Name: 신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 배우세요 살아있는 세포에서 소포 수송을 정량화하는 방법을. pHluorin 형광 단백질과 유세포 분석을 활용하여 말단 소포체 경로의 역학을 연구하고, 단백질 변이가 세포 기능에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.

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이 연구에서 시약을 생성하는 데 사용된 pHluorin cDNA를 공유해 주신 Gero Miesenböck과 Tim Ryan, 탁월한 기술 지원을 해주신 Nathan Wright, Joanna Poprawski, Lydia Nyasae님, 유익한 토론을 해주신 Wendland 연구실 구성원님, 현미경 및 유세포 분석에 대한 조언과 지원을 해주신 통합 이미징 센터(Johns Hopkins)의 Michael McCaffery와 Erin Pryce에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, B.W., GM60979)과 국립과학재단(National Science Foundation, B.W., MCB 1024818)의 보조금으로 지원되었습니다. K.W.는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, T32-GM007231)의 교육 보조금으로 부분적으로 지원을 받았습니다. A.F.O.는 Duquesne University의 생물과학부와 National Science Foundation CAREER 보조금 553143의 개발 기금으로 지원되었습니다.

<ol><li>Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+for+association+of+receptors%2C+adaptors%2C+and+actin+during+endocytic+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization.</a> Cell. 115 (4), 475-487 (2003).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+design+for+the+clathrin-+and+actin-mediated+endocytosis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery.</a> Cell. 123 (2), 305-320 (2005).</li>
<li>Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+yeast+for+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis.</a> Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).</li>
<li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biol. 9 (3), e1000604(2011).</li>
<li>Hansen, C. G., Nichols, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+clathrin-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis.</a> J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).</li>
<li>Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+proteins+are+delivered+to+recycling+endosomes+via+a+distinct+cdc42-regulated%2C+clathrin-independent+pinocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway.</a> Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).</li>
<li>Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aluminum+fluoride+stimulates+surface+protrusions+in+cells+overexpressing+the+ARF6+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase.</a> J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).</li>
<li>Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existence+of+a+novel+clathrin-independent+endocytic+pathway+in+yeast+that+depends+on+Rho1+and+formin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin.</a> J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).</li>
<li>Prosser, D. C., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+roles+for+yeast+Rho1+and+mammalian+RhoA+GTPases+in+clathrin-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Small+GTPases%22%5BJournal%5D)">Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis.</a> Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).</li>
<li>Kohno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bni1p+implicated+in+cytoskeletal+control+is+a+putative+target+of+Rho1p+small+GTP+binding+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).</li>
<li>Evangelista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Yeast+Formin+Linking+Cdc42p+and+the+Actin+Cytoskeleton+During+Polarized+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis.</a> Science. 276 (5309), 118-122 (1997).</li>
<li>Kübler, E., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+fimbrin+are+required+for+the+internalization+step+of+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast.</a> EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).</li>
<li>Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-Related+Ubiquitin-Ligase+Adaptors+Regulate+Endocytosis+and+Protein+Turnover+at+the+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface.</a> Cell. 135 (4), 714-725 (2008).</li>
<li>Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-like+proteins+mediate+ubiquitination+and+endocytosis+of+the+yeast+metal+transporter+Smf1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1.</a> EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).</li>
<li>Nikko, E., Pelham, H. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-Mediated+Endocytosis+of+Yeast+Plasma+Membrane+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters.</a> Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).</li>
<li>O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Deoxyglucose+impairs+Saccharomyces+cerevisiae+growth+by+stimulating+Snf1-regulated+and+%CE%B1-arrestin-mediated+trafficking+of+hexose+transporters+1+and+3%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3.</a> Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).</li>
<li>O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcineurin-dependent+switch+controls+the+trafficking+function+of+%CE%B1-arrestin+Aly1%2FArt6%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6.</a> J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).</li>
<li>Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Arrestins+participate+in+cargo+selection+for+both+clathrin-independent+and+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis.</a> J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).</li>
<li>Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+2+receptors+and+detergent-resistant+membrane+domains+define+a+clathrin-independent+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway.</a> Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).</li>
<li>Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+endocytosis+with+cytoplasmic+pHluorin+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras.</a> Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).</li>
<li>Bokman, S. H., Ward, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renaturation+of+green-fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Renaturation of green-fluorescent protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+pHluorins+for+Optical+Measurements+of+Presynaptic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity.</a> Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+sorting+into+the+multivesicular+body+pathway+requires+the+function+of+a+conserved+endosomal+protein+sorting+complex%5BTitle%5D)+AND+%22ESCRT-I.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex.</a> ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).</li>
<li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li>
<li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Curr+Prot+Mol+Biol%22">Curr Prot Mol Biol</a>. , John Wiley & Sons. New York. (1991).</li>
<li>Urbanowski, J. L., Piper, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+sorts+proteins+into+the+intralumenal+degradative+compartment+of+the+late-endosome%2Fvacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole.</a> Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).</li>
<li>Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Dynamics+of+Clathrin+and+Its+Adaptor-Dependent+Recruitment+to+the+Actin-Based+Endocytic+Machinery+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast.</a> Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).</li>
<li>Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+Epsin%2FYap180+adaptors+and+the+scaffolds+Ede1%2FPan1+is+required+for+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis.</a> Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).</li>
<li>Aguilar, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epsin+N-terminal+homology+domains+perform+an+essential+function+regulating+Cdc42+through+binding+Cdc42+GTPase-activating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).</li>
<li>Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+methionine+uptake+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+new+family+of+amino+acid+permeases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases.</a> J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).</li>
<li>Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescence-activated+cell+sorter-based+screen+for+yeast+endocytosis+mutants+identifies+a+yeast+homologue+of+mammalian+eps15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15.</a> J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).</li>
<li>Alvaro, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Alpha-Arrestins+Negatively+Regulate+Saccharomyces+cerevisiae+Pheromone+Response+by+Down-Modulating+the+G-Protein-Coupled+Receptor+Ste2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2.</a> Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).</li>
<li>Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-Induced+Ubiquitylation+and+Endocytosis+of+Yeast+Amino+Acid+Permeases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases.</a> Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).</li>
<li>Becuwe, M., Léon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+control+of+transporter+endocytosis+and+recycling+by+the+arrestin-related+protein+Rod1+and+the+ubiquitin+ligase+Rsp5%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endosomal+Sorting+Complex+ESCRT-II+Mediates+the+Assembly+and+Architecture+of+ESCRT-III+Helices%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices.</a> Cell. 151 (2), 356-371 (2012).</li>
<li>Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+of+Isoform-Selective+Vps21%2FRab5+Signaling+at+Endolysosomal+Organelles+by+Msb3%2FGyp3%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3.</a> Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).</li>
<li>Nickerson, D. P., Merz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUCID%3A+A+Quantitative+Assay+of+ESCRT-Mediated+Cargo+Sorting+into+Multivesicular+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies.</a> Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).</li>
<li>Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+endocytosis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Yeast endocytosis assays.</a> Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).</li>
<li>Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+insertion+of+uracil+permease%2C+a+polytopic+yeast+plasma+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein.</a> Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).</li>
<li>Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Function+of+the+Endocytic+Scaffold+Protein+Pan1p+Depends+on+Multiple+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains.</a> Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).</li>
<li>Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+dynamics+of+receptor-mediated+endocytic+trafficking+in+budding+yeast+revealed+by+using+fluorescent+alpha-factor+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.

효모 세포에서의 세포 내 이입 이벤트 정량 pHluorin의 적용은 태그 형광 단백질 (도 1a)의 세포질 테일에 융합 된 트랜스화물을 사용한다. pHluorin 태그가 중립적 인 환경에 노출되지는 않지만 pHluorin 태그가 산성 조건을 발견 한 경우 급냉 될 때 여기에 설명 된 분석의 경우,화물 밝은 형광이다. 따라서, 태그가 이입 pHluorin화물 용이 세포막의 세포질 표면에 초기 엔도 좀에서 검출되지만 내강 MVB 소체로 액포 또는 루멘의 배송에 혼입 될 때 &quot;어둡게&quot;된다. 일반적으로, 새로 합성 된 세포 내 이입화물 가능성 소포체 (ER)을 남겨 GFP 및 그의 변이체의 대부분은 충분히 성숙되기 전에 세포막에 도달; 따라서, ER 또는 골지 종료가 나는 경우를 제외하고 탐지 남아 아직 예측 세포 표면에 도달하지 않은화물을 pHluorin는-태그mpaired. 이러한 STE3 및 Mup1 같은 pHluorin 태그가 ...

소포 피킹은 진핵 세포 내의 소기관 신원 및 기능을 유지하는 데 중요한 역할을하고, 각각의 세포 구획 막 단백질 및 조성물을 조절하기위한 중요한 메커니즘이다. 이입을 통해 생성 소체 후속 재활용 또는 리소좀 타겟팅에 대한 표면으로부터 막 단백질을 제거하는 반면 세포막에서 exocytic 소포 융합은 세포 표면 단백질 및 새로운 막을 제공한다. 따라서, 엔도 시토 시스는 영양 흡수 및 세포 외 환경에 대한 응답 중요하다. 세포 외 유출 및 엔도 시토 시스는 세포막 표면적을 조절하기 위해, 손상된 단백질의 회전율을 균형있게된다. 효모 및 포유 동물 세포의 연구는 다양한 EN에 응답하여 세포 내 이입에 관련된 단백질의 대량뿐만 아니라 특정화물의 내재화를 촉진 여러 세포 내 이입 경로 또는 행위를 식별 한vironmental 조건. 가장 공부 경로는 클라과 세포질 액세서리 단백질이 초기 세포 내 이입 소포를 안정화 코트 구조로 조립하는 클라 매개 엔도 시토 시스 (CME)입니다. 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에의 실험 역학 및 많은 세포 내 이입 단백질 1-3 모집의 순서로 키 통찰력을 굴복했다. 특히, CME 기계가 매우 진화를 통해 보존되는 효모에서 CME 관련 단백질의 대부분은 인간 orthologs을 가지고; 따라서, 효모 신진 높은 진핵 생물에 보존되어 엔도 시토 시스의 메커니즘을 이해하기위한 중요한 도구가되고있다. 예를 들어, 출아 효모를 사용하는 연구가 추가로 세포 내 이입 액세서리 채용 하였다 CME 구조의 형성과 성숙 (효모 등 피질 액틴 패치 라 함) 클라화물 결합 어댑터 단백질부터 시작하여, 많은 단백질의 연속 채용 관련 결정 단백질,Arp2 / 3 매개 액틴의 중합의 활성화 및 소포 절단 1,2에 관여하는 단백질의 모집. 굴지 패치를 대뇌 피질하기 CME 기계 단백질의 모집은 높은 주문하고 진부한 과정, 많은 단백질 모집의 정확한 순서는 CME 기계의 다른 구성 요소에 대한 설립되었습니다. 중요한 것은, 최근의 연구는 포유 동물 세포 4 클라 코팅 된 구덩이에서 CME의 단백질을 모집 비슷한 순서를 확인했다. CME 외에도 여러 종류의 세포는 세포막 5-7에서 소포 형성 및 내재화를 촉진하는 다른 메커니즘에 의존하는 하나 이상의 독립적 인 클라 세포 내 이입 (CIE) 경로를 갖는다. 효모, 우리는 최근에 작은는 GTPase Rho1 및 활성화 구아닌 염기 교환 계수 (GEF), ROM1 8,9을 활용하는 CIE 경로를 확인했다. Rho1은 액틴의 중합 (1)를 홍보하기 위해 formin Bni1를 활성화효모 12 클라 독립적 인 세포 내 이입이 양식에 필요한 0,11. 또한, 단백질의 α-아레스 가족은 유비퀴틴 리가 Rsp5은 CME 13-17을 통해화물 유비퀴틴 이후의 국제화를 촉진하고, 또한 CIE (18)에 관여하는 단백질과 가능성 직접적인 상호 작용을 통해 CIE 경로를 통해화물의 국제화를 촉진하기 위해 모집. CIE의 다양한 경로는 또한 Rho1의 ortholog, 9,19-에서 RhoA 의존 클라 독립적 식세포 경로를 포함한 포유 동물 세포에 존재한다. 포유 동물 CIE에서에서 RhoA의 역할은 제대로 이해된다; 따라서, 신진 효모의 연구는 포유류 CIE에 적용 할 수있는 추가 기계적인 통찰력을 제공 할 수있다. 세포 내 이입 사건의 정확한 정량화는 엔도 시토 시스를 조절하는 특정 단백질의 역할에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있으며,화물 내재화 또는 progressio에 돌연변이의 효과를 밝힐 수세포 내 이입 경로를 통해 N. 이를 위하여, 생화학 적 방법은 리간드 흡수를 모니터링하거나 세포 내 이입화물 단백질의 분해 속도를 측정하기 위해 이용 될 수있다. 살아있는 세포에서 녹색 형광 단백질 (GFP)과이자의화물에 그 변종의 융합은화물 운송의 직접 시각화 할 수 있습니다. GFP는 (효모 또는 공포) 리소좀에서 분해에 내성이 있기 때문에, GFP - 태그화물은 엔도 시토 시스의 정량 사용이 제한됩니다. 또한, GFP의 형광은 pH의 변화에 부분적으로 만 구분하며 20, 21 루멘 액포 내에서 검출 남아있다. 그 결과, GFP 태그 형광화물의 나머지가 저하되었으며,화물 강도 전체 셀 기반 정량 인해 액포 장기 GFP 형광에 부정확 할 수 오랜 후에 액포에 계속. 액포의 GFP 형광의 단점을 극복하기 위해, 우리는 이전 superecliptic pH를 사용했다luorin, 중성 pH에서 밝은 형광 있지만, 이러한 20,22,23 리소좀 액포 /의 루멘으로 산성 환경에서 형광을 상실 GFP의 pH에 민감한 변형. 세포 내 이입화물의 세포질 꼬리에 pHluorin 태그를 배치하면 세포막에와 pHluorin 태그가 세포질 (그림 1A)에 노출 된 상태로 유지 초기 엔도 좀,에화물의 시각화를 허용합니다. 초기 엔도 좀은 엔도 좀의 루멘에 꽃 봉오리 소포로 전송 (ESCRT) 기계 패키지 표면 지역화 된화물에 필요한 엔도 좀 정렬 복잡하고, 생성 multivesicular 기관 (MVBs) (24)를 성숙. 내부 MVB 소체에 포함 된화물의 경우, pHluorin 태그 소포 루멘을 향. 내부 MVB 소체는 산성화; 그들은 MVBs (20)에 성숙하여, pHluorin 태그가화물 초기 엔도 좀의 형광을 잃게됩니다. 액포와 MVB의 후속 융합은 MVB의 내강 내용을 제공합니다열화 및 pHluorin 태그는 액포 루멘의 산성 환경에서 급냉 유지. 이 논문은 효모의 세포질 pHluorin 태그로화물을 이용하여 정량적 인 세포 내 이입 분석에 대한 자세한 설명을 제공합니다. pHluorin 태깅화물을 발현 균주 특정화물의 특성 및 피킹 동작에 따라, 운동 및 / 또는 엔드 포인트 분석에 사용될 수있다. 또한, 일부 pHluorin 태그가화물은 유동 세포 계측법을 포함하여 높은 처리량 분석 방법, 의무가 있습니다. 중요한 것은, pHluorin 태그는, 살아있는 세포에서 세포 내 이입 이벤트 공부 이입 및 야생형 및 돌연변이 균주에서 세포 내 이입 함수의 비교의 정량을 허용하는 다용도 공구이다.

<table><tbody><tr><td>아데닌</td><td>시그마</td><td>A8626-25G</td><td>아미노산 혼합물 및 원액 준비에 사용</td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>플레이트 매체 준비에 사용</td></tr><tr><td>BD Difco 효모 질소 염기 (아미노산 제외)</td> <td>BD</td><td>291920</td><td>액체 및 플레이트 매체 준비에 사용</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275-5MG</td><td>챔버 코팅에 사용 슬라이드</td></tr><tr><td>포도당 피</td><td>셔</td><td>BP350-1</td><td>액체 및 플레이트 매체 준비에 사용</td></tr><tr><td>L-히스티딘</td><td>피셔</td><td>BP382-100</td><td>아미노산 혼합물 및 원액</td></tr><tr><td>L-류신</td><td>아크로스</td><td>125121000</td><td>아미노산 혼합물 및 원액 준비에 사용</td></tr><tr><td>L-라이신</td><td>피셔</td><td>BP386-100</td><td>아미노산 혼합물 및 원액 L</td></tr><tr><td>-메티오닌</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>아미노산 혼합물 및 원액 제조에 사용</td></tr><tr><td>L-트립토판</td><td>Fisher</td><td>BP395-100</td><td>아미노산 혼합물 및 원액</td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Acros</td><td>140641000</td><td>아미노산 혼합물 제조에 사용</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8-well)</td><td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td>Mup1-pHluorin 내재화의 동역학 및 종말점 분석에 사용</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>아미노산 혼합물 및 원액 준비에 사용</td></tr><tr><td>Axiovert 200 도립 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>Custom Build</td><td></td></tr><tr><td>100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion 대물 렌즈</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>대물렌즈는 100X여야 합니다., 1.4NA 이상</td></tr><tr><td>Sensicam</td><td>Cooke Corporation</td><td></td><td>카메라는 12비트 이상의 다이나믹 레인지를 가져야 합니다</td></tr>. <tr><td>X-Cite 120PC Q 조명 소스</td><td>Excelitas Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 5 소프트웨어</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 phluorin의 응용 프로그램

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

녹색 형광 단백질 (GFP) 및 그 변종 널리 단백질 현지화 및 세포 골격 리모델링 및 살아있는 세포에서 소포 인신 매매 등의 이벤트의 역학을 공부하는 도구를 사용합니다. 키메라 GFP 융합을 사용하여 정량 방법은 많은 응용을 위해 개발되었다; 그러나, GFP는 단백질 분해에 어느 정도 내성 때문에 그 형광은 세포 내 이입 경로에화물 인신 매매의 정량을 방해 할 수있는 리소좀 / 공포에 계속. 이입 및 사후 이입 피킹 이벤트를 정량화하기위한 다른 방법은 superecliptic pHluorin 산성 환경에서 켄칭 GFP의 pH 민감성 변이체를 사용한다. multivesicular 기관 (MVBs)와 리소좀 / 공포 루멘에 전달하기로화물 통합에 따라 형광의 감쇠에 횡단화물 단백질 결과의 세포질 꼬리에 pHluorin의 키메라 융합. 따라서, 액포 형광의 담금질은 quantifi을 용이하게엔도 시토 시스와 세포 내 이입 경로에 이른 사건의 양이온. 이 논문은 형광 현미경을 통해 세포 내 이입의 정량 pHluorin 태그가화물을 사용하는 방법뿐만 아니라 유동 세포 계측법 사용 인구 기반의 분석에 대해 설명합니다.

구조적으로 내면화 세포 내 이입화물 단백질 STE3의 정상 상태 파악 및 정량화 살아있는 세포, STE3, 효모의 A-요인 페로몬 수용체의 세포질 C 말단 꼬리 키메라 GFP 및 pHluorin 융합의 현지화에 pHluorin 태그가화물은 엔도 시토 시스의 정량에 이용 될 수 있다는 것을 보여주기 위해 비교 하였다. STE3는 구성 적 열화 28 액포로 원형질막으로 수송 내면화 및 타겟팅 된 G 단백질 - 결합 수용체 (GPCR)이다. STE3-GFP (도 2A)를 발현하는 야생형 (WT) 세포에서 본 따라서, 정상 상태 조건 하에서 STE3 대다수는 액포 루멘에 편재. 한편, 네 클라 결합 어댑터 단백질 ENT1, Ent2, Yap1801 및 Yap1802을 (암호화하는 유전자를...

소포 수송 이벤트의 정확한 정량화는 종종 특정 단백질의 역할과 돌연변이의 영향에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 본 논문은 정량적 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 세포내 이벤트를 정량화하기 위한 도구로 pH에 민감한 GFP 변이체인 초황도 pHluorin을 사용하는 방법을 제시합니다.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포의 엔도사이토시스 경로에서 소포 수송 사건을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 단백질 발현의 변화나 돌연변이가 수송 사건의 속도와 효율에 어떤 영향을 미치는지와 같이, 소포 수송 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 형광 표지된 화물 단백질의 강도를 측정함으로써 살아있는 세포 내의 엔도사이토시스 수송을 직접적으로 정량화할 수 있다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 따라 용액과 배지를 준비한 후, 플라스미드 선택 유지를 위한 추가 영양분이 없는 5 mL의 YNB 배지에 효모 세포 콜로니 2~3개를 접종합니다. 30 °C에서 16~24시간 동안 흔들어 배양합니다. 이미징 약 3시간 전에 각 하룻밤 배양액의 OD 600을 측정합니다.그 후, 플라스미드 유지에 필요한 추가 영양분이 없는 YNB 배지에서 OD 600이 0.35에서 0.4가 되도록 5 mL 희석액을 준비하고, 30 °C에서 3시간 동안 흔들어 배양합니다. 배양하는 동안 현미경의 환경 챔버 또는 가열 스테이지를 30 °C로 사전 평형화합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 이미징용 처리된 8-웰 글래스 팟과 챔버 슬라이드를 준비한 후, 플라스미드 선택을 위한 추가 영양분이 없는 YNB 배지 200 µL를 각 웰에 넣습니다.배양이 완료되면 1 mL를 마이크로 튜브에 옮기고 8,000 RPM에서 2분 동안 원심 분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 그다음 상층액 975 µL를 제거합니다. 남은 상층액으로 세포 펠릿을 재현탁합니다.그런 다음 8-웰 플레이트의 각 웰 중앙에 세포 현탁액 2.5 µL를 떨어뜨립니다. 피펫으로 상하로 흡입 및 배출하여 세포를 분산시키고, 세포가 가라앉을 때까지 5분에서 10분 동안 기다립니다. 챔버 슬라이드를 30 °C로 유지된 도립 형광 현미경 위에 놓습니다.그 다음, 명시야 조명을 사용하여 세포 영역을 찾습니다. 100 µg/mL의 methionine이 포함된 미리 데워둔 YNB 배지 50 µL를 웰 내의 배지 200 µL에 추가하여 methionine의 최종 농도를 20 µg/mL로 맞춥니다. 이미징을 시작하기 전, 세포가 2분 동안 평형을 이룰 수 있도록 기다립니다.그 다음 이미징 직전에 현미경을 원하는 초점 평면으로 조정합니다. 5분 간격으로 45분에서 60분 동안 명시야 또는 DIC 이미지에서 GFP를 획득합니다. 이때 하나의 시계열 내의 모든

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유전자 삭제 및 단백질 overexpression은 단백질의 기능을 연구하는 일반적인 방법입니다. 이 문서에서는, 우리는 인구의 단백질 농도의 기능 및 단일 세포 수준으로 표현형 개발의 분석을 위해 프로토콜을...

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

우리는 형광 성장 효모 세포의 현미경 영화, 단일 셀 시계열 데이터를 추출하는 GUI 기반의 소프트웨어 패키지를 얻을 수있는 간단한 프로토콜을 제시한다. 분석은 자동화 혈통과 육안 검사 및 추적 데이터를 수동으로 큐 레이션과 통합 부문 시간 할당을 포함합니다.

신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

유동 세포 계측법 및 현미경에 따라 두 개의 보완적인 방법은 효모에서 MAPK 경로의 활성화에 의해 유도되는 유전자 발현의 역학의 단일 세포 수준에서 정량을, 가능하게하는 표시됩니다.

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

여기에서는 형광 측정 방법을 사용하여 부착 대식세포 세포주에 의한 형광 입자의 식세포작용을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 입자 내부화의 고처리량 정량화와 그에 따른 액틴 중합화를 용이하게 합니다.

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

효모 신진 인해 강력한 유전학과 미세 소관 세포 골격의 단순함에 생체 내 미세 소관 역학 연구를위한 유리한 모델입니다. 다음 프로토콜 변환 및 문화 효모 세포, 공 초점 현미경 이미지를 수집하고, 정량적으로 효모 살아있는 세포에서 미세 소관 역학을 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

핵분열 효모는 FtsZ 및 MreB와 같은 박테리아 세포골격 단백질을 GFP와 함께 번역 융합 단백질로 발현하여 중합을 시각화하는 이종 숙주로 사용됩니다. 또한 중합에 영향을 미치는 화합물은 형광 현미경을 사용하여 이미징하여 식별합니다.

박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 항균 약물 스크리닝을 위한 플랫폼으로서의 핵분열 효모

이 프로토콜은 효모 세포 주기 정지 및 선택적 방출의 두 가지 방법을 자세히 설명하고 S. cerevisiae에서 세포 주기 의존적 과정을 연구하기 위한 형광 현미경의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

발아 효모의 세포 주기 의존적 과정의 조작 및 분석

배우세요 살아있는 세포에서 소포 수송을 정량화하는 방법을. pHluorin 형광 단백질과 유세포 분석을 활용하여 말단 소포체 경로의 역학을 연구하고, 단백질 변이가 세포 기능에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

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