신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포의 내포성 경로에서 수포 수송 사건을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 단백질 발현의 돌연변이 또는 변화가 밀매 사건의 비율 및 효율성에 어떤 영향을 미치는지와 같은 소포 밀매 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 형광 표지된 화물 단백질의 강도를 측정하여 내포세포 이동 및 살아있는 세포를 직접 정량화할 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 용액 및 배지를 준비한 후, 플라스미드 선택을 유지하기 위한 추가 영양소가 부족한 5ml의 YNB 배지에 2-3개의 효모 세포 콜로니를 접종합니다. 섭씨 30도에서 16-24시간 동안 흔들면서 배양물을 성장시킵니다. 이미징 약 3시간 전에 각 야간 배양의 OD 600을 측정합니다.

그런 다음 플라스미드 유지를 위한 추가 영양소가 부족한 YNB 배지에서 0.35 - 0.4의 OD 600에서 5ml 희석액을 준비하고 3시간 동안 흔들면서 섭씨 30도에서 성장합니다. 배양 중에는 현미경 환경 챔버 또는 가열된 스테이지를 섭씨 30도로 사전 평형화합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 이미징을 위해 캔 처리된 8웰 유리 포트와 챔버 슬라이드를 준비한 후, 각 웰에 플라즈마 선택을 위한 추가 영양소가 부족한 200마이크로리터의 YNB 배지를 추가합니다.

배양이 준비되면 1ml를 microfridge 튜브에 옮기고 2분 동안 8, 000RPM으로 세포를 펠릿화합니다. 그런 다음 975 마이크로 리터의 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 잔류 상층액에 재현탁시킵니다.

그런 다음 2.5마이크로리터의 세포 현탁액을 8웰 플레이트의 각 웰 중앙에 떨어뜨립니다. 피펫을 위아래로 움직여 세포를 분산시키고 세포가 5-10분 동안 안정되도록 합니다. 챔버 슬라이드를 섭씨 30도로 평형을 이룬 도립 형광 현미경에 놓습니다.

그런 다음 명시야 조명을 사용하여 세포장을 찾습니다. 메티오닌 밀리리터당 100마이크로그램을 함유한 예열된 YNB 배지 50마이크로리터를 웰의 배지 200마이크로리터에 추가하여 밀리리터당 20마이크로그램의 최종 메티오닌 농도를 얻습니다. 이미징을 시작하기 전에 세포가 2분 동안 평형을 이루도록 합니다.

그런 다음 이미징 직전에 현미경을 원하는 초점면으로 조정합니다. 명시야 또는 DIC 이미지에서 45분에서 60분 동안 5분 간격으로 GFP를 획득합니다. 시계열 내의 모든 이미지에 대해 동일한 획득 매개 변수를 사용합니다.

자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 각 시점에서 개별 세포의 형광 강도를 정량화하고 값을 첫 번째 이미지의 초기 강도에 대한 백분율로 표현합니다. 이미지 j의 텍스트 프로토콜에 따라 이미지를 내보낸 후 열기 옵션을 사용하여 파일 메뉴에서 파일을 엽니다.

정량화를 위해 형광 이미지를 사용하고 명시야 또는 DIC 이미지를 참조로 사용하여 세포의 위치를 식별할 수 있습니다. DIC로 볼 때 살아있는 세포보다 어둡게 보이는 존재하는 죽은 세포를 제외하고 GFP 채널 아래에서 자가형광을 발합니다. [프로세스] 메뉴에서 배경이 고르지 않은 이미지의 경우 배경 빼기 알고리즘을 선택하고 기본 설정을 선택합니다.

이미지를 획득한 후에는 정량화 절차를 진행하기 전에 배경 빼기를 수행하는 것이 중요합니다. 이 단계는 배경 신호가 샘플 간의 차이를 마스킹하거나 약화시킬 수 있기 때문에 특히 중요합니다. 자유형 선택 도구를 사용하여 전체 셀을 포함하되 셀 외부의 영역은 가능한 한 적게 포함하도록 셀의 윤곽을 그립니다.

그런 다음 Analyze(분석) 메뉴에서 set measurements(측정 설정) 기능을 사용하여 면적, 통합 밀도 및 평균 회색 값을 측정합니다. Analyze(분석)를 클릭한 다음 Tools(도구)를 클릭하여 ROI Manager를 엽니다. ROI Manager 창에서 Add 버튼을 클릭하여 강조 표시된 영역을 새 ROI로 입력합니다.

죽은 세포나 이미지 가장자리에 닿는 세포를 제외하고 이미지의 나머지 세포에 대해 윤곽 및 측정을 반복합니다. 측정 버튼을 클릭하여 선택한 ROI를 zip 파일로 저장하면 측정된 값이 새 창에 표시됩니다. 그런 다음 자세히 버튼을 클릭하고 모든 측정값을 스프레드시트 또는 통계 분석 소프트웨어로 내보냅니다.

2-3개의 효모 세포 콜로니와 0.5ml의 YNB 배지를 접종하며, 플라스미드 선택을 유지하기 위한 추가 영양소가 부족합니다. 섭씨 30도의 롤러 드럼에서 16-24시간 동안 세포를 성장시킵니다. 플라스미드 유지를 위해 추가 영양소가 부족한 YNB 배지 1ml를 추가하고 추가로 3시간 동안 성장합니다.

다음으로, 1밀리리터의 세포를 2개의 5밀리리터 원형 바닥 튜브 각각으로 옮깁니다. 그런 다음 첫 번째 튜브에 0.25ml의 YNB Met 배지를 추가하고 메티오닌 100마이크로그램을 포함하는 0.25밀리리터의 YNB 배지를 두 번째 튜브에 추가하여 최종 농도를 밀리리터당 20마이크로그램으로 만듭니다. 많은 수의 샘플의 경우, 사실 분석을 위한 시간을 수용하기 위해 메티오닌을 시차를 두고 첨가합니다.

당사의 유세포 분석기는 실행당 최대 40개의 샘플을 측정할 수 있습니다. 우리는 메티오닌을 일괄적으로 첨가합니다. 5분마다 8개의 샘플.

이를 통해 모든 샘플이 메티오닌 첨가 후 45분에서 50분 사이에 측정됩니다. 세포를 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포 크기 측정으로 전방 산란 또는 FS를 선택하고 화물 내부화의 척도로 FITC 필터에서 하나의 유동 형광 강도를 매핑하여 유세포 분석으로 세포를 분석합니다.

45분 배양 동안 슬라이더 버튼을 사용하여 FS 및 FITC 채널의 전압을 조정하여 사용 중인 효모 세포의 크기 범위 및 형광 강도에 대한 검출을 최적화합니다. 각 조건에서 10, 000 세포에 대한 FS 및 형광 강도를 측정합니다. High Flow Rate 설정을 사용하여 Add graph(그래프 추가)를 클릭하여 형광 강도에 대한 FS의 산점도를 생성합니다.

그런 다음 x축으로 FITC를 선택하고 y축으로 FS를 선택한 후 1000점을 그래프로 표시합니다. 게이트 함수와 야생형 Met 조건을 사용하여 가장 밝은 셀의 약 5%가 게이트 오른쪽에 떨어지도록 수직 게이트를 할당합니다. 실험의 다른 모든 조건에 대해 이 게이팅을 사용합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 메티오닌이 없거나 없는 상태에서 세포의 타임 랩스 이미징을 수행하여 GFP 또는 불소 태그가 지정된 Mup1 내재화 및 형광 변화를 모니터링했습니다. 예상대로 GFP와 불소 태그가 지정된 Mup1은 메티오닌이 없는 상태에서 원형질막에 남아 있었습니다. 대조적으로, 메티오닌이 있는 상태에서 이미징된 세포는 화물 내재화와 일치하는 세포 표면의 형광 신호의 점진적인 고갈을 보여주었습니다.

그러나 메티오닌의 존재 하에서 손실되는 형광의 동역학은 pHlourin Mup1 세포에 비해 Mup1 GFP 세포에서 지연되었습니다. 이 산점도는 수직 게이트를 적용한 후 메티오닌의 유무에 따라 야생형 또는 4개의 델타 ENTH1 세포의 형광 강도를 비교합니다. 야생형 Met 세포의 4%는 집단에서 가장 밝은 세포에 해당하는 게이트의 오른쪽에 포함되어 있었고, 처리되지 않은 야생형 세포의 65%는 게이트에 포함되어 있었습니다.

대조적으로, 4개의 델타 ENTH1 세포는 밝은 세포와 어두운 세포의 분포에서 차이를 보이지 않았으며, 이는 세포내이입의 결함과 일치했습니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행한다면 3-4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 샘플에 대해 동일한 처리 시간 후에 종말점 데이터를 수집할 수 있도록 동시 실험 수행에서 시작 시간을 시차를 두는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 수포 이동에 기여하는 새로운 요인과 같은 추가 질문에 답하기 위해 꽃 유전자 검사와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 수포 수송 분야의 연구자들이 엔도솜 감소의 측면뿐만 아니라 발아 효모에서 새로 발견된 클라트린 독립적이고 산성 경로인 경로를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 살아있는 세포에서 내포성 이벤트를 정량화하기 위해 플로랑형 화물을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.