Name: 효율적인 포자 형성 사카로 마이 세스 세레 비지에 96 멀티 웰 형식으로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 학습하세요 Saccharomyces cerevisiae의 96-웰 포자 형성 방법으로 고효율 대량 스크리닝을 수행하는 기술입니다. 최적화된 통기 조건으로 효율성을 높이고 유전자 라이브러리 선별에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH에서 매사추세츠 보스턴 (LSH) 및 R15 GM86805 대학 (LSH)에서 조셉 P. 힐리 보조금에 의해 지원되었다. SMP는 매사추세츠 보스턴 대학에서 사노피 - 젠 자임 원정대에 의해 부분적으로 지원됩니다.

1. 포자 형성을위한 준비 참고 :.이 프로토콜에 설명 된 미디어는 표준 조리법과 방법을 사용하여 제조하는 13, 17 표 1은이 프로토콜에서 사용되는 다양한 미디어의 1 L에 대한 제제를 제공합니다. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" height="180" width="469"><colgroup><col /><col /><col span="3" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"></td><td style="width: 55px;"> 박토 펩톤 </td><td style="width: 50px;"> 효모 추출물 </td><td style="width: 50px;"> 박토 한천 </td><td style="width: 60px;"> 우선 당 </td><td style="width: 70px;"> 칼륨 아세테이트 </td><td style="width: 60px;"> 글리세린 </td><td style="width: 60px;"> DDH 2 O </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPG 판 </td><td> 20g </td><td> 10g </td><td> 20g </td><td> - </td><td> - </td><td> 30 ml의 </td><td> 970 ml의 </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPD 판 </td><td> 20g </td><td> 10g </td><td> 20g </td><td> 20g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1,000 ml의 </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPD 액체 </td><td> 20g </td><td> 10g </td><td> - </td><td> 20g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1,000 ml의 </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPA 액체 </td><td> 20g </td><td> 10g </td><td> - </td><td> - </td><td> 20g </td><td> - </td><td> 1,000 ml의 </td></tr><tr height="15"><td style="height: 20px; width: 80px;"> 포자 형성 미디어 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10g </td><td> - </td><td> 1,000 ml의 </td></tr></tbody></table> 표 1. 미디어 제제 금액은 미디어의 1 L에 대해 제공됩니다. 미디어에 대한 세부 사항재료는 재료 표에서 찾을 수 있습니다. <ol><li> 모든 포자 세포는 동일한 유전자형을 할 경우,이 절차를 따르십시오 : <ol><li> 해동 효모 균주는 YPG (YPGlycerol) 접시에 사용합니다. 30 ° C에서 12 ~ 16 시간 동안 효모 성장. 중요한 것은, SK1 세포도 그렇게 SK1 균주 YPG 판에 너무 오래 남아해서는 안 sporulate 태세, 또는 그들이 접시에 sporulate 수 있습니다. 참고 YPG 성장 갓 해동 균주가 탄소원으로서 글리세롤의 이용으로 산화 적 인산화 필요 바람직하고, 따라서 기능적 미토콘드리아 DNA가 세포에 대해 선택된다. SK1 세포 기능 미토콘드리아 DNA를 잃고 PETITES가되는 경향이있다. 기능 미토콘드리아 DNA는 포자 형성에 필요합니다. </li><li> 하나의 식민지에 대한 YPD (YPDextrose) 판 상에 YPG 판에서 행진 효모. 30 ° C에서 YPD 판 24 ~ 28 시간에 효모를 성장. </li><li> YPD 고체 배지에서 성장의 약 36-48 시간 후, 하나의 식민지를 사용하여 25 ml의 YPD 문화를 시작YPD 판에서. 세포는 7.0 = 4.0 OD (600)에 대해 때까지이 문화를 성장. 220 rpm으로 진탕, 진탕 배양기에서 하룻밤 30 ° C에서이 단계를 수행합니다. </li><li> YPD 문화에서 (220 진탕 30 ° C 진탕 배양기에서 효모 성장 2 제 각 96 웰 플레이트의 필요성에 대해 OD 600 = 0.1입니다 YPA (YPAcetate) 문화의 1,000 mL로 시작하는 세포의 적절한 양을 사용 OD (600)는 1.5-1.3 사이 인 문화까지 회전). 참고 : 네 96 멀티 웰 플레이트를 선별​​ 경우 각각 96 멀티 웰 플레이트에 대한 YPA 문화의 100 ㎖를 접종은, 예를 들어 제 2 절에서 상영 될, YPA 문화의 400 ml의 필요합니다. YPA 문화에서 10 % 추가 볼륨부터는 증발 볼륨 손실을 방지 할 필요가있다. 세포가 적절한 OD 600에 도달하기 위해 일반적으로는 12 ~ 16 시간 사이에 걸립니다; 시간은 효모 균주의 유전형에 따라 달라질 수있다. YPA는 presporulation 미디어입니다. Pregrowth아세테이트 유전자의 발현 (예 : IME1)을 효율적이고 동기 포자 6 필요를 유도하는 데 도움이됩니다. </li><li> 5 분을위한 테이블 탑 원심 분리기에서 1,800 XG에 스핀 YPA에서 자란 세포 펠렛합니다. 세척 세포는 멸균 멸균 탈 이온수의 0.5 볼륨 1 배. 다시 스핀, 씻어 버린다. 1 배 볼륨 포자의 미디어를 Resuspend 세포. 제 2 절을 계속합니다. </li></ol></li><li> 다른 유전자형,의이다 포자에 대한 세포를 사용하여 (다른 플라스미드로 형질 전환 즉, 또는 다른 일반적으로 획득 및 냉동 주식으로 저장 돌연변이 포함) 96 멀티 웰 형식으로 다른 유전자형의 배열 세포를합니다. 그런 다음이 절차를 따르십시오 : <ol><li> YPG 고체 배지에 96 멀티 웰 플레이트 (들)에 해동 냉동 주식에서 세포를 전송하는 멸균 96 구 프로 거를 사용합니다. 30 ° C에서 효모 밤새 성장. </li><li> 멸균 96 구 프로 거를 사용하여 YPD 고체 배지 또는 선택에 YPG 고체 배지에서 세포를 전송고체 미디어 (세포가 선택이 필요 플라스미드가 포함 된 경우 즉, 합성 최소 배지는 아미노산을 결여). 선택적 미디어가 필요한 경우 식민지가 이일 YPD에 일반적으로 1 일, 각 변형에 대해 형성 될 때까지 30 ° C에서 효모를 성장. </li><li> 나누어지는 96 깊은 2 ml의 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 YPD 액체 매체 또는 선택적 액체 매체의 1.2 ml의. 프로 거를 사용하여 액체 매질에 고체 미디어에서 전송 세포는 테이프로 고정 플라스틱 뚜껑으로 덮고, 220 rpm으로 떨고, 30 ° C 통에 밤새 성장. 주 : 오염을 최소화하기 위해, 직사각형 페트리 접시에서 플라스틱 뚜껑을 사용하여 커버 플레이트. 공기 순환이 최소한으로 제한되어 있으므로 테이프의 조각을 사용하여 장소에 뚜껑을 잡으십시오. </li><li> 어댑터 스윙 버킷 원심 분리기를 이용하여 5 분 동안 1,800 XG에 원심 분리기 판은, 96 웰 플레이트를 수용한다. 세포에서 미디어를 붓고; YPA에서 펠렛 세포를 각각 500 μL의 YPA을 잘 추가하고 재현 탁. 덮개테이프로 고정 플라스틱 뚜껑. </li><li> 220 rpm으로 진탕, 진탕 배양기에서 30 ° C에서 15 시간 동안 세포를 성장. 제 2 절을 계속합니다. </li></ol></li></ol> 96 멀티 웰 형식 2. 포자 세포 <ol><li> 하나 3mm 멸균 고체 유리 구슬 또는 1.3 ml의 우물과 96 웰 플레이트의 각 웰에 멸균 5mm X 2mm 자기 교반 막대를 추가합니다. (비드 또는 교반 막대 사용 여부에 대한 설명은 아래 대표 결과를 참조하십시오.) </li><li> 스크리닝 될 수있는 모든 셀이 동일한 유전자형의 경우 2.2.1 간다. 상영하는 세포가 다른 유전자형의 경우, 2.2.2로 이동합니다. <ol><li> 96 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 단계 1.1.5 나누어지는 세포 플러스 미디어 500 μl를에서 세포를 가져 가라. 테이프로 고정 플라스틱 뚜껑 커버. 2.3로 넘어갑니다. </li><li> 96 웰 플레이트를 수용하기 위해 어댑터 스윙 버킷 원심 분리기를 사용하여 1.2.4에서 5 분 1,800 XG에 YPA에 스핀 세포. 의 부어셀로부터 F 매체. 포자 미디어에서 펠렛 세포를 각 포자 매체의 500 μl를 잘 추가하고 재현 탁. 테이프로 고정 플라스틱 뚜껑 커버. 2.3로 넘어갑니다. </li></ol></li><li> 유리 비드를 사용하는 경우, 장소 30 ° C에서 진탕 배양기에서 샘플 및 포자 220 rpm으로 흔들. 포자 형성을위한 30 ° C 배양기의 내부에 교반 접시에 자기 교반 막대, 장소 샘플을 사용하는 경우. 참고 : 모든 바 정력적으로 이동하고 문화 폭기 된 바와 같이 자기 ​​교반 막대에 대한 정확한 교반 속도만큼 매우 중요하지 않습니다. </li><li> , 포자 형성을 통해 진행을 모니터링 시각화의 포자 배양에서 샘플을 철회, 96 웰 커버 슬립 판에 포자 미디어의 24 μL에 포자 배양에서 세포의 6 μl를 추가하는 방법 (1 : 5 희석). 거꾸로 현미경을 사용하여 세포를 검사하기 전에 5 분 동안 정착 세포를 남겨주세요. 주 : 야생형 SK1 세포 컴팩트 성숙한 포자 (3)에 의해 형성 할포자 매체로 전사 후 6 시간이다. 포자 형성을 통해 진행이 같은 핵 마커 형광 마커를 사용하여 현미경으로 모니터링 할 수 있습니다 (즉, Htb2-mCherry 18)가 감수 분열 또는 prospore 막 마커를 조사하는 (즉, G20 19) 포자 형태 형성을 검사합니다. 대안 적으로, 굴절 포자의 포자 형성을 용지에 전사 한 후 약 12​​ 시간을 시작 노멀 스키 DIC 현미경을 사용하여 알 수있다. </li></ol>

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<li>Jones, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+library+for+comprehensive+overexpression+screens+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).</li>
<li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+yeast+plasmid+overexpession+screen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput yeast plasmid overexpession screen.</a> J. Vis. Exp. (53), e2836(2011).</li>
<li>Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timely+Closure+of+the+Prospore+Membrane+Requires+SPS1+and+SPO77+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. , (2016).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Labooratory+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).</li>
<li>Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPO71+mediates+prospore+membrane+size+and+maturation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).</li>
<li>Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+a+SNARE+protein+by+control+of+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization.</a> Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).</li>
<li>Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smk1p+MAP+kinase+negatively+regulates+Gsc2p%2C+a+1%2C3-beta-glucan+synthase%2C+during+spore+wall+morphogenesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.

여기에서 우리는 96 멀티 웰 형식으로 SK1 효모를 포자를위한 프로토콜을 제시한다. 폭기는 교반 막대 또는 아니라 각각의 유리 구슬 중 하나의 사용을 필요로 효율적인 포자 형성을위한 열쇠입니다. 세포가 비드 또는 교반 막대 하나없이 진탕 배양기에서 96 멀티 웰 플레이트에 포자 경우, 세포가 효율적으로 sporulate하지 않습니다. 세포가 비드 또는 (교반없이 30 ° C에서 표 1 인에 비해 진탕 배양기에서 교반 막대, 하나없이 포자 때 포자 효율 단지 작은 증가는 볼 수 10 % 대 통에 17 %가 혼란에 배치 플레이트). 마찬가지로, 7mm의 교반 막대의 사용은 7mm가 바 인해 인접 우물에 교반 막대와의 상호 작용에 제대로 문화를 공기에 쐬다하지 않았다 저어 가능성이 있기 때문에, 가난한 포자 형성 효율 (28 %) 결과. 이 프로토콜은 SPO을 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 동기 효율적으로 포자 SK1 효모 균주 7,8를 사용하여 포자 형성을위한 조건을 설명ru...

신진 효모의 포자 형성은 감수 분열 (1), 유전자 재조합 2의 메커니즘 (3) 세포 신호에 의해 발전의 제어, 개발 4의 영양 관리, 전사시 염색체 분리의 제어를 포함 생물학의 여러 측면, 통찰력을 제공하기 위해 연구되고있다 개발 5의 규제 및 포자 형성 (6)의 시험. 포자 형성 보호 포자 벽 (6)의 증착에 이어 머더 셀 내의 새로운 멤브레인 구획의 형성을 포함하는 신규 한 세포 분열 이벤트를 포함한다. 포자 세포 검사 이러한 연구들은 상대적으로 효율적인 방식으로 7,8- 약 24 시간에 포자 형성 과정을 거칠 수있는 급속 포자 효모 SK1, 활용. 효모 신진 포자 조건의 최적화는 9-13,이 실험 설명되었지만S는 고체 배지 또는 포자를 배양 튜브 또는 플라스크를 사용하여 수행되는 대규모의 액체 배양 물에서 포자를 조사 하였다. 여기에서 우리는 96 멀티 웰 플레이트 형식으로 효모 포자하는 방법을 설명합니다. 우리는이 방법에 대해, 통기 동기와 효율적인 포자 형성에 중요한 것을 발견하고, 작은 볼륨 멀티 웰 형식으로 충분한 포자 형성을 보장하기 위해 기술을 고안했다. 세포는 높은 처리량 기술과 바둑판 라이브러리 14-16을 사용하여 높은 카피 억제하는 멀티 웰 플레이트 형식 그러한 스크리닝에 최적화 된 시약을 사용하여 스크리닝 될 수 있도록 96- 멀티 웰 플레이트 형식으로 포자 것은 허용한다.

<table><tbody><tr><td>Nunc 1.3 ml DeepWell 플레이트</td><td>ThermoScientific</td><td>260251</td><td>포자 형성에 사용</td></tr><tr><td>Nunc 2.0 ml DeepWell 플레이트</td><td>ThermoScientific</td><td>278743</td><td>포자 형성 준비에 사용, 단계 1.2.3</td></tr><tr><td>3 mm 유리 비드</td><td>Fisher</td><td>11-312A</td><td>포자 형성에 사용</td></tr><tr><td>5 mm x 2 mm 교반 막대, 12개 팩</td><td>Fisher</td><td>14-511-82</td><td>포자 형성에 사용</td></tr><tr><td>96 글쎄 개구리</td><td>V & P Scientific</td><td>VP407</td>은 <td>1.2</td></tr>단계 <tr><td>라이브러리 복사기</td><td>V&에 필요합니다. P Scientific</td><td>VP381</td>은 <td>1.2단계에 필요함; frogger</td></tr><tr><td>직사각형 페트리 접시</td>와 함께 사용 <td>ThermoScientific</td><td>264728</td><td>1.2단계에 필요</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td>배지에 필요</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD</td><td>212750</td><td>배지에 필요</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>212750</td><td>배지에 필요</td></tr><tr><td>포도당</td><td></td><td>매체에 필요한</td>Fisher <td>D16-3</td></tr><tr><td>아세테이트 칼</td>륨 <td>매체에 필요한 Fisher</td><td>P171-500</td><td>매체에</td></tr><tr><td>필요한 글리세롤</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>매체에 필요한</td></tr><tr><td>검은색 96웰 유리 바닥 플레이트</td><td>MatTek</td><td>PBK96G-1.5.5-F</td><td>는 2.4단계에 필요합니다</td></tr></tbody></table>.

효율적인 포자 형성<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; 96 멀티 웰 형식으로

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

영양 스트레스 기간 동안 Saccharomyces cerevisiae는 포자 형성으로 알려진 배우자 형성을 겪습니다. 질소와 탄소가 부족한 이배체 효모 세포가 포자 형성 과정을 시작합니다. 포자 형성 과정에는 감수 분열 후 포자 형성이 포함되며, 여기서 반수체 핵은 환경 저항성 포자로 포장됩니다. 당사는 96개의 멀티웰 플레이트에서 발아 효모의 효율적인 포자 형성을 위한 방법을 개발하여 포자 형성 표현형에 대한 효모 세포를 스크리닝하는 처리량을 늘렸습니다. 이러한 방법은 적절한 최소 배지를 사용하는 경우 영양 선택이 필요한 플라스미드를 함유한 효모를 사용한 스크리닝 또는 풍부한 포자 전형성 요법을 사용하는 경우 게놈 변형이 있는 효모를 스크리닝하는 것과 호환됩니다. 우리는 이 방법의 경우 포자 형성 중 폭기가 포자 형성에 중요하다는 것을 발견했으며 96 멀티웰 플레이트 형식과 호환되는 충분한 폭기를 보장하기 위한 기술을 고안했습니다. 이러한 방법은 대용량 플라스크 기반 실험에서 달성할 수 있는 일반적인 ~80% 수준의 포자 형성을 달성하지 못하지만, 이러한 방법은 소량 멀티웰 플레이트에서 약 50-60% 수준의 포자 형성을 안정적으로 달성할 수 있습니다.

<html> 이 프로토콜을 평가하기 위해, (전술 한 바와 같이) 멀티 웰 플레이트에서 세포를 포자로부터 얻어진 포자 효율은 형틀 (표 2)에 큰 볼륨을 사용 포자 세포를 비교 하였다. 멀티 웰 플레이트의 사용은 ~ 8​​0 %의 효율은 통상적으로 볼 수있는 플라스크에 포자 볼 때 높은 효율을 달성하지 않았다. (유리 비드 또는 교반 막대로 제공됨) 적합한 통기 멀티 웰 플레이트에서 포자 것은 최적의 결과 (66 % 효율)를 5mm X 2mm 교반 막대를 사용하여 수득으로 충분한 포자 효율을 50 % 이상을 달성 할 수있다. 두 개의 서로 다른 균주 (야생 유형 및 smk1Δ)의 대표적인 포자는 여기 (그림 1) 표시됩니다. 이 세포는 포자 형성 배지에서 36 시간 후에 검사하고 96 웰 유리 바닥 판을 사용하여 시각입니다. <p class="jove_content" fo:keep-tog...

여기서 Saccharomyces cerevisiae의 포자 형성은 96 멀티웰 형식으로 수행됩니다.

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 96-웰 포맷에서 출아 효모를 효율적으로 포자 형성시키는 것입니다. 출아 효모를 대상으로 한 많은 대규모 스크리닝이 수행되어 왔으나, 감수 분열 및 포자 형성을 살펴보는 고처리량 연구는 제한적이었습니다. 본 비디오에서 설명하는 기술은 고처리량 스크리닝과 호환되는 96-웰 포맷에서 비용 효율적인 방식으로 효모를 효율적으로 포자 형성시킬 수 있다는 장점이 있습니다.저는 굴절성 포자를 형성하지 못하는 돌연변이의 고복제 억제 인자(high copy suppressors)를 스크리닝하기 위해 타일형 2µm 플라스미드 라이브러리를 사용하고자 하는 생각에서 처음으로 이 방법을 고안했습니다. 초기에는 96-웰 포맷에서 포자 형성 효율이 낮았는데, 이는 통기 부족으로 인한 것임을 발견했습니다.YPG(yeast extract peptone glycerol) 플레이트에 SK1 효모 균주를 해동하여 이 절차를 시작합니다. 멸균된 스틱을 사용하여 글리세롤 스톡이 담긴 냉동 보관 튜브에서 소량의 세포를 긁어내어 YPG 플레이트에 도말합니다. 효모를 30 °C에서 12~16시간 동안 배양합니다.다음으로, YPG 플레이트의 효모를 YPD(yeast extract peptone dextrose) 플레이트에 스트리킹하여 단일 콜로니를 형성합니다. 효모를 YPD 플레이트에서 30 °C로 24~48시간 동안 배양합니다. YPD 고체 배지에서 24~48시간 동안 배양한 후, YPD 플레이트의 단일 콜로니를 사용하여 25 mL YPD 배양액을 준비합니다.이 배양액을 30 °C의 진탕 배양기에서 220 RPM으로 세포의 OD600이 4.0에서 7.0에 도달할 때까지 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, YPD 배양액에서 적절한 양의 세포를 취해 OD600이 0.1이 되도록 yeast extract peptone acetate(YPA) 내에서 125 mL 배양을 시작합니다. OD600이 1.3에서 1.5 사이가 될 때까지 30 °C의 진탕 배양기에서 220 RPM으로 배양합니다.배양물을 원심분리 튜브로 옮기고, 벤치탑 원심분리기를 사용하여 1800X G에서 5분간 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 멸균 오토클레이브 처리된 탈이온수의 0.5 부피로 세포를 한 번 세척합니다. 다시 원심분리한 후 상청액을 제거합니다.세포를 1배 부피의 포자 형성 배지(sporulation media)에 다시 현탁합니다. 서로 다른 유전형의 세포를 준비하려면, 96웰 플레이트에 해동된 냉동 보관 세포를 먼저 YPG 고체 배지에 옮깁니다. 96핀 포거(frogger)를 화염 멸균한 후, 효모 콜로니에 접촉시키기 전 고체 배지 플레이트 위에서 잠시 식힙니다.효모를 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 균주의 유전자형에 따라 YPG 고체 배지에서 YPD 또는 선택 고체 배지로 세포를 옮깁니다. 본 시연에서는 YPD를 사용합니다.각 균주에 대해 콜로니가 형성될 때까지 효모를 30 °C에서 배양합니다. 96 딥웰 플레이트의 각 웰에 YPD 액체 배지 1.2 mL를 분주합니다. 고체 배지에서 세포를 액체 배지로 옮깁니다.직사각형 페트리 플레이트의 플라스틱 뚜껑으로 플레이트를 덮고, 테이프 한 조각을 사용하여 뚜껑을 고정함으로써 공기 순환을 최소한으로 제한합니다. 30 degree Celsius 셰이커에서 220 RPM으로 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 1800X G에서 5분 동안 원심 분리합니다.배지를 따라내고 각 웰에 YPA 500 microliters를 추가합니다. 그리고 펠릿화된 세포를 재현탁합니다. 테이프로 고정한 플라스틱 덮개로 플레이트를 덮습니다.세포를 30 °C의 진탕 배양기에서 220 RPM으로 15시간 동안 배양합니다. 효율적인 포자 형성을 위해 적절한 통기성을 제공하려면, 96-웰 플레이트의 각 웰에 3 mm 멸균 고체 유리 비드 하나 또는 5 mm x 2 mm 멸균 마그네틱 스터 바를 넣습니다. 모든 세포의 유전자형이 동일한 경우, 세포와 배지를 섞어 500 µL씩 96-멀티웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다.테이프로 고정한 플라스틱 덮개로 플레이트를 덮습니다. 세포들의 유전자형이 서로 다른 경우, YPA 배지에 있는 세포를 1800X G에서 5분 동안 원심분리하고 배지를 따라냅니다. 각 웰에 500 µL의 포자 형성 배지를 첨가합니다.그런 다음 펠렛화된 세포를 포자 형성 배지에 다시 현탁합니다. 플레이트를 플라스틱 뚜껑으로 덮고 테이프로 고정합니다. 유리 구슬을 사용하는 경우, 시료를 30 °C의 진탕 배양기에 넣고 220 RPM으로 진탕하여 포자를 형성시킵니다.마그네틱 스터 바를 사용하는 경우, 포자 형성을 위해 시료를 30 °C 인큐베이터 내부의 스터 플레이트 위에 놓습니다. 모든 스터 바가 활발하게 움직이고 배양액에 공기가 충분히 공급된다면, 마그네틱 바의 정확한 교반 속도는 매우 중요하지 않습니다. 36시간 후에 시료를 회수하여 포자 형성 진행 과정을 관찰합니다.각 포자 형성 배양액에서 6 µL의 세포를 취해 96-well 커버슬립 플레이트에 담긴 24 µL의 포자 형성 배지에 추가합니다. 도립 현미경으로 관찰하기 전, 세포가 가라앉을 때까지 5분 동안 기다립니다. 도립 현미경의 63X 대물렌즈를 사용하여 시각화한 세포 이미지에서 두 가지 서로 다른 균주의 대표적인 포자 형성 모습이 나타나 있습니다.화살표로 표시된 굴절성 4포자(refractile tetrads)를 야생형 배양액에서 확인할 수 있습니다. 하지만 포자 형성 결핍 smk1 결손 세포가 포함된 배양액에서는 보이지 않습니다. 멀티웰 플레이트에서 포자 형성시킨 세포와 플라스크의 더 큰 부피에서 포자 형성시킨 세포 간의 포자 형성 효율을 비교하였습니다.멀티웰 플레이트를 사용한 결과, 플라스크에서 포자 형성을 유도하는 일반적인 프로토콜에서 흔히 볼 수 있는 높은 효율에 도달하지 못했습니다. 적절한 통기 조건 하에 멀티웰 플레이트에서 포자 형성을 유도하면 50% 이상의 충분한 포자 형성 효율을 얻을 수 있으며, 5mm 교반 바를 사용했을 때 가장 좋은 결과가 나타났습니다. 하지만 소형 교반 바의 높은 비용을 고려할 때, 유리 구슬을 사용하여 얻은 효율 또한 그와 유사한 수준이었습니다.5 mm와 7 mm 교반바 모두 96-멀티웰 플레이트의 웰 내에 들어갈 수 있지만, 7 mm 교반바를 사용한 결과 포자 형성 효율이 저하되었습니다. 웰 내의 7 mm 교반바는 인접한 웰의 교반바와 상호작용하는 경향이 있습니다. 이는 교반바가 제대로 회전하는 것을 방해하여 배양액에 적절한 통기가 이루어지지 않게 합니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 96-웰 형식의 액체 배양에서 효모 세포를 효율적으로 포자 형성시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙달되면, 적절히 수행했을 때 이 과정은 6일 만에 완료될 수 있습니다. 이 절차는 다양한 돌연변이 균주, 플라스미드 또는 소분자 억제제가 감수 분열 및 포자 형성에 미치는 영향을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.이 기술이 개발된 이후, 이 기법은 감수분열 세포 주기의 조절 방식과 Saccharomyces cerevisiae의 포자 형성 과정에서 세포질 분열과 감수분열이 어떻게 결합되는지를 연구하는 데 사용되었습니다.

efficient-sporulation-saccharomyces-cerevisiae-96-multiwell

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

효모 세포의 미세 조작은 diploid의 zygotes을 선택 meiotic 유전 분석 또는 필요합니다. 이러한 micromanipulations은 해부 현미경의 microneedle를 사용하여 수행됩니다. microneedle는 세포를 재배치하는 데 사용됩니다 및 자동화의 다양한 학위와 함께 사용할 수 있습니다 micromanipulator에 의해 제어됩니다.

의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

GFP - 퓨전 단백질은 널리 공촛점 현미경에 의해 organelles을 시각화하는 데 사용됩니다. 그러나, organelles의 형태에 영향을 변이에 대한 검사는 일반적으로 개별적인 돌연변이 유발이 필요하며 시간이 소요됩니다. 여기, 우리는 동시에 효모 거의 5000이 아닌 필수적인 유전자에 organelle - GFP 표식을 통합하는 방법을 보여줍니다.

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

효모에서이 프로토콜에서 유전자 발현...

Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

여기에 플라스미드 overexpression 화면...

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

그린 몬스터 방법은 리포터 유전자 인코딩 녹색 형광 단백질로 표시된 여러 삭제의 급속한 조립이 가능합니다. 이 방법은 반복 삭제의 성적 구색의 사이클 등 삭제를 들고 세포의 형광 기반의 강화를 통해 효모 변종 운전에 기반을두고 있습니다.

여러 유전자 삭제를 운반 효모 종자의 생성에 대한 초록 괴물 프로세스

우리는 Saccharomyces cerevisiae에서 지시된 진화 캠페인을 위한 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

여기 선물이 지 수 성장 방정식에 Saccharomyces cerevisiae 의 지 수 성장 피팅 하 여 호흡과 발효 대사를 추정 하는 프로토콜. 운동 매개 변수 계산 발효 또는 미토 콘 드리 아 호흡 물질/화합물의 영향의 심사에 대 한 수 있습니다.

Saccharomyces cerevisiae 호흡과 발효 대사 분석을 배치 문화 지 수 성장 속도 론

여기에서, 우리는 연구원이 유사분열과 만두증 도중 살아있는 핵분열 효모 세포에 있는 단백질 행동 그리고 핵 역학을 공부하는 것을 허용하는 비 독성 현미경 검사법인 살아있는 세포 화상 진찰을 제시합니다.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

우리는 극저온 전자 단층 촬영을 통해 대용량 분자의 고해상도 구조 연구를 위해 극저온 중심이온 빔 마이크로머시닝에 의한 급락 냉동 생물학적 표본의 라멜라 제제를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 사카로미세스 세레비시아에내부의 거대 분자의 구조적 특성화를 위한 높은 재현성을 가진 고품질 라멜라의 제조를 위한 지침을 제공한다.

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

구리 성장 분석인 ACT1-CUP1 분석은 전구체 메신저 RNA(pre-mRNA) 스플라이싱과 돌연변이 스플라이싱 인자가 스플라이세오솜 기능에 미치는 영향에 대한 빠른 판독을 제공합니다. 이 연구는 프로토콜을 제공하고 관심 있는 접합 문제를 해결하기 위해 가능한 사용자 정의를 강조합니다.

ACT1-CUP1 분석은 신진 효모에서 스플라이세오솜 돌연변이체의 기질 특이적 민감도를 결정합니다.

학습하세요 Saccharomyces cerevisiae의 96-웰 포자 형성 방법으로 고효율 대량 스크리닝을 수행하는 기술입니다. 최적화된 통기 조건으로 효율성을 높이고 유전자 라이브러리 선별에 활용할 수 있습니다.

효율적인 포자 형성

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