핵산 폴리아닐린 계 센서

이 절차의 전반적인 목표는 표지가 없는 방식으로 핵산을 검출하는 데 사용할 수 있는 물에 분산된 폴리아닐린을 합성하는 것입니다. 이 기술은 핵산을 검출하기 위한 비용 효율적인 방법입니다. 이를 채택한 실험실은 쉽고 견고하며 민감하다는 것을 알게 될 것입니다.

이 기술의 주요 장점은 표지가 없고 효소 조작 없이 RNA와 DNA를 직접 검출하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 새로운 진단 기술에 대한 잠재력을 가지고 있으며 라벨을 사용하지 않기 때문에 조작이 거의 없이 환자 샘플을 처리하는 데 사용할 수 있습니다. 시각적 시연은 센서를 쉽게 이해하는 데 도움이 됩니다.

이 플랫폼에는 고분자 과학과 생물학이 포함되어 있으며, 이는 매우 이국적으로 보이지만 실제로는 구현하기가 매우 쉽습니다. 250ml의 둥근 바닥 플라스크에 클로로포름 60ml에 아닐린을 완전히 녹입니다. 600RPM에서 5분 동안 저어준 후 얼음으로 섭씨 0도에서 5도까지 식힙니다.

이 작업은 보통 15분에서 20분 정도 걸립니다. 다음으로, 600RPM으로 교반하면서 둥근 바닥 플라스크의 아닐린 용액에 도데실벤젠설포네이트나트륨을 첨가합니다. 물 20ml에 과황산암모늄을 녹이고 반응 과열을 방지하기 위해 30분에 걸쳐 적가합니다.

씨 0도에서 5도에서 24시간 동안 반응을 수행합니다. 반응 혼합물이 처음에는 15분 후에 유백색으로 변하고 2시간 후에는 짙은 갈색으로 변하고 마지막으로 24시간 후에 짙은 녹색으로 변하는 것을 관찰하십시오. 그런 다음 24시간 동안 다시 실온에 도달하도록 합니다.

PANI 나트륨 도데실벤젠설포네이트 용액을 부흐너 깔때기로 여과합니다. 여과액을 클로로포름 80ml와 물 120ml와 섞어 분리 깔때기에 넣습니다. 용액을 실온에서 24시간 동안 배양한 다음 분리 깔때기에서 짙은 녹색 PANI를 수집하여 수성 상등액에 미반응 도데실벤젠설포네이트 나트륨 및 APS를 남깁니다.

PANI 용액 10X를 클로로포름 물로 희석한 다음 마이크로fuge 튜브에서 15분 동안 부드럽게 흔들어 200마이크로리터의 희석된 PANI와 6.4마이크로몰의 프로브 DNA 올리고뉴클레오티드를 혼합합니다. PANI DNA 용액에 2분 동안 가교제에 UV 제곱센티미터당 1200마이크로줄을 조사합니다. UV 노출을 표시된 양으로 제한하는 것이 중요합니다.

UV에 장기간 노출되면 PANI의 형광 변화가 손상되는데, 이는 PANI와 DNA의 공유 교차 누출로 인한 것일 수 있습니다. 17, 000 x g에서 6분 동안 원심분리하여 펠렛 복합체를 만들고 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 세척합니다. 두 번째 펠릿 후 PBS에서 다시 현탁합니다.

8마이크로리터의 100마이크로몰러 상보적 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 표적 핵산을 200마이크로리터의 PANI 프로브 복합체에 첨가합니다. 용액 혼합물을 섭씨 40도에서 15분 동안 흔들어 혼성화를 수행합니다. 6 분 동안 17, 000 x g에서 원심 분리로 PANI 복합체를 펠렛 화 한 후 PBS로 세척하고 물에 재현탁시킵니다.

다양한 처리의 PANI를 96웰 마이크로플레이트에 추가하고 250나노미터에서 여기(excitation)를 통해 270 - 850 나노미터 범위의 방출 형광을 측정합니다. PANI의 방출 피크는 약 500나노미터에서 관찰되어야 합니다. hyberdized duplex의 형광 현미경 측정을 수행하려면 붕규산 유리 커버 슬립에 PANI를 드롭 코팅하고 섭씨 40도에서 48시간 동안 건조합니다.

건조된 PANI 필름에 8마이크로리터의 100마이크로몰러 프로브를 추가한 다음 2분 동안 자외선을 조사합니다. 방사선 후 PANI 프로브 필름을 PBS로 세척하고 섭씨 40도에서 48시간 동안 건조합니다. 표적 핵산을 추가하여 15분 동안 혼성화를 수행합니다.

이는 생물학적 샘플 또는 통제된 표적 올리고뉴클레오타이드일 수 있습니다. 그 후 PBS 세정제를 사용하십시오. 500 나노미터 길이의 통과 필터를 사용하여 40배 배율로 형광 이미지를 얻을 수 있습니다.

다음은 UV 조사로 강화된 PANI와 DNA 프로브의 정전기 상호 작용입니다. 표적 핵산의 혼성화는 이중 형성을 유발하고 구조적 확인을 변화시켜 PANI 표면에서 프로브 표적의 해리를 초래합니다. 이 그림은 용액과 고체 코팅 매체 모두에서 프로브의 부재 또는 존재 시 PANI 형광의 변화를 보여줍니다.

형광의 증가는 음전하를 띤 DNA의 전자 플럭스로 인해 고분자 전자 밀도가 증가하기 때문입니다. 상보적 표적 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 따라 프로브가 분리되어 바질 형광의 복원을 주도합니다. 반대로, 일치하지 않는 단일 표적 올리고뉴클레오티드와의 교잡은 이러한 바질 형광의 복원을 초래하지 않습니다.

이 기술의 주요 참신함은 정확한 상호 작용을 위해 약한 UV를 사용하고 실제로 비특이적 상호 작용과 가벼운 상호 작용을 구별하는 데 도움이 된다는 것입니다. 이 기술을 완전히 익히면 감지 시간과 코팅의 건조 시간을 제외하고 최대 2시간이 걸릴 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 DNA는 물에 용해되고 산성 차는 실제로 PANI의 전자 특성을 변화시킨다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후 시청자는 물에 분산된 폴리아닐린을 합성하고 형광 특성을 사용하여 핵산을 검출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 그들은 프로브 DNA를 고정시키고 혼성화를 수행하여 표적을 탐지할 수 있습니다. 모노머를 사용할 때 이 합성은 위험하며 보안경, 장갑 및 실험복과 같은 보호 장비와 함께 후드에서 수행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.