효율적인 포자 형성 사카로 마이 세스 세레 비지에 96 멀티 웰 형식으로

이 프로토콜의 전반적인 목표는 싹을 틔우는 효모를 96웰 형식으로 효율적으로 포자화하는 것입니다. 싹이 트는 효모에 대해 많은 대규모 스크리닝이 수행되었지만, 감수분열 및 포자 형성을 살펴보는 고처리량 연구는 제한적이었습니다. 이 비디오에 설명된 기술은 고처리량 스크리닝과 호환되는 96웰 형식에서 비용 효율적인 방식으로 효모를 효율적으로 포자화하는 장점이 있습니다.

제가 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올린 이유는 굴절성 포자를 형성할 수 없는 돌연변이의 고복제 억제인자를 스크리닝하기 위해 타일형 2미크론 플라스미드 라이브러리를 사용하고 싶었기 때문입니다. 처음에는 96웰 형식에서 포자 형성 효율이 좋지 않았습니다. 나는 이것이 부적절한 통기 때문이라는 것을 알았습니다.

SK1 효모 균주를 효모 추출물 펩톤, 글리세롤 또는 YPG 플레이트에 해동하여 이 절차를 시작합니다. 멸균 스틱을 사용하여 글리세롤 스톡이 들어 있는 냉동 바이알에서 소량의 세포를 긁어내고 YPG 플레이트에 펴 바릅니다. 섭씨 30도에서 12-16시간 동안 효모를 배양합니다.

다음으로, YPG 플레이트의 효모를 효모 추출물 펩톤 덱스트로오스(YPD) 플레이트(단일 콜론용 플레이트)에 줄무늬를 그립니다. 섭씨 30도에서 24-48시간 동안 YPD 플레이트에서 효모를 성장시킵니다. YPD 고체 배지에서 24-48시간 동안 성장한 후 YPD 플레이트의 단일 콜로니를 사용하여 25ml YPD 배양을 시작합니다.

세포가 4.0에서 7.0의 OD600에 도달할 때까지 섭씨 30도의 진탕 인큐베이터에서 220RPM으로 하룻밤 동안 이 배양액을 성장시킵니다. 다음 날, YPD 배양에서 적절한 양의 세포를 사용하여 효모 추출물 펩톤 아세테이트(YPA)에서 OD600이 0.1인 125ml 배양을 시작합니다. OD600이 1.3에서 1.5 사이가 될 때까지 섭씨 30도 진탕 인큐베이터에서 220RPM으로 배양물을 성장시킵니다.

배양액을 원심분리 튜브로 옮기고 탁상용 원심분리기에서 1800X G로 5분 동안 회전시켜 세포를 펠릿화합니다. 0.5 부피의 멸균 오토클레이브 탈이온수로 세포를 한 번 씻습니다. 다시 돌리고 물을 버리십시오.

1X 부피의 포자 형성 배지에 세포를 재현탁합니다. 다양한 유전자형의 세포를 준비하기 위해 96 멀티웰 플레이트에서 해동된 냉동 스톡의 세포를 먼저 YPG 고체 배지로 전달합니다. 96구 개구리를 불에 태운 다음 효모 군체에 닿기 전에 단단한 매체 접시에서 잠시 식힙니다.

효모를 섭씨 30도에서 밤새 키웁니다. 다음 날, 균주의 유전자형에 따라 YPG 고체 배지의 세포를 YPD 또는 선택적 고체 배지로 옮깁니다. 이 데모에서는 YPD가 사용됩니다.

각 균주에 대해 군체가 형성될 때까지 섭씨 30도에서 효모를 성장시킵니다. 1.2 ml의 YPD 액체 매체를 96 딥 웰 플레이트의 각 웰에 분취합니다. 고체 매체에서 액체 매체로 세포를 옮깁니다.

직사각형 페트리 플레이트의 플라스틱 뚜껑으로 플레이트를 덮고 공기 순환을 최소화하기 위해 테이프 조각을 사용하여 뚜껑을 제자리에 고정합니다. 섭씨 30도의 셰이커에서 220RPM으로 밤새 세포를 성장시킵니다. 다음 날, 1800X G에서 5분 동안 원심분리기를 합니다.

미디어를 붓고 각 웰에 500마이크로리터의 YPA를 추가합니다. 및 펠렛화된 세포를 재현탁시키는 단계를 포함한다. 테이프로 고정된 플라스틱 뚜껑으로 접시를 덮습니다.

섭씨 30도의 진탕 인큐베이터에서 220RPM으로 15시간 동안 세포를 성장시킵니다. 효율적인 포자 형성을 위한 적절한 폭기를 제공하려면 96웰 플레이트의 각 웰에 3mm 멸균 고체 유리 비드 1개 또는 멸균 5mm x 2mm 마그네틱 교반 막대를 추가합니다. 모든 세포가 동일한 유전자형인 경우 500마이크로리터의 세포와 배지를 96-멀티웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다.

테이프로 고정된 플라스틱 뚜껑으로 접시를 덮습니다. 세포의 유전자형이 다른 경우 YPA에 있는 세포를 1800X G에서 5분 동안 회전시키고 배지를 붓습니다. 각 웰에 500마이크로리터의 포자 형성 매체를 추가합니다.

그리고 포자 형성 배지에서 펠릿화된 세포를 재현탁시킵니다. 테이프로 고정된 플라스틱 뚜껑으로 접시를 덮습니다. 유리 구슬을 사용하는 경우, 샘플을 섭씨 30도의 진탕 인큐베이터에 넣고 포자 형성을 위해 220RPM으로 흔듭니다.

마그네틱 교반 막대를 사용하는 경우, 포자 형성을 위해 섭씨 30도 인큐베이터 내부의 교반 플레이트에 샘플을 놓습니다. 마그네틱 바의 정확한 교반 속도는 모든 바가 에너지적으로 움직이고 배양물이 폭기되는 한 그다지 중요하지 않습니다. 36시간 후, 샘플을 회수하여 포자 형성을 통한 진행 상황을 모니터링합니다.

각 포자 배양액에서 6마이크로리터의 세포를 회수하고 96웰 커버슬립 플레이트에 24마이크로리터의 포자 형성 배지를 추가합니다. 도립 현미경을 사용하여 검사하기 전에 세포를 5분 동안 가라앉히도록 둡니다. 두 가지 다른 균주의 대표적인 포자 형성은 도립 현미경에서 63X 대물렌즈를 사용하여 시각화된 세포의 이미지에 나와 있습니다.

화살촉으로 표시된 내화성 테트라드는 야생형 문화에서 볼 수 있습니다. 그러나 포자 형성이 결핍된 smk1 삭제 세포를 포함하는 배양에서는 그렇지 않습니다. 멀티-웰 플레이트(multi-well plate)에서 포자화된 세포와 플라스크에서 더 큰 부피를 사용하여 포자화된 세포의 포자형성 효율을 비교했습니다.

다중 웰 플레이트의 사용은 플라스크에서 포자화의 보다 일반적인 프로토콜을 사용할 때 일상적으로 볼 수 있는 높은 효율을 달성하지 못했습니다. 적절한 폭기로 다중 웰 플레이트에서 포자화하면 50% 이상의 충분한 포자 형성 효율을 달성할 수 있으며 5mm 교반 막대를 사용하여 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 그러나 작은 교반 막대의 높은 비용을 감안할 때 유리 구슬을 사용하여 얻은 효율성은 비슷합니다.

5mm 및 7mm 교반 막대는 모두 96-멀티웰 플레이트의 웰 내에 맞지만 7mm 교반 막대를 사용하면 포자 형성 효율이 떨어졌습니다. 우물에 있는 7mm 교반 막대는 인접한 우물에 있는 교반 막대와 상호 작용하는 경향이 있습니다. 막대가 제대로 교반하는 것을 방지하고 배양에 적절한 통기를 제공합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 96웰 형식의 액체 배양에서 효모 세포를 효율적으로 포자화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 과정을 완전히 익히면 제대로 하면 6일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 다양한 돌연변이 균주, 플라스미드 또는 소분자 억제제에서 감수분열 및 포자 형성에 미치는 영향을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.

개발 후, 이 기술은 감수분열 세포주기의 조절과 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 포자 형성에서 사이토키네시스(cytokinesis)와 감수분열(meiosis)이 어떻게 결합되는지를 연구하는 데 사용되었습니다.