20을 사용하여 비드를 다시 현탁시킵니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이, 전체 플라스미드 PCR을 수행하여 bead-bound scFvs에 대한 유전자를 증폭한 다음 PCR 산물에서 플라스미드를 재순환화합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 전체 반응을 MC4100 이퀄라이제이션 셀로 변환합니다.

ELISA를 사용하여 클론을 식별하려면 LB 한천 플레이트에서 패닝된 하위 라이브러리와 플레이트의 튜브 하나를 해동합니다. 200마이크로리터의 LB와 밀리리터당 20마이크로그램의 클로람페니콜을 둥근 바닥 96웰 배양 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 피펫 팁을 사용하여 한천 플레이트에서 개별 콜로니를 선택합니다.

그런 다음 팁을 96웰 플레이트의 첫 번째 웰에 놓고 부드럽게 저어 접종합니다. 각 우물에 하나의 군체를 계속 접종합니다. 섭씨 37도에서 마이크로플레이트 셰이커에서 20-24시간 동안 배양합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 표적 항원 코팅 용액을 준비한 후, 96웰 고결합 투명 폴리스티렌 ELISA 플레이트의 각 웰에 50마이크로리터의 용액을 추가합니다. 접시를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 따라 96개의 웰 배양 플레이트에서 한천 플레이트로 콜로니를 복제합니다.

그런 다음 ELISA 플레이트에서 코팅 용액을 비우고 텍스트 프로토콜에 따라 준비된 차단 용액 100마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 실온에서 최소 2시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 둥근 바닥 배양 플레이트의 각 웰에 농축 세포 용해 세제 20마이크로리터를 추가하고 실온에서 15-20분 동안 마이크로플레이트 셰이커에 배양 플레이트를 배양합니다.

ELISA 플레이트에서 차단 용액을 비우고 텍스트 프로토콜에 따라 준비된 200마이크로리터의 세척 버퍼로 웰을 4회 세척합니다. 최종 세척을 제거한 후 세포 용해 플레이트의 각 웰에서 ELISA 플레이트의 해당 웰로 50마이크로리터를 옮깁니다. 플레이트를 실온에서 1-2시간 동안 배양합니다.

ELISA 플레이트에서 샘플을 비우고 웰을 네 번 세척합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 따라 scFvs를 검출할 수 있는 항체 용액을 준비합니다. 각 웰에 50마이크로리터의 항체를 추가하고 실온에서 1-2시간 동안 배양합니다.

제조업체의 프로토콜에 따라 준비된 HRP 기질 웰당 200마이크로리터를 추가하기 전에 세척 버퍼로 ELISA 플레이트를 4번 세척합니다. 플레이트를 실온의 어두운 곳에서 30-60분 동안 배양합니다. 반응을 소멸시키려면 각 웰에 50마이크로리터의 3몰 H2SO4를 넣고 부드럽게 피펫으로 용액을 혼합합니다.

마지막으로 492나노미터에서 판독된 플레이트를 사용하여 흡광도를 측정합니다. 이 실험에서, scFv 항체는 scFv13 및 scFv13과 결합한다. R4는 Tat pathway.ScFv라고도 하는 쌍둥이-아르기닌 전좌 경로에 의해 인식되지 않는 네이티브 ssTorA 서열 또는 변형된 ssTorA에 융합되었습니다.

R4는 잘 접히고 천연 ssTorA에 주입될 때 내막에서 발현됩니다. ScFv13은 잘 접히지 않으며 어떤 Tat 신호 펩타이드와 융합되는지에 관계없이 내막에 표시되지 않습니다. 이러한 결과는 Tat 신호 펩타이드를 포함하고 세포질에서 올바르게 접힌 단백질만 내막에 표시되어 Tat 경로가 세포 내 접힘을 위한 스크린으로 기능할 수 있음을 보여줍니다.

이 실험에서는 베타-갈락토시다아제에 대한 결합 친화도가 낮은 scFv13을 기반으로 하는 오류가 발생하기 쉬운 PCR 라이브러리를 베타갈에 대해 패닝했습니다. ScFv 1-4는 분리되어 scFv13보다 베타갈에 대한 결합 친화도가 높았을 뿐만 아니라 세포질 용해도가 더 높았습니다. 2세대 scFv 1-4 라이브러리에 대한 경쟁자로 scFv 1-4를 사용하여 scFv 2-1 및 2-3을 분리하고 scFv13 1-4보다 beta-gal에 대해 훨씬 더 높은 결합 친화도를 입증하여 용해도와 항원 결합의 동시 엔지니어링을 강조했습니다.

이 절차에 따라 항원 특이성을 확인하고 분리된 클론의 결합 친화도를 결정하기 위해 정제 용해물을 사용하는 ELISA와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 Tat 경로를 사용하여 해당 라이브러리를 표시하고 마그네틱 비드 패닝을 사용하여 항원 결합제를 농축하고 분리함으로써 관심 항원에 결합하기 위해 작동하는 항체를 스크리닝하는 방법을 이해해야 합니다. 황산으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.