신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

이 실험 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포의 엔도사이토시스 경로에서 소포 수송 사건을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 단백질 발현의 변화나 돌연변이가 수송 사건의 속도와 효율에 어떤 영향을 미치는지와 같이, 소포 수송 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 형광 표지된 화물 단백질의 강도를 측정함으로써 살아있는 세포 내의 엔도사이토시스 수송을 직접적으로 정량화할 수 있다는 점입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 용액과 배지를 준비한 후, 플라스미드 선택 유지를 위한 추가 영양분이 없는 5 mL의 YNB 배지에 효모 세포 콜로니 2~3개를 접종합니다. 30 °C에서 16~24시간 동안 흔들어 배양합니다. 이미징 약 3시간 전에 각 하룻밤 배양액의 OD 600을 측정합니다.

그 후, 플라스미드 유지에 필요한 추가 영양분이 없는 YNB 배지에서 OD 600이 0.35에서 0.4가 되도록 5 mL 희석액을 준비하고, 30 °C에서 3시간 동안 흔들어 배양합니다. 배양하는 동안 현미경의 환경 챔버 또는 가열 스테이지를 30 °C로 사전 평형화합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 이미징용 처리된 8-웰 글래스 팟과 챔버 슬라이드를 준비한 후, 플라스미드 선택을 위한 추가 영양분이 없는 YNB 배지 200 µL를 각 웰에 넣습니다.

배양이 완료되면 1 mL를 마이크로 튜브에 옮기고 8,000 RPM에서 2분 동안 원심 분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 그다음 상층액 975 µL를 제거합니다. 남은 상층액으로 세포 펠릿을 재현탁합니다.

그런 다음 8-웰 플레이트의 각 웰 중앙에 세포 현탁액 2.5 µL를 떨어뜨립니다. 피펫으로 상하로 흡입 및 배출하여 세포를 분산시키고, 세포가 가라앉을 때까지 5분에서 10분 동안 기다립니다. 챔버 슬라이드를 30 °C로 유지된 도립 형광 현미경 위에 놓습니다.

그 다음, 명시야 조명을 사용하여 세포 영역을 찾습니다. 100 µg/mL의 methionine이 포함된 미리 데워둔 YNB 배지 50 µL를 웰 내의 배지 200 µL에 추가하여 methionine의 최종 농도를 20 µg/mL로 맞춥니다. 이미징을 시작하기 전, 세포가 2분 동안 평형을 이룰 수 있도록 기다립니다.

그 다음 이미징 직전에 현미경을 원하는 초점 평면으로 조정합니다. 5분 간격으로 45분에서 60분 동안 명시야 또는 DIC 이미지에서 GFP를 획득합니다. 이때 하나의 시계열 내의 모든 이미지에 대해 동일한 획득 파라미터를 사용합니다.

추가 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 각 시점별 개별 세포의 형광 강도를 정량화하고, 해당 값을 첫 번째 이미지의 초기 강도에 대한 백분율로 표시합니다. ImageJ의 텍스트 프로토콜에 따라 이미지를 내보낸 후, 파일 메뉴의 Open 옵션을 사용하여 파일을 엽니다.

정량을 위해서는 형광 이미지를 사용하고, 세포의 위치를 식별하기 위한 참조용으로는 명시야(bright field) 또는 DIC 이미지를 사용하십시오. DIC로 관찰했을 때 살아있는 세포보다 더 어둡게 보이고 GFP 채널에서 자가형광을 나타내는 죽은 세포는 제외하십시오. 배경이 균일하지 않은 이미지의 경우, Process 메뉴에서 배경 제거(background subtraction) 알고리즘을 선택하고 기본 설정을 적용하십시오.

이미지를 획득한 후에는 정량 분석 절차를 진행하기 전에 배경 감산을 수행하는 것이 중요합니다. 배경 신호가 샘플 간의 차이를 가리거나 약화시킬 수 있기 때문에 이 단계가 특히 중요합니다. 자유 선택 도구(freehand selection tool)를 사용하여 세포 전체를 포함하되 세포 외부 영역은 최대한 적게 포함되도록 세포의 외곽선을 그립니다.

그 다음 Analyze 메뉴에서 set measurements 기능을 사용하여 면적, 통합 밀도 및 평균 회색값을 측정하십시오. Analyze를 클릭한 후 Tools를 선택하여 ROI Manager를 엽니다. ROI Manager 창에서 Add 버튼을 클릭하여 강조 표시된 영역을 새로운 ROI로 등록하십시오.

죽은 세포나 이미지 가장자리에 닿아 있는 세포를 제외하고, 이미지 내 나머지 세포들에 대해 외곽선 그리기와 측정을 반복합니다. Measure 버튼을 클릭하여 측정값을 새 창에 표시한 후, 선택한 ROI를 zip 파일로 저장하십시오. 그런 다음 More 버튼을 클릭하여 모든 측정값을 스프레드시트나 통계 분석 소프트웨어로 내보내십시오.

플라스미드 선택 유지를 위한 추가 영양분이 없는 YNB 배지 0.5 mL에 2~3개의 효모 세포 콜로니를 접종합니다. 30 °C의 롤러 드럼에서 16~24시간 동안 세포를 배양합니다. 플라스미드 유지용 추가 영양분이 없는 YNB 배지 1 mL를 추가하고 3시간 더 배양합니다.

다음으로, 5 mL 원형 바닥 튜브 2개에 각각 1 mL의 세포를 옮깁니다. 그런 다음 첫 번째 튜브에는 0.25 mL의 YNB Met 배지를 추가하고, 두 번째 튜브에는 최종 농도가 20 µg/mL가 되도록 100 µg/mL의 메티오닌이 포함된 YNB 배지 0.25 mL를 추가합니다. 샘플 수가 많을 경우, 분석 시간을 고려하여 메티오닌 추가 시간을 조절하십시오.

본 연구실의 유세포 분석기는 1회 가동 시 최대 40개의 시료를 측정할 수 있습니다. 메티오닌은 배치 단위로 첨가하며, 5분마다 8개의 시료에 처리합니다.

이렇게 하면 모든 샘플이 메티오닌 첨가 후 45분에서 50분 사이에 측정되도록 할 수 있습니다. 세포를 45분 동안 배양하십시오. 그 후 유세포 분석법으로 세포를 분석하며, 세포 크기의 측정값으로 전방 산란광(forward scatter 또는 FS)을 선택하고, 화물 내재화의 측정값으로 FITC 필터의 형광 강도를 측정하여 매핑합니다.

45분간의 배양 동안, 슬라이더 버튼을 사용하여 FS 및 FITC 채널의 전압을 조절함으로써 사용 중인 효모 세포의 크기 범위와 형광 강도에 최적화된 검출 상태를 설정하십시오. 각 조건당 10,000개 세포의 FS 및 형광 강도를 측정합니다. 높은 유량 설정을 사용하여, '그래프 추가(add graph)'를 클릭해 형광 강도에 따른 FS의 산점도를 생성하십시오.

그런 다음 x축에는 FITC를, y축에는 FS를 선택하고 1000개의 점을 그래프로 나타냅니다. 게이트 기능을 사용하여 야생형 Met 조건에서 가장 밝은 세포의 약 5%가 게이트 오른쪽에 위치하도록 수직 게이트를 지정합니다. 이 게이트 설정을 실험의 다른 모든 조건에 동일하게 적용합니다.

여기에 표시된 것처럼, GFP 또는 fluorine이 태그된 Mup1의 내포 작용과 형광 변화를 모니터링하기 위해 메티오닌의 존재 또는 부재 하에 5분 간격으로 세포의 타임랩스 이미징을 수행하였습니다. 예상대로 메티오닌이 없을 때 GFP 및 fluorine 태그 Mup1은 세포막에 유지되었습니다. 반면, 메티오닌이 있는 상태에서 이미징한 세포에서는 화물 내포 작용과 일치하게 세포 표면에서 형광 신호가 점진적으로 감소하는 것이 관찰되었습니다.

하지만 methionine이 존재할 때 형광이 소실되는 속도는 pHlourin Mup1 세포와 비교하여 Mup1 GFP 세포에서 더 지연되었습니다. 이 산점도는 수직 게이트를 적용한 후 methionine 존재 여부에 따른 야생형 또는 4가지 delta ENTH1 세포의 형광 강도를 비교한 것입니다. 야생형 Met 세포의 4%가 집단 내에서 가장 밝은 세포들에 해당하는 게이트의 오른쪽에 포함된 반면, 처리하지 않은 야생형 세포의 65%가 해당 게이트에 포함되었습니다.

반면, 4개의 delta ENTH1 세포에서는 밝은 세포와 어두운 세포의 분포에 차이가 없었으며, 이는 내포 작용의 결함과 일치하는 결과입니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행할 때 3~4시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 모든 샘플에 대해 동일한 처리 시간 후에 종점 데이터를 수집할 수 있도록, 동시 실험 시 시작 시간을 엇갈리게 설정하는 것이 중요합니다.

이 절차를 통해 소낭 수송에 기여하는 새로운 인자는 무엇인지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 꽃 모양 유전적 스크리닝(floral genetic screens)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 소낭 수송 분야의 연구자들은 엔도솜 소실(endosome attrition)뿐만 아니라 출아 효모에서 새롭게 발견된 클라트린 독립적 산성 경로(clathrin independent and acidic pathway)의 측면을 탐구할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 살아있는 세포에서 엔도사이토시스 이벤트를 정량화하기 위해 florent-형 화물을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.