Name: 발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 배우세요 애기장대 원형질체 발광 이미징을 이용한 일주기 리듬 신속 분석법. 안정적 형질전환 계통 없이 돌연변이의 주기를 측정하여 생체시계 유전자 기능 연구에 활용할 수 있습니다.

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luciferase reporter plasmid와 초기 방법 개발에 대해 David Somers 교수님과 김정식 박사님께 감사드립니다. Karen Halliday 교수는 친절하게도 이 연구에 사용된 모든 일주기 돌연변이 세포주를 제공해 주었습니다. 이 연구는 RS120372 및 RS140275 왕립 학회 연구 보조금의 지원을 받았습니다. GvO는 Royal Society University Research Fellow(UF110173)입니다.

참고 :이 프로토콜에서 설명 시약 및 볼륨 테스트 애기 줄에 표시되고, 그 유전자형에 대한 여섯 복제 우물 발생합니다. 하나 이상의 선을 분석 할 때 라인의 개수와 재료를 곱 분석한다. (추가 라인에서 대표적인 결과를 후속 제공 하겠지만) 비디오에서 야생형 애기는 주기성 시계 돌연변이 광고 ZTL 비교한다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 효소액 </td><td></td></tr><tr><td> 셀룰라아제 </td><td> 0.5 % (W / V) </td></tr><tr><td> 펙 티나 R10 </td><td> 0.25 % (w / v)의 </td></tr><tr><td> D- 만니톨 </td><td> 400 밀리미터 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td><td> 10 mM의 </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 20 mM의 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 0.1 % (W / V) </td></tr><tr><td> MES, pH가 5.7 </td><td> 20 mM의 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> W5 솔루션 </td><td></td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 150 밀리미터 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td><td> 125 밀리미터 </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 5 밀리미터 </td></tr><tr><td> MES, pH가 5.7 </td><td> 2 밀리미터 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 5 밀리미터 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> MMG 솔루션 </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH가 5.7 </td><td> 4 mM의 </td></tr><tr><td> D- 만니톨 </td><td> 400 밀리미터 </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 </td><td> 15 mM의 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG 솔루션 </td><td></td></tr><tr><td> PEG 4000 </td><td> 40 % (W / V) </td></tr><tr><td> D- 만니톨 </td><td> 200 밀리미터 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td&gt; <td> 100 밀리미터 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> 이미징 솔루션 </td><td></td></tr><tr><td> W5 솔루션 </td><td> 최종 부피 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 5 % (V / V) </td></tr><tr><td> 루시페린 </td><td> 1.2 밀리미터 </td></tr><tr><td> 암피실린 </td><td> 50 ㎎ / ㎖ </td></tr></tbody></table> 표 1 : 솔루션의 목록입니다. 재료 및 버퍼의 1. 준비 <ol><li> 식물 재료 <ol><li> 애기 장대 골 유지 -0 물에 씨앗을 1.5 ml의 튜브에 4 ° C에서 어둠 속에서 나흘. 냄비에 흙 위에 씨앗을 피펫 7 일 동안 21 ° C에서 긴 하루 조건 (16 시간 등 8 시간 어둠)에 전송할 수 있습니다. 높은 습도를 보장하기 위해 3 일을 위해 냄비에 뚜껑을 둡니다. 이식 여섯 새로운 8cm X 13cm X 5cm 냄비에 모종 및 anoth에 대해 동일한 조건에서 식물 성장 계속이십일일 어. 토양이 전체에 습기가 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 리포터 플라스미드 <ol><li> 제조자의 지시에 따라 DNA 분리 키트를 이용하여 사전에 세균 배양 LUC 리포터 플라스미드 19 : CCA1pro 정제. 참고 : 20 μg의 리포터 플라스미드는 형질 전환을위한 (DH 2 O 2 μg의 / μL에 10 μl를)가 필요합니다. </li></ol></li><li> 솔루션 주 :이 다섯 해결책이 필요한 프로토콜의 경우 : 효소 용액을 워시 5 (W5) 용액, 만니톨 - 마그네슘 (MMG) 용액에, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 수용액 및 이미징 솔루션 (표 1). 원형질체 분리 단계를 계속하기 전에 다음을 준비합니다. <ol><li> 표 1에 따라 효소 용액 10 ㎖를 준비 효소 마지막으로 추가하고, 필터를 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 살균 용액. </li><li> 다음 볼륨에 남아있는 솔루션을 준비 : 15 ml의 W5 용액, 10 ml의 MMG의olution, 1 표 1에 따라 ml의 PEG 용액 1.5 ml의 이미징 솔루션을 제공합니다. 참고 :이 PEG 솔루션은 PEG가 완전히 용해 된 것을 확인하기 위해 형질 전에 시간보다 더 적게 준비하는 것이 중요합니다. 필터는 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 이미징 솔루션 살균. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> 그림 1 :. 원형질체 분리 성인 애기 장대 식물 (A)의 잎은 하부 표피 층 (B)를 향 오토 클레이브 테이프에 고정되어있다. (C) 매직 테이프 부드럽게 15ml의 원뿔형 튜브의 선단과 하부 표피층에 가압된다. (D) 매직 테이프 엽육 세포 (E)를 노출시키기 위해 제거된다. (F) 휴가와 오토 클레이브 테이프의 스트립첨부의이 용액에 원형질체를 방출 효소액 함유 셀룰라아제와 펙 티나​​에 뜨게된다. (G)는 해골 효소 분해 후 오토 클레이브 테이프에 남아 있고 잎은 효소 용액 (H)의 원형질체를 떠나, 삭제됩니다. (I) 최종 결과 엽육의 원형질체 (스케일 바 = 50 μm의). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2. 원형질체 분리 <ol><li> 페트리 접시에 레이블을 10 ml의 필터 살균 효소 솔루션을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 깨끗한 실험실 표면에 접착면이 위로와 오토 클레이브 테이프의 네 개의 스트립을 수정 한 스트립의 배양 접시의 크기를 표시합니다. </li><li> (4 주 오래된 식물 (그림 1a)의 잎을 잘라와 위를 향하도록 하부 표피 표면, 즉 (오토 클레이브 테이프에 상부 표피를 누르십시오 <stroNG&gt; 그림 1b)). </li><li> 조심스럽게 15 ML 원뿔 튜브를 사용하여 하부 표피 표면에 매직 테이프의 스트립을 누릅니다. 잎 조직 (그림 1C)을 분쇄 않도록주의하십시오. 조심스럽게 낮은 표피를 제거하는 마법의 테이프를 떼어 (그림 1D)와 엽육 세포를 (그림 1E)를 노출합니다. </li><li> 페트리 접시에 테이프를 이동하고 효소 용액 (그림 1 층)에 떠있는, 사용 핀셋을 배양 접시에 맞게 오토 클레이브 테이프를 잘라, 아래로 향하게 둡니다. 원형질체이 용액에 출시 될시 60 분을위한 플랫폼 통에 60 rpm으로 회전합니다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 원형질체 (그림 1 시간)을 포함하는 용액을 제거하고 오토 클레이브 테이프 (그림 1g)의 스트립을 폐기하고 피펫 핀셋을 사용합니다. 넓은 구멍 피펫 팁을 (예 : P5000 끝이나 끝과 P1000 팁이 차단 등) 사용합니다. </li><li> 100 ×에서 원형질체를 원심 분리기4 ° C에서 3 분 동안 g 및 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 펠렛은 매우 느슨로,주의하십시오. </li><li> 부드럽게 튜브를 소용돌이 10 ML의 W5의 원형질체에 솔루션에 resuspend을 추가합니다. </li><li> 30 ~ 60 분 동안 얼음에 원형질체를 휴식. 이 단계에서, 혈구 (그림 1I)에 원형질체를 계산하여 수율을 평가합니다. </li><li> 4 ° C에서 3 분 동안 100 × g에서 원심 분리하여 원형질체를 수집하고 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 펠렛은 매우 느슨로,주의하십시오. </li><li> MMG 용액에 5 × 105 원형질체 / ml의 농도로 재현 탁 원형질체. </li></ol> 3. 원형질체 형질 <ol><li> 15 ML 원뿔 관에 10 μl의 리포터 플라스미드 (2 μg의 / μL)를 추가합니다. </li><li> 튜브에 400 ㎕의 원형질체를 추가합니다. </li><li> 하나의 볼륨 (410 μL) PEG 솔루션을 추가하고 원형질체를 형질 부드럽게 12 번 튜브를 반전하여 섞는다. </li><li> 8-15 분 INC 후실온에서 ubation는 4 권 (1640 μL) W5 용액과 원형질체-DNA-PEG 혼합물을 희석하고 부드럽게 여섯 번 반전 섞는다. </li><li> 실온에서 2 분 동안 100 XG에서 원심 분리에 의해 형질 전환 된 원형질체를 수집하고 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 펠렛은 매우 느슨로 다시 한 번,주의하십시오. </li><li> 1250 ㎕의 이미징 솔루션의 원형질체를 재현 탁. </li><li> 육으로 나누어지는 200 μL는 W5 솔루션 빈 우물을 작성 및 발광 영상에 적합한 접착제 명확한 뚜껑 접시를 밀봉, 96 웰 플레이트의 우물을 복제합니다. </li></ol> 4. 이미지 <ol><li> 식물의 이미지에 적합한 임의의 발광 이미지 설정에 접시를 전송합니다. 우물 사이에 응축 압력 차이를 방지하기 위해 전송 후 판 10 ~ 15 분에 접착제 뚜껑을 변경 한 후 촬영을 시작합니다. 플레이트를 실온에서 5 일 동안 모든 ~ 45 분 (3 초 아니라 당) 참조하십시오. 참고 :판의 주파수를 읽고 잘 당 판독 시간은 영상 설정에 따라 달라질 수 있습니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 모든 분석 소프트웨어 (예를 들면, 생체 리듬 분석 소프트웨어 시스템 (BRASS) 22)를 이용하여 발광 결과를 분석한다. 일중 결함을 나타 내기 위해 야생 형 컨트롤 돌연변이 라인을 비교합니다. </li></ol>

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</ol>

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여기, 우리는 원형질체 분리, 형질 전환 및 luminecent 영상을 포함한 애기 라인의 circadian 기간 결함을 화면에 신속한 분석을 제시한다. 야생형의 일주기 기간 애기 장대와 시계 돌연변이 cca1 / lhy, ZTL 및 CCA1 -ox는 CCA1pro에서 발광 측정으로부터 계산 하였다 : LUC 기자와 더 많은 시간 -를 사용하여 전체 식물에서 생성 된 게시 된 데이터와 일치하는 것으로 소비 형질 전환 방법 (표 2). 애기 돌연변이를 스크리닝이 분석을 사용하여 시간이 걸리고 전용 특정 돌연변이는 야생형 리듬을 나타내는 것으로 밝혀 수도 형질 발광 라인을 생성하도록 초기 조건을 회피한다. 이 프로토콜의 명확한 장점은 애기 장대 라인은 식물의 타임 키핑에 영향을 미치는 많은 유전자의 식별 도움이 될 것 변경된 주기성 전사 리듬을 위해 짧은 시간에 상영 될 수 있다는 것이다. (26, 27)에 도달하도록하는 효소 용액으로 스트립 침투 얇은 스트립 진공으로 잎 또는 모종 절단 포함한다. 후속 소화 효소 용액으로 원형질체를 분리하는 어두운 적어도 3 시간 동안 배양을 필요로한다. 진공 침투가 적용되지 않는 경우 18 시간까지 배양 시간의 최대 권장된다. 효소로 꿰 뚫을 표피 세포층이 테이프에 의해 제거되기 때문에 여기에 제시된 프로토콜에서 진공 함침이 불필요하다. 식물 재료를 절단하여 원형질체를 생성 할 때 이것은 소화 후 세포벽 파편 원형질체로부터 분리 할 필요가있다; 이것은 일반적으로 상기 용액을 여과 또는 당 그라데이션 27,26에 정제가 수행된다. 여기에, 모든 소화되지 않은 조직은 오토 클레이브 테이프 이후에 남아소화 원형질체 여과 설탕 구배 정제를 생략 할 수 있도록. 장기간 protoplasting 절차에 기인하는 응력이 세포 생존 및 주기성 시계에 영향을 미치는 가능성이있다. 여기 시각화 테이프 기반 protoplasting 방법 (20)는 원형질체의 높은 숫자를 산출; 및 주기성 시계열상에서 세포의 생존 능력을 부여하고 원형질체 및 전체 모종 (표 2)의 정합 기간의 길이는 여기에 설명 된 방법은 원형질체를 생성하는 다른 방법에 비해 바람직하다. 프로토콜의 형질 전환 단계는 원형질체의 생존에 미치는 영향 중요한 단계이다. 페그 용액을 세포 내로 전달하는 DNA, 두 배양 시간이 용액에 (단계 3.4) 및 실험적으로 결정되어야한다 PEG의 비율을 가능하게한다. 표준 농도 변환 효율 및 높은 저감 낮은 농도로 20 % 인생존 (28)을 감소 농도. 오분 같은 짧은 배양 시간은 원형질체 (27)의 효율적인 형질 전환을 수득 할 수있다. 원형질체는 어떤 발광 이미징 플랫폼에서 이미지화 할 수있다. 이 비디오에서는, 우리는 높은 처리량 검사 및 자주 측정 할 수 있습니다 (~ 20 μE의 결합 강도에 각각 빨간색과 파란색의 LED, 630 및 470 nm의) 외부 조명이 장착 된 발광 플레이트 리더를 사용하고 있습니다. 조명 광합성 사용할 바와 같은 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 기반 대안 플레이트 리더 나 설정 등의 발광을 검출하고, 다른 촬상 장치는, 긴 똑같이 잘 적용될 수있다. 제어 가능한 캐비닛에 장착 된 CCD 카메라를 사용하는 장점은 가볍고 온도를 프로그래밍 할 수있다. 단점은 교란에 추가하여 원형질체에 스트레스를 일으킬 수 어둠의 장기간을 도입, 긴 캡처 시간내생 계시를 보내고. 에 관계없이 선택 실험하는 플랫폼의 설정을 조정 모종 또는 성숙한 식물에 대한 설정과 비교해야 할 것으로 보인다. 우리의 경험에서 영상 버퍼에 형질 전환 및 / 또는 루시페린 동안 리포터 플라스미드의 농도를 증가시키는 것은 초기 실험에서 발생할 수있는 불규칙하거나 빠르게 둔화 리듬을 해결할 수 있습니다. 미래의 실험에서, 여기에 설명 된 방법은 임의의 돌연변이 애기 라인의 주기성 표현형 연구에 적용될 수있다. 약간의 수정과 함께, 계시에 예를 들어, 다양한 약물의 효과는이 설정에서 연구 할 수있다. 또한, 형질 감염은 또한이 프로토콜의 다양성을 확대 19 유전자 침묵 인공 마이크로 RNA를 포함하도록 수정 될 수있다. 쌀 원형질체를 생성하는 프로토콜 29 잘 확립되어 있으며 여기에 제시된 촬상 프로토콜 동등 우리 U를 더욱 적용될 수있다경제적으로 중요한 단자엽 작물의 시계 nderstanding.

대부분의 생명체는 환경에 대한 매일의 변화를 효율적으로 협상을 돕기 위해 내생 시계를 가지고있다. 이 시계의 일 주기성 시계는 외부 환경에서 예측 가능한 변화를 예측하는 생물의 신진 대사와 생리학의 여러 측면을 조절한다. 4 - 예를 들어 식물에서, 시간적으로 예측 병원균이나 초식 동물의 공격을 예상 강하게 전체 감수성 1을 줄일 수 있습니다. 전분 대사는 긴밀하게 길거나 짧은 하루 조건 5에서 성장 여부를 새벽까지 마지막 전분 매장량을 보장하기 위해 일 주기성 시계에 의해 조절된다. 실제로, 24 시간의 환경 쇼 증가 성장률 일치 주기성 시계 식물, 탄소 고정 률과 생존율 동안 부정합 (6)의 클럭을 실행하는 식물에 비해. 이 모든 과정에서 활동 일주기의 광범위한 영향은 세 번째까지의 리듬 규정에서 크게 발생애기 장대 (7) 총 사체의. 이러한 리듬 유전자 산물이 대사 경로 호르몬 신호 및 스트레스 반응 7 세포 과정을 포함하는 넓은 범위에 포함된다. 그 꼭대기에, 단백질 기능을 직접 주기성 조절이 인산화 8 일주기 규제와 아마 다른 번역 후 변형 (PTMS)에 의해 설정됩니다. 이 매일 전사 재 프로그램을 구동하는 일 주기성 시계의 중심에 / 번역 피드백 아침 발현 유전자를 포함하는 (TTFLs을), 루프 전사의 네트워크 거짓말 발현을 억제 주기성 시계 ASSOCIATED 1 (CCA1) 및 LATE 연장 배축 (LHY) - 11 LUX ARRHYTHMO (LUX), 개화 3 (ELF3), 및 ELF4 9, 저녁 유전자 CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) 저녁 복합체 (EC)의 구성원의 타이밍의. 함께 지혜H 의사 RESPONSE 레귤레이터 -genes (PRR3, 5, 7, 9) EC가 양의 레귤레이터 (12)로서 작용하는 반면, TOC1가 CCA1 / LHY 발현을 억제한다 - 14. TTFL 네트워크 구성 요소의 피드백 메카니즘에 추가적인 전사 후 및 번역 후 조절은 튜닝 활동 일주기에서 중요한 역할을한다. 현재까지, 일 주기성 시계 단백질에 확인 된 가장 풍부한 PTM은 인산화 (15)이다. 카제인 키나제 2 (CK2)에 의해 CCA1의 인산화는 발기인 16을 대상으로 바인딩과 주기성 시계 (17)의 온도 보상을위한 중요한 영향을 미친다. PRR 단백질이 차등 일주기 사이클에 인산화 및 TOC1의 인산화가 부정적인 레귤레이터와의 상호 작용에 영향을 미치는되어, 저녁 - 위상 클럭 구성 요소 ZEITLUPE (ZTL) 18. 이러한 예는 설명 방법을 24 시간에 PTMS 및 단백질 - 단백질 상호 작용을 조정 TTFL 네트워크전사 발진기. 전사 시계 네트워크 및 규제에 대한보다 자세한 소개는, 우수한 최근 리뷰 (예를 들어 기준 15)을 사용할 수 있습니다. 그러나 무엇 불분명 남아있는 것은 리듬 조절 과정과 세포 대사의 다른 측면은 다시 계시 메커니즘 자체에 공급하는 정도입니다. 시계 결함에 대한 애기 장대 돌연변이의 광범위한 선별 메커니즘 또는 신호 전달 경로가 TTFL 네트워크에서 24 시간 리듬의 생성에 관여 할 수있는 더 이해를 얻을 수 있습니다. 이를 위해 김 써머 이전에 어떤 애기 라인 (19)에 시계 기능의 효율적이고 신속한 분석을위한 돌파구 방법을 발표했다. 원형질체의 과도 발현의 사용에 기초하여,이 방법은 안정한 형질 전환 라인에 대한 필요성을 능가 또는 형광 마커 클록 라인에 교차. 여기에, 우리는 높은 항복 원형질체의 isolatio을 시각화최적화 프로토콜과 함께 해당 방법 20 96- 웰 플레이트 판독기에서 일시적으로 발현 클록 마커 발광 이미징에 의해 주기성 결함을 선별한다. 우리는 변경된 활동 일주기를 감지 여기에 성공적으로 설명하는 방법을 확인하기 위해 잘 특성화 시계 돌연변이 체에 야생형 Col- 0 애기을 비교합니다. LUC 19 : CCA1pro,이 라인에서 파생 된 원형질체는 주기성 CCA1 발기인에서 반딧불의 루시 페라을 표현 리포터 구조로 형질된다. 루시퍼 라제는 이러한 원형질체의 기간의 진폭 및 전사 리듬의 위상을 평가 시간이 지남에 이미징되는 광 출사 21 oxyluciferin 루시페린이 전자적으로 여기 된 변환 된 다단계 반응을 촉매. 프로토콜은 세 개의 주요 부분으로 구성된다; 리포터 플라스미드 및 발광 IM로 원형질체를 형질 감염, 원형질체를 분리노화. 이들 세 부분은 항상 새로 제조 완충액 및 시약을 사용하여 매일 수행한다. 식물 성장 및 리포터 플라스미드 충분한 양의 정제를 미리 수행되어야하며, 이러한 프로토콜에서 가시화되지 않는다.

<table><tbody><tr><td>셀룰라아제, Trichoderma viride&nbsp; </td><td>Merck Millipore</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>펙티나제 R10</td><td>시그마 알드리치</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>D-만니톨</td><td>시그마 알드리치</td><td>M4125&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Acros 유기물</td><td>327765000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros 유기물</td><td>327300010</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Fischer Scientific</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 4000</td><td>Acros 유기물</td><td>434630010</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Firefly</td><td>Biosynth AG</td><td>L-8200</td><td>루시페린 분말을 0.1M 트리인산염 완충액 pH 8.0에 50mM</td></tr><tr><td>암피실린</td> 농도로 용해 <td>Sigma Aldrich</td><td>A9618</td><td></td></tr><tr><td>준수 증기 표시기 테이프</td><td>3M</td><td>1222</td><td></td></tr><tr><td>매직 테이프</td><td>3M</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>과학 실험실 용품</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, 96 well, flat bottom, white</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655075</td><td></td></tr><tr><td>TopSeal-A, 96-well plate용 접착 뚜껑</td><td>Perkin Elmer</td><td>6050195</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 10 ml, w/o needle</td><td>BD Plastipak</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter 0.22 &micro; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td><td></td><td></td><td>amillar.org 에서 무료 다운로드</td></tr><tr><td>QIAfilter Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12262</td><td></td></tr><tr><td>Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell</td><td>Hawksley</td><td>AC6000</td><td></td></tr><tr><td>명시야 현미경</td><td>Optika Microscopes</td><td>B-150POL-B</td><td></td></tr><tr><td>LB942 TriStar2 다중 모드 리더, 발광 모듈 포함</td><td>Berthold Technologies Ltd</td><td>57947/57948</td><td></td></tr></tbody></table>

발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

식물 생체 시계는 환경에 대한 매일의 변화를 예상할 수 있게 해줍니다. 이러한 기대는 시간적으로 예측 가능한 생물적 스트레스와 비생물적 스트레스에 대한 반응을 돕는다. 반대로, 일주기 시간 유지의 중단은 식물 건강을 심각하게 손상시키고 농작물 수확량을 감소시킵니다. 따라서 식물의 일주기 리듬의 복잡한 조절을 이해하는 것이 필수적이며, 여기에는 전사 시계태엽 자체의 움직임에 영향을 미치는 요인이 포함됩니다.
모델 식물 애기장대(Arabidopsis)에서 일주기 결함을 테스트하는 것은 전통적으로 특정 돌연변이 계통을 일주기 시계 유전자 프로모터에서 반딧불이 루시페라아제를 리드미컬하게 발현하는 선으로 교차하는 것을 포함합니다. 이 접근 방식은 힘들고 시간이 많이 걸리며 돌연변이가 일주기 표현형이 없는 경우 효과가 없을 수 있습니다. 여기에 제시된 방법론을 통해 일주기 표현형의 신속한 초기 평가를 수행할 수 있습니다. 돌연변이 및 야생형 애기장대(Arabidopsis)에서 유래한 원형질체(Protoplast)를 분리하고, 리드미컬하게 표현된 발광 리포터(luminescent reporter)로 transfection하고, 5일 동안 일정한 빛 조건에서 이미지화합니다. 발광 흔적은 돌연변이 식물의 자유 실행 기간이 야생형 식물과 다른지 여부를 직접 밝힐 것입니다. 이 방법의 장점은 돌연변이 배경에서 안정적으로 형질전환 발광 클록 마커 라인을 생성할 필요 없이 모든 Arabidopsis 라인을 효율적으로 스크리닝할 수 있다는 것입니다.

야생형 애기 장대의 원형질체 cca1 / lhy (단기간 변이체 2) ZTL (장기간 돌연변이 23)과 과발현 라인 CCA1 -ox가 (24 부정맥) 공지 클럭 돌연변이 비교 하였다. 모두 일시적으로 CCA1pro로 형질했다 : LUC 기자 5 일 동안 플레이트 리더에 일정한 빛 군데. 여기에서 우리는 cca1 / lhy 돌연변이에, 일주기 조절 유전자 발현의 자유 실행 기간이 발광 시계의 안정적인 형질 발현이 2,9 마커 분석 게시 기간과 일치, (그림 2a)를 단축 것을 보여줍니다. ZTL 돌연변이의 원형질체의 일 주기성 진동의주기는 야생형보다 더 긴 (그림 2B), 모종에서 이전에 게시 된 결과에 따라, 세포 현탁액의 cultu입술과 원형질체 19,23,25. CCA1의 과발현은 아침 상에 시계를 고정 및 글로벌 전사는 부정맥 (24)가된다. CCA1의 -ox의 원형질체 (그림 2C)에서 LUC 식 : 지속적으로, 우리는 CCA1pro에는 진동을 관찰합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> 그림 2 : Col- 0, cca1 / lhy, ZTL 및 CCA1의 원형질체 활동 일주기 원형질체 -ox 일시적으로 CCA1pro로 형질 전환 하였다 : LUC는 구성과 발광의 활동 일주기 5 일 동안 몇 군데 있었다 (A - C). (D) 골 -0, cca1 / lhy 및 ZTL에 발광 흔적에 따라 일주기 기간 추정치 (A - B). 나를± SEM은, N = 3-5, 표시 t 테스트 p- 값으로. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 유전자형 </td><td> 기간 (원형질체) </td><td> 기간 (유전자 변형) </td><td> 에 의해보고 : </td><td> 참조 </td></tr><tr><td> Col- 0 </td><td> 23.0 ± 0.21 </td><td> 24.4 ± 0.09 </td><td> pCCA1 : 골에 LUC -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> cca1 / lhy </td><td> 20.6 ± 0.13 </td><td> 19.9 ± 0.11 </td><td> pCCA1 : 골에 LUC -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> L 어 배경 RNA </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ZTL </td><td> 25.1 ± 0.12 </td><td> 27.4 ± 0.5 </td><td> CAB2 : C24 생태형에 LUC </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 -ox </td><td> 부정맥 </td><td> 부정맥 </td><td> pCCA1 : LUC (LD 데이터 전용) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 부정맥 </td><td> 골 -0 배경에 RNA와 단백질 </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> 표 2 : 형질 전환 모종에 비해 원형질체의 활동 일주기 pCCA1의 일주기 기간 :. 기간의 첫 번째 돌연변이보고 길이와, 가능한 경우와 비교하여 원형질체에 LUC 식 pCCA1과 : 골 -0에 LUC 식입니다.

주기성 시계는 애기 사체의 제에 대한 규제 만 계시로 피드백 유전자의 비율은 알 수없는 남아 있습니다. 여기에서 우리는 신속하게 일시적으로 원형질체에 표시되는 주기성 기자의 발광 이미지를 사용하여 애기 장대의 돌연변이 라인에서 일주기 표현형을 평가하는 방법을 시각화.

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

이 분석의 전반적인 목표는 형질전환된 원형질체에서 방출되는 발광을 측정하여 애기장대(Arabidopsis) 계통의 일주기(Circadian) 주기를 결정하는 것입니다. 이 방법은 어떤 유전자가 시간 측정 기제 자체에 피드백을 주는지와 같이 일주기 생물학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 안정적인 형질전환 계통을 구축할 필요 없이 모든 애기장대 돌연변이체의 일주기 주기를 빠르게 분석할 수 있다는 점입니다.이 절차를 시작하려면, 페트리 접시에 라벨을 붙이고 10 milliliters의 여과 멸균된 효소 용액을 넣습니다. 깨끗한 실험대 위에 오토클레이브 테이프 네 조각의 접착면이 위로 오도록 고정하고, 테이프 위에 페트리 접시의 크기를 표시합니다. 배양실에서 식물을 수집합니다.4주 된 식물의 잎을 잘라 상표피가 오토클레이브 테이프에 닿도록 누르고, 하표피 표면이 위를 향하게 합니다. 하표피 표면에 매직 테이프 조각을 붙입니다. 15 milliliter 원뿔형 튜브를 사용하여 잎 조직이 짓눌리지 않도록 주의하며 테이프 조각을 잎에 부드럽게 누릅니다.테이프를 조심스럽게 잡아당겨 하표피를 벗겨내고 엽육 세포를 노출시킵니다. 다음으로, 오토클레이브 테이프를 페트리 접시 크기에 맞게 자른 후, 핀셋을 사용하여 테이프를 페트리 접시로 옮기고 잎 면이 아래로 향하게 하여 효소 용액 위에 띄웁니다. 플랫폼 쉐이커에서 60 RPM으로 60분 동안 회전시키면, 이 과정 동안 원형질체가 용액 속으로 방출됩니다.60분 후, 핀셋을 사용하여 오토클레이브 테이프 조각을 제거하여 버립니다. 와이드 보어 피펫 팁을 사용하여 프롤토플라스트가 포함된 용액을 15 milliliter 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다. 프로토플라스트를 4 °C에서 100 gee로 3분 동안 원심분리하며, 펠렛이 매우 느슨하므로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.프로토플라스트에 W5 용액 10 milliliters를 추가하고, 튜브를 부드럽게 회전시켜 재현탁합니다. 계수를 위해 프로토플라스트의 일부를 취합니다. 프로토플라스트를 얼음 위에서 30분에서 60분 동안 방치합니다.원형질체가 얼음 위에 있는 동안, 헤모사이토미터(hemocytometer)로 원형질체 수를 세어 수율을 평가합니다. 4°C에서 100 ×g로 3분간 원심분리하여 원형질체를 수집합니다. 펠릿(pellet)이 매우 느슨하므로 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.마지막으로, 프로토플라스트를 mL당 500,000개의 농도가 되도록 MMg 용액에 재현탁합니다. 15 mL 원추형 튜브에 리포터 플라스미드 10 µL를 넣고, 이어서 프로토플라스트 400 µL를 추가하여 프로토플라스트 형질전환 절차를 시작합니다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG 용액)을 1부피 추가하고, 튜브를 부드럽게 12회 반전시켜 섞어 프로토플라스트를 형질전환합니다.실온에서 8~15분 동안 배양합니다. 원형질체는 효율적인 형질전환을 보장할 수 있을 만큼 충분히 배양해야 하지만, 너무 오래 배양하면 생존율이 낮아질 수 있습니다. 다음으로, 원형질체 DNA PEG 혼합액을 4배 부피의 W5 용액으로 희석하고, 6회 천천히 뒤집어 섞어줍니다.상온에서 100 gee로 2분 동안 원심분리하여 형질전환된 원형질체를 수집합니다. 펠렛이 매우 느슨하므로 각별히 주의하여 피펫으로 상층액을 제거합니다. 원형질체를 1,250 µL의 이미징 솔루션에 재현탁합니다.원형질체는 상당히 쉽게 재현탁되어야 하며, 이는 형질전환 후에도 세포가 온전함을 나타냅니다. 96-웰 플레이트의 6개 반복 웰에 웰당 200 µL씩 분주하고, 빈 웰은 W5 용액으로 채웁니다. 발광 이미징에 적합한 접착성 투명 덮개로 플레이트를 밀봉합니다.원형질체를 촬영하기 위해, 96-웰 플레이트를 식물 촬영에 적합한 발광 이미지 장비로 옮깁니다. 웰 간의 응결 및 압력 차이를 방지하기 위해, 이동 후 10~15분이 지난 시점에 플레이트의 접착식 덮개를 교체하십시오. 촬영을 시작합니다.실온에서 5일 동안 45분마다 플레이트를 측정하십시오. 그 후, Biological Rhythms Analysis Software System과 같은 분석 소프트웨어를 사용하여 발광 결과를 분석하십시오. 이 프로토콜로 분리한 엽육 세포질 원형질체는 이 이미지에서 200배 배율로 나타나 있습니다.야생형 Arabidopsis와 cca1/lhy 돌연변이체 원형질체를 형질전환한 후, 플레이트 리더를 사용하여 5일 동안 지속적인 빛 조건에서 이미징하였습니다. 예상대로, 이 돌연변이체에서는 시계 조절 유전자 발현의 자유 실행 주기(free-running period)가 단축되었습니다. 반면, ztl 돌연변이체 원형질체의 일주기 진동 주기는 연장되었습니다.CCA1을 과발현시킨 원형질체에서는 CCA1의 과발현이 부정맥(arrhythmia)을 유발하기 때문에 리포터 구조체 발현의 진동이 나타나지 않았습니다. 이 막대 그래프는 야생형 및 시계 돌연변이 원형질체의 발광 추적(luminescence traces)을 기반으로 추정한 일주기(Circadian period)를 보여줍니다. 이러한 일주기는 시간이 많이 소요되는 형질전환 방식을 통해 전신 식물에서 생성된 기존 발표 데이터와 일치합니다.이 절차를 수행할 때는 건강한 식물을 사용하는 것이 중요하며, 프로토플라스트는 취약하므로 주의해서 다루어야 합니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3~4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 Arabidopsis 프로토플라스트를 분리, 형질전환 및 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이러한 기술들은 이제 모든 돌연변이 라인에 적용할 수 있으며, 심지어 다른 식물 종의 원형질체를 이미징하도록 수정될 수도 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

공간적 특정 phytochrome 반응의 분자 기초는 조직과 기관이 특정 phytochrome 결함을 전시 유전자 변형 식물을 사용하여 조사 중입니다. 특정 세포의 분리는 microarray 분석에 의해 다음 정렬 것은 공간적 특정 phytochrome 응답에 관련된 유전자를 확인하기 위해 활용되고있는 형광 활성화된 세포로 유도 phytochrome 발색단 고갈을 전시.

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana</em

Circadian 시계는 개별 세포 내 기능, 즉, 그들은 세포 자율적 있습니다. 여기, 우리는 비 침습적, 루시 페라 기반의 실시간 bioluminescence 기술을 사용하여 셀 자치 클럭 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 리포터 전지는 circadian 생물학을 공부를위한 다루기 쉬운, 기능 모델 시스템을 제공합니다.

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

여기에서는 생체 일주기 발광과 인간 섬 세포 및 일차 근관의 분비 활동을 병렬로 모니터링하기 위한 설정에 대해 설명합니다. 이를 위해 루시페라제 코어 클럭 리포터의 렌티바이러스 유전자 전달을 사용한 후, 연속적인 세포 주혈에 의한 유출 매질의 체외 동기화 및 수집을 수행했습니다.

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

생체 외에서 생물 발광 분석 결과 유 방 상피 세포에서 세포 circadian 리듬을 결정 하기 위해 제공 됩니다. 이 메서드는 기간 2 유전자 발기인의 제어에서 정한 luciferase 표현 하는 포유류 세포 기자 플라스 미드를 활용 합니다. 그것은 다른 세포 유형 circadian 리듬에 기관 특정 효과 평가 하 게 적응 될 수 있다.

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

유전자 인코딩된 luciferase 유전자 발현의 인기 있는 비-침략 적 기자입니다. 자동된 경도 luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미징의 사용에는 다양 한 조건에서 발광 세포에서 경도 녹음 수 있습니다. 여기 우리가 어떻게 악어 circadian 리듬 연구의 맥락에서 사용할 수 있습니다 보여줍니다.

자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정

이 새로 개발된 된 형광 기반 기술을 통해 자유롭게 이동 하는 쥐 실시간 및 높은 시간 해상도 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 circadian 시계 유전자의 녹음 방송을의 장기 모니터링 됩니다.

Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링

이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

대부분의 유기체에 존재하는 일주기 리듬은 생물학적 과정의 시간적 조직을 조절합니다. 3D 오가노이드는 최근 생리학적으로 유의미한 in vitro 모델로 부상했습니다. 이 프로토콜은 생물 발광 리포터를 사용하여 오가노이드의 일주기 리듬을 관찰하는 방법을 설명하며, 이를 통해 다세포 시스템의 일주기 리듬에 대한 체외 조사를 가능하게 합니다.

Organoids에서 Bioluminescence Reporter를 사용한 Circadian Oscillations 모니터링

이 보고서는 시계열 실험에서 얻은 대규모 데이터 세트를 분석하기 위해 오픈 소스 소프트웨어 RStudio의 R 스크립트를 사용하는 방법을 설명합니다.

대규모 데이터 세트에 대한 사용자 친화적이고 강력한 R 분석

이 동영상은 Arabidopsis 14 일 된 모종의 조직에서 그대로 protoplasts를 분리하는 절차를 보여줍니다. 격리 protoplasts 적어도 96h 위해 그대로 유지하고 대신 한 달 된 성숙한 식물의 모종으로부터 격리되는 감안할 때,이 절차는 그대로 protoplasts가 필요한 assays을 신속.

14 일 된 모종의 조직에서 Protoplasts의 분리 Arabidopsis thaliana</em

배우세요 애기장대 원형질체 발광 이미징을 이용한 일주기 리듬 신속 분석법. 안정적 형질전환 계통 없이 돌연변이의 주기를 측정하여 생체시계 유전자 기능 연구에 활용할 수 있습니다.

발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석

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