Name: 분리 및 쥐 림프구의 활성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 배우세요 쥐 림프구 분리 및 활성화 방법을 통해 면역학 및 분자생물학 연구에서 유전자 결핍 림프구의 단백질 기능을 탐구하세요. 이 기술은 최소한의 조작과 환경 스트레스로 림프구를 신속하게 정제할 수 있습니다.

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이 연구는 교육, 싱가포르 교육부 (AcRF Tier1-RG40 / 13 Tier2-MOE2013 - T2-2-038)에 의해 지원됩니다. 원고는 Obrizus 통신에서 에이미 설리번에 의해 편집되었다.

모든 마우스는 사육 및 특정 병원균이없는 조건에서 유지되고 모든 마우스 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 실시하고있다. 버퍼 및 시약 1. 준비 <ol><li> 55 μM 2- 머 캅토 에탄올을 완료 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 배지 (10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM L- 글루타민, 페니실린 (100 IU / ㎖) / 스트렙토 마이신 (100 μg의 / ㎖)을 제조 ). </li><li> 별도로, 20 배 균형 소금 용액 (BSS) 주식 1 재고 2를 준비합니다. <ol><li> 20 배 BSS의 1 개 (1 L 멸균 111 mM의 포도당, 8.8 MM의 인산 칼륨, 26.7 mM의 인산 나트륨)를 준비하고 최종 볼륨 조정하기 전에 20 배 BSS의 1 개에 40 ㎖의 0.5 % 페놀 레드를 추가합니다. 4 ℃에서 저장하기 전에 0.2 μm의 필터를 사용하여 살균 필터. </li><li> 20 배 스톡 BSS 2 (25.8 mM의 염화 칼슘 이수화 물, 107 mM의 염화칼륨, 2.73 M 나트륨 CH 준비loride 19.6 mM의 염화 마그네슘 육수화물, 1- L 멸균 16.6 mM의 마그네슘 설페이트). 4 ℃에서 저장하기 전에 0.2 μm의 필터를 사용하여 살균 필터. </li><li> 400 ml의 멸균 각각 별도로, 50 ㎖ BSS의 1 개 및 50 ml의 BSS 주식이 희석, 실험적인 사용을 위해 1X BSS를 준비합니다. 모두 희석 솔루션을 결합하여 pH 7로 조정하고, 20 ㎖의 FBS (2 %)를 추가합니다. 0.2 μm의 필터를 사용하여 멸균 및 살균 필터를 사용하여 1 L까지 최고. 참고 : 농축 BSS 주식 혼합 직접 침전이 발생할 수 있기 때문에 BSS의 재고 솔루션은 별도로 준비해야한다. </li></ol></li><li> 적혈구 (RBC) 용해 버퍼 <ol><li> , RBC 용해 버퍼를 준비 사용하기 전에 1 부품 재고 트리스베이스 (멸균 130 mM 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄, 산도 7.65) 9 부에게 재고 암모늄 클로라이드 (멸균 155 MM의 염화 암모늄)를 혼합합니다. 참고 : 4 ° C에서 염화 암모늄 및 트리스베이스의 저장 멸균 재고 솔루션을 제공합니다. 용해 B를 제조적혈구의 효율적인 용해를 보장하기 위해 신선한 uffer. </li></ol></li></ol> 비장 또는 림프절에서 림프구 서스펜션의 2 세대 주 : 마우스를 안락사 이전 실험에 필요한 모든 시약 및 장치를 제조 및 높은 세포 생존율을 유지하기 위해 가능한 한 빨리 림프구의 단일 세포 현탁액을 생성하는 것이 중요하다. <ol><li> 자궁 경부 전위 또는 CO 2 질식에 의해 실험 마우스를 안락사. 참고 : 이후이 단계에서 모든 실험 절차는 무균 적으로 수행해야합니다. </li><li> 어떤 절개를하기 전에 70 % 에탄올로 전체 마우스를 찍어. 비장과 림프절 무균 8을 제거하고 또는 (단계 1.2.3에서) BSS / FBS (2 % FBS와 RPMI) 5 ml의 얼음처럼 차가운 RPMI / FBS를 포함하는 별도의 15 ml의 튜브에 배치합니다. 주 : BSS 효율적 RBC 용해를 방지하기 때문에, 비장 세포 현탁액의 제조 RPMI를 사용 afte BSS로 전환R RBC 용해. </li><li> 2 ml의 얼음처럼 차가운 RPMI / FBS 또는 BSS / FBS를 포함하는 페트리 접시에 멸균 100 μm의 셀 스트레이너 메쉬의 두 조각 사이에있는 기관 (들)을 배치, 비장이나 림프 노드에서 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 그것은 매우 미세한 부분으로 찢어 때까지 1 ml의 주사기의 플런저를 사용하여, 기관 (들) 매쉬. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송하고, 셀 스트레이너 얼음처럼 차가운 RPMI / FBS 또는 BSS / FBS 메쉬 씻는다. 나머지 세포 현탁액을 수집 같은 15 ML 튜브에 추가하고, 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운. 뜨는을 제거합니다. 주 : 다음 단계에서 RBC 용해 버퍼 또는 매체를 추가하기 전에 손가락으로 튜브를 flicking하여 펠렛 세포를 일시 중지 다시. </li><li> 세포 현탁액을 원심 분리 동안 실온 (RT) RBC 용해 버퍼를 준비한다 (단계 1.3 참조.). 상층 액을 세포를 펠렛 및 제거한 후, 매 10 8 세포를 1 ml의 RBC 용해 버퍼와 세포를 다시 일시 중지합니다. 인큐BATE 3-4 분 동안 RT에서 분해 반응. </li><li> 14 ml의 얼음처럼 차가운 BSS / FBS와 RBC 용해를 중지하고 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운. </li></ol> B 및 T 세포의 정제 3. <ol><li> B 세포의 정제 <ol><li> 혈구 세포를 사용하여 계산. 300 ㎕의 BSS / FBS 최대 10 8 비장 세포를 다시 일시 중지하고 50 μl의 항 CD43에게 자기 마이크로 비드 9,10를 추가합니다. 죽은 세포를 제거 30 μl를 넥신 V 자석 구슬을 추가합니다. 30 분 동안 4 ℃로 냉장고에 세포 현탁액을 부화. </li></ol></li><li> T 세포의 정제 <ol><li> 혈구 세포를 사용하여 계산. 비 T 세포 고갈 항체 칵테일 10 8 세포 (CD19, B220, GR-1에 대한 비오틴 항체까지 다시 일시 중지, TCR-γδ, CD49b, 중 CD11c, CD11b를, Ter119 및 CD4 또는 CD8은에 표적 세포 인구에 따라 / FBS -4,5- 200 μL의 BSS 200 :) 정제 1 희석. A의 세포 현탁액을 부화15 분 동안 4 ° C 냉장고. </li><li> 배양 후, 세포를 세척하고 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운 10 ml의 BSS / FBS를 추가합니다. 상층 액을 제거하고 30 μL의 스트렙 타비 딘 마이크로 비드 15 ㎕를 넥신 V 자기 구슬 165 μL의 BSS / FBS에서 세포를 다시 일시 중지합니다. 30 분 동안 4 ℃로 냉장고에 세포 현탁액을 부화. 주 : 심지어 자기 마이크로 비드와 라벨을 보장 15 분 동안 마이크로 비드와 세포를 배양 한 후 15 ML 튜브를 눌러 부드럽게 세포 현탁액을 혼합 단계 3.1.1 중에 다른 15 분을 품어. 또는 3.2.2. </li></ol></li><li> 셀 정화를위한 분리 컬럼의 제조 <ol><li> 세포의 마이크로 비드 라벨 동안 사용되지 않은 분리 컬럼을 준비한다 (단계 3.1.1. 또는 3.2.2.). RT에 (FBS)없이 사전 따뜻한 BSS 및 세척 및 무균 열 평형을 2 ml를 사용합니다. BSS와 평형 후, 세척 된 열은 건조하도록 허용해서는 안된다. 참고 : 우리는 LS의 C를 사용하여olumn 대신 권장 LD 열 인해 재사용 성을 (단계 3.4를 참조하십시오.). </li><li> 자기 구슬 표시 한 후, 세포를 세척하고 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운 14 ml의 BSS / FBS를 추가합니다. 상층 액을 제거하고 1-3 ml의 RT BSS에서 세포를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 정제 과정에서 유속을 감소시키기 위해 열 선단에 멸균 21 G 바늘을 부착. 평형화 컬럼에 세포 현탁액을 넣고 정제 된 표적 세포를 함유 통해 흐름을 수집한다. 주 : 열로드하는 동안에 거품을 도입하지 마십시오. </li><li> 1 ml의 BSS / FBS 한 번 컬럼을 세척하고 정제 된 표적 세포를 포함 통해 흐름을 수집합니다. 다시 한번를 통해 흐름에 열을 다시로드합니다. 동일한 15ml를 튜브에 제 2 로딩 돌파 흐름을 수집한다. </li><li> 1 ml의 BSS / FBS와 열을 3 회 세척하고 정제 된 표적 세포를 포함 통해 흐름을 수집합니다. 그 후, 토륨 5 ml의 BSS / FBS를 추가플런저와 전자 칼럼은, 새로운 15 ML 튜브에 열을 밖으로 자기 표지 된 세포를 세척합니다. </li><li> 정제 B 또는 T 세포의 항원 4,5- 표면에 결합하는 항체를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 수집 된 세포의 순도를 확인한다. </li></ol></li><li> 다시 사용하여 분리 컬럼을 주 : LS 열이 정화 효율에 영향을주지 않고 4 회 이상 재사용 할 수있다. <ol><li> 5 ml의 포스페이트 완충 식염수 (PBS)와, 플런저를 사용하여 상부로부터 증류수 5 mL로 3 회 컬럼을 3 회 세척 하였다. </li><li> 5 ml의 70 % 에탄올로 컬럼을 세척하고 광범위 열에 녹의 축적을 방지하기 위해 공기 탭을 사용하여 열을 건조. </li><li> 별도의 정화 실험을 위해 사용 된 LS 열을 준비하려면, 주사기 어댑터를 사용하여 5 ml의 70 % 에탄올로 아래에서 위로 열을 씻는다. 다음으로, 컬럼의 상단에서 한 번에 5 ml의 PBS 다음에 5 ml의 멸균 PBS로 두 번 아래에서 위로 열을 씻는다. 2 추가ml의 RT BSS는 열 평형을 다음 라벨 세포와 열을로드로 진행합니다. </li></ol></li></ol> 4. CFSE 라벨 및 자극 주 : 정제 된 세포는 시험 관내의 다양한 생체 기능 분석에서 실시 될 수있다. 여기서는 장갑차 (5)의 T 세포 자극 기능을 결정하기 위해 정제 된 T 세포를 사용한다. <ol><li> 37 ° C 이전 CFSE에 로딩 사전 따뜻한 라벨 솔루션 (PBS에서 0.1 % FBS). 참고 : PBS에서 FBS의 낮은 비율을 사용하여이 CFSE 로딩 중 세포 사멸을 감소시키고 원심 분리하는 동안 세포 손실을 최소화 할 수 있습니다. 그러나, 너무 많은 FBS는 CFSE 로딩을 방해 할 수 있습니다. </li><li> 라벨 용액으로 두 번 정제하여 세포를 세척 한 다음 15 ㎖의 튜브 예열 라벨링 용액에 2 × 107 세포 / ㎖로 재현 탁. </li><li> 10 μM CFSE의 용액을 제조 하였다 (1 : 500 희석 5mM의 CFSE 원액) 예열 라벨 솔루션이다. CFSE 솔루션해야갓 최적 라벨링을 달성하기마다 준비. </li><li> CFSE로 세포를 로딩하기 위해, 37 ° C에서 10 분 동안 어두운 데에서 15 ㎖의 튜브에 1 부분 10 μM CFSE의 용액에 한 부분에 세포 현탁액을 추가 배양한다. 5 μM CFSE의 최종 농도는 1 × 10 7 세포 / mL의 라벨을 사용한다. </li><li> CFSE 로딩 동안 세포 균질 한 혼합을 보장하기 위해 관마다 2 분 전환. </li><li> 반응을 중지 얼음처럼 차가운 완전한 RPMI 매체의 여러 볼륨을 추가, 4 ° C에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운합니다. 성공적인 CFSE 로딩되면, 세포 펠렛은 황색 표시됩니다. </li><li> 워시 CFSE는 얼음처럼 차가운 완전한 RPMI 배지로 세포를 한 번 더로드 및 체외 배양 또는 생체 자극에 사용하기 전에 4 ° C에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운. </li></ol> 5. 체외 자극 <ol><li> 바로 사용하기 전에 자극의 2 배 원액 (2 배 자극 원액)를 준비 (10) 그래서배 자극 원액 0 μL를 96 웰 플레이트에 웰 당 200 ㎕의 최종 부피로 세포 100 μl를 첨가 할 수있다. </li><li> (B 세포 또는 T 세포 CD3 및 CD28 또는 CD40에 대한 IgM의) 자극 코팅 플레이트가 필요할 경우, 밤새 4 ℃에서 PBS에 자극 및 프리 코트 배양 접시를 희석. 대안으로, 배양 용기는 실험 하루에 1 시간 동안 37 ℃에서 코팅 할 수있다. PBS (접시 언제든지 건조하는 것을 허용하지 않는다)로 두 번 코팅 된 판을 씻으십시오. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> B 세포 </td><td></td></tr><tr><td> 자극 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> F (AB &#39;) 2 염소 항 - 마우스 IgM의 </td><td> 0.6-2.4 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td> 반대로 마우스 CD40 단클론 항체 </td><td> 0.5 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td> 재조합마우스 IL-4 </td><td> 25 U / ㎖ </td></tr><tr><td> 리포 폴리 사카 라이드 </td><td rowspan="2"> 0.1 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td> E.에서 (LPS) 대장균 혈청 형 055 : B5 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> T 세포 </td><td></td></tr><tr><td> 자극 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 항 CD3 (플레이트 코팅) </td><td> 2-10 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td> (50 μL / 웰 코팅) </td><td></td></tr><tr><td> 안티 CD28 (플레이트 코팅) </td><td> 2 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td> 재조합 IL-2 </td><td> 40 U / ㎖ </td></tr><tr><td> PDBu (포르 볼 에스테르) </td><td> 5-50 ng를 / ㎖ </td></tr><tr><td> A23187 (칼슘 이온 운반체) </td><td> ng를 250 / ㎖ </td></tr></tbody></table> 표 1 : 체외 배양에서 림프구를 자극하는 데 사용되는 자극의 농도.<ol start="3"><li> CFSE 표지 된 B 세포의 경우, 3 × 105 세포 중으로의 완전한 RPMI 배지 및 배양 6 × 10 3 세포 / ml을 다시 중지 / 웰로 72 시간 동안 96- 웰 편평 바닥 플레이트. </li><li> CFSE 표지 된 T 세포, 0.5~3 × 105 세포 중으로의 완전한 RPMI 배지 및 배양에 0.5~3 × 106 세포 / ㎖로 재 - 정지 / 웰에서 48 또는 72 시간 동안 96 웰 둥근 바닥 플레이트 . </li></ol> 6. 생체 자극 <ol><li> 생체 자극, 적응 적 전송을위한 마우스 당 4 × 10 6 CFSE 표지 T 세포 (정맥 주사 (IV) 200 ㎕의 PBS에) 각 MHC-일치받는 사람 마우스로. 참고 :이 프로토콜에서, CFSE 표지 T 세포가 적응 적 집 같은 비장과 림프절 등 장기 림프하는 것입니다 이러한 세포로 꼬리 정맥 또는 역 궤도 주사를 이용하여 전송할 수 있습니다. </li><li> 일일 나중에 항원받는 사람 마우스에 도전. 노트:OVA 특이 적, T 세포 수용체 (TCR) -transgenic T 세포가 적응 적받는 마우스에 옮겼다 때문에이 예에서는 항원으로서 난 알부민 (OVA 단백질를 50㎍ / 마우스)를 사용한다. 각받는 사람 마우스 (5)로, 피하 주사 (SI)를 통해 멸균 PBS에서 OVA 단백질을 준비하고 OVA 단백질 / PBS 또는 PBS 제어의 100 μl를 주입. </li><li> 수확 3 일 OVA 단백질 또는 PBS와 예방 접종 후받는 사람 마우스의 단일 림프 기관에서 세포 현탁액 (림프절과 비장)을 생성합니다. 근위 림프절 장간막, 오금, 사타구니, 허리와 꼬리 림프절을 포함 겨드랑이, 상완 및 표면 경부 림프절) 및 말초 림프절 (DLN)를 포함한다 (PLN),에 별도의 림프절. FACS 적절한 항체를 사용하여 염색 된 세포는 T 세포의 증식을 확인한다. 주 :이 CFSE 셀 추적 실험에서 비 디위한 기준선 형광을 설정 PBS가 주입 된 대조군 마우스로부터 T 세포를 CFSE 표지세포를 이용하므로. 증식 세포 분열은 항원 자극, CFSE 표지 된 세포는 형광 피크 (12, 13)을 측정함으로써 가시화된다. PBS를 제어으로 증식 세포 분열의 수, CFSE 표지 된 T 세포 12,13 결정될 수있다. </li><li> 샘플 사이의 세포 분열이나 피크의 수를 비교하여 CFSE 표지 된 세포 증식 데이터를 분석 (도 1 및도 2). 참고 : 예를 들어, CFSE 표지 된, 적응 적 난자 항원을 수신받는 마우스에 전달 OVA 특이 적 T 세포는 PBS가 주입 된 대조군 마우스에 비해 5,12- 활성 증식을 받게 될 것이다. 또한, 호킨스 동료 (14)에 의해 입증 된 바와 같이 CFSE 세포 증식 데이터를 분석하는 다양한 방법이 있다는 것을 지적 주목할 만하다. </li></ol>

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이 프로토콜에서는, 우리는 림프 기관에서 림프구를 정제하는 과정을 보여줍니다. 자기 비드 정렬을 사용하여 셀 정화가 가능한 고도로 정제 된 표적 세포를 산출 빠르고 간단한 방법이다. 프로토콜 내에서 중요한 단계 세포 생존 및 세포 수율 체외에서 조혈 계통 세포의 생존을 유지하는 것은 성공적인 및 재현 실험을 보장하는 데 중요합니다. 화학 및 생물학적 시약, 하위 최적의 실험 조건이나 절제 기관의 부적절한 보관 조건은 모든 세포 생존에 영향을 줄 수 있습니다. 마우스의 적출 후, 림프 기관 얼음과 가능한 빨리 제조 된 단일 세포 현탁액에 저장 될 필요가있다. 세포 현탁액을 고속 원심 또한 피해야한다. 또한, 세포 펠릿 상층 액을 제거 후 손가락으로 튜브를 쓸어 넘겨 느슨하게해야합니다. 그것은 아니다피펫으로 매체의 많은 양의 직접 다시...

성숙한 림프구는 일반적으로 개인에게 기존 감염이나 염증이 없는 경우 휴지 상태로 존재합니다. 따라서 in vitro 또는 in vivo 기능 분석을 수행하기 전에 분리 과정에서 림프구의 순진한 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 일관되고 재현 가능한 결과를 보장하는 핵심은 불필요한 세포 조작을 제한하는 것입니다. 
자기 세포 분류는 항체와 마이크로비즈를 사용하여 세포를 라벨링함으로써 관심 세포 집단을 풍부하게 합니다. 이 접근 방식에는 두 가지 정화 전략이 있습니다: positive enrichment와 negative depletion. Positive Enrichment는 표적 세포에 결합하는 항체를 사용하여 관심 세포 집단을 농축합니다. 반면에 Negative Depletion은 비표적 세포를 고갈시켜 관심 세포 집단을 남깁니다. 우리 실험실에서는 표적 세포에 대한 항체의 결합이 잠재적으로 세포의 특징과 행동을 변화시킬 수 있기 때문에 긍정적 농축(positive enrichment)보다 음성 고갈(negative deplement)을 선호합니다. 사실, 특정 세포 집단의 분리에 적합한 많은 확립된 세포 표면 마커는 기능적 수용체이기도 합니다. 
자기 세포 분류는 생존 가능한 표적 세포의 매우 순수한 집단을 산출할 뿐만 아니라 시간이 덜 걸리고 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 사용되는 고압 흐름에 의해 유발되는 세포 스트레스를 피할 수 있습니다. 원치 않는 세포 집단을 라벨링하고 자기 분리 컬럼을 사용하여 고갈시킴으로써, 우리는 표적 세포 집단의 생존력을 손상시키지 않으면서 신속한 세포 분리를 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 미접촉 B 세포 또는 T 세포를 정제하기 위해 음성 고갈 전략을 사용하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (L-Glutamine 제외)</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td></td><td></td><td>Heat 비활성화&nbsp;</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140114</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD43 마그네틱 마이크로비즈</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-801</td><td>사전 사용 중 잘 혼합</td></tr><tr><td>Streptavidin 마이크로비즈</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td>사전 사용</td></tr> <tr>잘 혼합<td>Anti-Annexin V 자석 비즈</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-201</td><td>사용 전 사용 MACS LD를 잘 섞어;</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 U-바닥 멸균 배양 플레이트</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 F-바닥 멸균 배양 플레이트</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m 세포 스트레이너 메쉬</td><td></td><td></td><td>사용 전 UV 방사선을 사용하여 살균하려면</td></tr><tr><td>0.2 &mu; 엠&nbsp; 멸균 일회용 필터 장치</td><td>Nalgene</td><td>567-0020</td>은 <td>모든 멸균 필터 장치로 대체할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. CellTrace Violet</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>CTV, 줄여서 CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Yellow</td><td>Invitrogen</td><td>C34567</td> CTY의 대안, CFSE CellTrace Far Red Invitrogen C34564 <td>CTFR의 대안</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>, CFSE</td></tr><tr><td>의 대안세포 증식 염료 eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840</td><td>CPD670, 줄여서 CFSE</td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td>PKH26의 대안, CFSE의 대안</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Chemicals </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마 Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td><td>성 시그마 Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기</td>성 <td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마 알드리치</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>머크 밀리포어</td><td>S7653</td><td>다른 출처에서 사용 가능</td></tr> 염화<tr><td>마그네슘 육수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘</td><td>시그마 알드리치</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>시그마 알드리치</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td>D8418</td><td></td></tr> <tr><td>(5- (및 6-) 카르복시 플루 오레 세인 디아세테이트 숙시니 미딜 에스테르 (CFSE)</td> <td>분자 프로브</td><td>C-1157</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Phorbol 12,13- 디부티 레이트 (PBDU, Phorbol 에스테르)</td>에서 재구성 시<td>그마 알드리치</td><td>P1269</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (칼슘 이오노 단)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>C7522</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>항체 및 재조합 단백질</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b 비오틴(클론 m1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td>T 세포 고갈 칵테일</td></tr><tr><td>CD11c 비오틴(클론 N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>T 세포 고갈 칵테일</td></tr><tr><td>Gr-1 비오틴(클론 N418) RB6-8C5)</td><td>바이오레전</td><td>드 108404</td><td>T세포 고갈 칵테일</td></tr><tr><td>Ter119 비오틴(클론 Ter119)</td><td>바이오레전</td>드 <td>116204</td><td>T세포 고갈 칵테일</td></tr><tr><td>TCR-&감마; &델타; 비오틴 (클론 GL-3)</td><td>바이오레전</td><td>드 118103</td><td>T 세포 고갈 칵테일</td></tr><tr><td>CD19 비오틴 (클론 6D5)</td><td>바이오 레전</td>드 <td>115504</td><td>T 세포 고갈 칵테일</td></tr><tr><td>B220 비오틴 (클론 RA3-6B2)</td><td>바이오 레전</td>드 <td>103204</td><td>T 세포 고갈 칵테일</td></tr><tr><td>CD49b 비오틴 (클론 DX5)</td><td>바이오 레전</td>드 <td>108904</td><td>T 세포 고갈 칵테일</td></tr><tr><td>CD4 비오틴 (클론 GK1.5)</td><td>바이오 레전드</td><td>100404</td><td>T 세포 고갈 칵테일</td></tr><tr><td>CD8 비오틴 (클론 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>T 세포 고갈 칵테일</td></tr><tr><td>F (ab ')2 염소 안티 마우스 IgM (플레이트 코팅)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>115-006-075</td><td>50 & 마이크로; 코팅용 l/웰(96-well)</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD40 mAb (플레이트 코팅)</td><td>Pharmingen&nbsp;</td><td>553722</td><td>50 &마이크로; 코팅용 l/웰 (96-웰)</td></tr> <tr><td>재조합 IL-4</td><td>ProSpec&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli Serotype 055:B5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L-4005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (클론 클론 OKT3) (플레이트 코팅)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0037-85</td><td>50 &마이크로; 코팅용 l/웰 (96-웰)</td></tr><tr><td>Anti-CD28 (클론 클론 37.51) (플레이트 코팅)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0281-85</td><td>50 &마이크로; l/우물 코팅용 (96-well)</td></tr>닭 달걀 흰자위의 <tr><td>재조합 IL-2</td><td>ProSpec</td><td>Cyt-370</td><td></td></tr><tr><td>알부민, Ovalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7641</td><td></td></tr></tbody></table>

분리 및 쥐 림프구의 활성화

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B 세포와 T 세포는 매우 다양한 항원 수용체 레퍼토리를 가지고 있어 거의 모든 침입 병원체에 대해 특정 면역 반응을 일으킬 수 있는 능력을 가지고 있습니다1,2. 이해할 만하게도, 이러한 복잡한 능력은 시기적절하고 공간적으로 조절되는 면역 반응을 보장하기 위해 다양한 세포 과정에 관여하는 많은 수의 분자에 의해 제어됩니다3. 여기에서는 자기 세포 분류 기술을 사용하여 고도로 정제된 쥐 림프구를 신속하게 분리할 수 있는 실험 절차에 대해 설명합니다. 그 결과 정제된 림프구는 면역 블로팅에 의한 자극 시 림프구 신호 전달 능력의 측정4 및 3H-티미딘 혼입 또는 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙시니미딜 에스테르(CFSE) 라벨링에 의한 증식 능력의 조사와 같은 다양한 시험관 내 또는 생체 내 기능 분석을 수행할 수 있습니다5-7. 조절 림프구와 유전자 변형 림프구의 기능적 능력을 비교하는 것 외에도, 이식된 CFSE 표지 OT-I T 세포를 사용한 대표적인 결과에서 볼 수 있듯이 생체 내에서 항원제시세포(APC)의 T세포 자극 능력을 결정할 수 있습니다.

림프구 세포 자기 정화 사용자가 상대적으로 짧은 시간 동안 표적 세포 집단을 정제 할 수있다. 우리 공핍 프로토콜을 사용하여, 정제 후 94.2 % (에 72.8 % (전 정제) 행 (재결합 활성화 유전자 1 (RAG-1) 결핍 생쥐 OT-I) CD8 T 세포의 비율을 증가 할 수 있었다; 도 1a) 4,5. 이러한 정제 림프구는 림프구 증식 및 신호 전달 4,5-을 결정하는 다운 스트림 기능 분석에 사용될 수있다. 예를 들어, 우리는 장갑차의 생체 내 T 세포 자극 능력을 연구 할 야생형 (WT) 및 적합한 항원 5 면역화 돌연변이 (MT) 마우스에 CFSE 표지 된, 항원 특이 적 T 세포를 옮겨서. 우리의 대표 실험에서, 우리는...

림프구는 적응 면역 반응의 주요 플레이어입니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo에서 원하는 분자의 림프구 활성화의 생리학적 기능을 결정하기 위한 림프구 정제 프로토콜을 제시합니다. 설명된 실험 절차는 대조군 림프구와 유전자 변형 림프구 간의 기능적 능력을 비교하는 데 적합합니다.

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

이 실험의 전반적인 목표는 다양한 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in-vivo) 기능 분석법을 사용하여 정제된 마우스 림프구의 기능적 능력을 연구하는 것입니다. 이 방법은 면역학 및 분자생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 유전자 결핍 림프구에서 특정 관심 단백질의 기능을 조사하는 것 등이 있습니다.이 기술의 주요 장점은 최소한의 조작과 환경적 스트레스로 림프구를 빠르게 정제할 수 있다는 점입니다. B 세포를 정제하려면 최대 1×10⁸개의 적혈구가 용해된 비장 전체 세포를 FBS가 첨가된 300 µL의 균형염 용액(BSS)에 다시 현탁하십시오. 그 다음 anti-CD43 자기 마이크로비즈 50 µL를 첨가하십시오.사멸 세포를 제거하기 위해 Annexin V 마그네틱 비드 30 µL를 첨가하고 4 °C에서 30분 동안 반응시킵니다. 세포가 균일하게 라벨링되도록 15분 간격으로 세포 현탁액을 가볍게 튕겨줍니다. 배양 후에는 FBS가 첨가된 BSS 14 mL로 라벨링된 세포를 세척합니다.원심분리 후 상층액을 제거하고, 튜브를 가볍게 쳐서 펠릿을 FBS가 첨가된 실온의 BSS 1~3 mL에 재현탁합니다. 원심분리 동안 분리 컬럼을 마그네틱 랙에 장착하고, 유속을 낮추기 위해 컬럼 팁에 멸균된 21게이지 바늘을 부착합니다. 실온의 BSS 2 mL로 컬럼을 평형화합니다.실온의 BSS 1~3 mL로 펠릿을 재현탁한 후, 수집 튜브를 바늘 아래에 놓고 B로 표시된 세포를 평형화된 컬럼에 로딩합니다. 통과액을 15 mL 원뿔형 튜브에 수집합니다. 그다음 FBS가 첨가된 신선한 BSS 1 mL로 컬럼을 세척합니다.세척액을 수집된 표적 세포와 함께 모은 후, 표적 세포가 포함된 용액으로 컬럼을 다시 충전하고, 통과액을 동일한 15 mL 튜브에 수집합니다. 그리고 FBS가 첨가된 BSS 1 mL로 컬럼을 3회 세척하며, 세척액을 표적 세포 현탁액과 계속해서 함께 모읍니다. 3번째 세척 후, 자석에서 컬럼을 제거하고 FBS가 첨가된 BSS 5 mL를 로딩합니다.컬럼 플런저를 사용하여 자기 표지된 비표적 세포를 새로운 15 milliliter 튜브로 밀어냅니다. 그 후, 유세포 분석법을 통해 분리된 세포의 순도를 확인합니다. 분리 컬럼을 재사용하려면, 자기 비드 표지 세포를 밀어낸 후 컬럼 상단에서 PBS 5 milliliter로 3회, 증류수 5 milliliter로 3회 세척합니다.다

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Miltenyi 맥스 키트를 사용 lymphocytes의 격리는 전체 림프 조직 homogenates에서 세포를 정화하는 안정적인 방법입니다. Miltenyi 시스템을 사용하여 정화 세포는 일반적으로 ≥ 96% 순수하고 있습니다. 여기, 우리는 CD4 + T 세포, Miltenyi에서 제공하는 많은 키트 중 하나를 분리하기 위해 취한 단계를 보여줍니다.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

이 비디오에서는, 우리는 CD40 - 활성화 및 면역의 유도를 연구하는 모델 항원 제시 세포 (APC)로 사용할 수 있습니다 C57BL / 6 마​​우스 splenocytes에서 murine B 세포의 확장 프로 시저를 보여줍니다.

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을...

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

마우스 성기 기관에서 림프구를 분리 할 수​​있는 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 효율적으로 분리 할 수​​ 있도록 효소 분해와 Percoll 기울기 분리에 활용합니다. 이 기술은 다른 종에 사용하기 위해도에 적용 할 수...

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

Peyer의 패치에있는 셀의 특정 subpopulations (조달청), 창자 관련 림프의 조직의 주요 유도 사이트의 면역 기능을 이해 증가 관심이 있습니다. 여기 흐름 cytometric 분석 및 immunostaining을위한 PP cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비 병렬 프로토콜을 설명합니다.

림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

여기에서 우리는 분리, 식별 및 마우스 흉선 상피 세포 (TEC는) 정화용 효율적인 방법을 설명합니다. 프로토콜은 정상 T 세포의 발달, 흉선 기능 장애, 및 T 세포 재구성을위한 흉선 기능의 연구에 활용 될 수있다.

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

림프절 기질 세포의 분리는 섬유아세포 망상 세포, 림프 및 혈액 내피 세포를 얻기 위한 효소 분해 및 기계적 분해를 포함하는 다단계 절차입니다. 설명된 절차에서는 짧은 분해와 자동화된 기계적 분해를 결합하여 생존 가능한 림프절 기질 세포의 표면 마커 저하를 최소화합니다.

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

Monocyte 파생 된 DC (MoDC) 위험 관련 된 분자의 작은 금액을 느낄 수 및 따라서 쉽게 끝났다. 우리는 혈액과 종양과 그들의 조기 활성화를 피하기 위해 고려해 야 하는 주요 조치를 강조 하면서 면역성이 있는 복합물으로 그들의 활성화에서 MoDC의 격리에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

현재 연구는 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신을 평가하고 이러한 세포에서 유전자 발현을 조작하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근

배우세요 쥐 림프구 분리 및 활성화 방법을 통해 면역학 및 분자생물학 연구에서 유전자 결핍 림프구의 단백질 기능을 탐구하세요. 이 기술은 최소한의 조작과 환경 스트레스로 림프구를 신속하게 정제할 수 있습니다.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

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