유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성
2016년 10월 18일
이 원고는 표현형 및 유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 거주하는 대 식세포의 정량 분석을위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 얻어진 염색 된 세포는 이에 실험 모델에서 얻어진 정보를 증가, 세포 선별, 유전자 발현 분석 또는 기능적 연구를 포함하는 다른 응용에 사용될 수있다.
이 절차의 전반적인 목표는 유세포 분석을 통해 쥐 신장의 상주 대식세포를 정량화하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 신장 손상에서 유형의 각 macraphage의 기여도가 무엇인지와 같은 유동성에 대한 답변 핵심 질문을 가질 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 서로 다른 단백질 마커의 신장 카테터 삽입이 가능하다는 것입니다. 따라서, 시연의 세포 무결성을 제한하는 것은 Complutense University의 A.P.A.S.D. 학생인 Elena Olivares와 신장 관류 및 발치를 위해 피부의 작은 주름을 꼬집어 쥐가 적절한 진정 수준에 도달했는지 확인하는 것으로 시작합니다. 그리고 수의사 연고로 눈을 덮으십시오. 동물을 누운 자세로 수술대에 놓습니다. 그리고 복부를 70% 에탄올로 담그십시오. 다음으로, 복부 피부와 복막을 통해 치골에서 흉곽까지 중앙 절개를 하여 흉막과 복강을 노출시킵니다. 관류 시스템을 사용하여 복부 대동맥에 0.9% 식염수를 주입하여 신장을 세척합니다. 혈액 배출을 돕기 위해 복부의 대동맥을 절단합니다. 신장에서 혈액이 모두 제거되면 신장 골을 절단하십시오. 그런 다음 각 신장의 가장자리를 눌러 장기의 캡슐화를 조심스럽게 제거합니다. 그리고 추출된 신장을 신선한 H.B.S.S.To 으로 옮기고 단일 신장 세포 현탁액을 생성하고 가위를 사용하여 한 신장의 절반을 작은 조각으로 자릅니다. 조직 조각을 1.5mL 튜브에 옮기고 새로 준비한 콜라겐분해효소 1mL를 튜브에 추가하여 37시에 30분 배양
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개요
본 원고는 유세포 분석법을 이용한 쥐 신장 내 상주 대식세포의 표현형 및 정량 분석을 위한 상세 프로토콜을 기술합니다. 이렇게 염색된 세포는 다양한 응용 분야에 활용될 수 있으며, 이를 통해 실험 모델에서 얻는 정보를 강화할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 면역학
- 세포생물학
배경
- 대식세포는 신장의 건강과 질병에서 중요한 역할을 합니다.
- 유세포 분석법을 통해 세포 집단에 대한 상세한 분석이 가능합니다.
- 대식세포의 거동을 이해하면 치료 전략을 세우는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 신장 기능을 연구하는 데에는 주로 쥐 모델이 사용됩니다.
연구 목적
- 신장 대식세포를 분리하고 분석하기 위한 프로토콜을 개발한다.
- 신장 환경에서 대식세포 기능에 관한 추가 연구를 촉진한다.
- 관련 분야 연구자들에게 유용한 리소스를 제공한다.
사용된 방법
- 세포 분석을 위한 유세포 분석법.
- 대식세포 식별을 위한 염색 기법.
- 세포 분리 및 유전자 발현 분석 프로토콜.
- 대식세포 활성 평가를 위한 기능 연구.
주요 결과
- 쥐 신장에서의 resident macrophage의 성공적인 분리.
- 대식세포 표현형의 상세한 특성 분석.
- 유전자 발현 및 기능 연구에서의 잠재적 응용.
- 신장 건강에서 대식세포의 역할에 대한 이해 증진.
결론
- 본 프로토콜은 대식세포 분석을 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 결과는 향후 신장 질환 연구에 활용될 수 있습니다.
- 연구 범위는 유세포 분석 이외의 다른 응용 분야로 확장될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
신장 질환 모델에서 대식세포 하위 집단의 정확한 표현형 특성 분석은 염증 유발 신장 병리에서 표적 검증의 리스크를 줄이는 데 매우 중요합니다. 본 유세포 분석 프로토콜은 쥐 신장에서 염증 촉진성(M1) 및 면역 조절성(M2) 대식세포 표현형을 정량적으로 구별할 수 있게 하여, 섬유화 및 면역 조절에 대한 기전적 통찰을 제공합니다. 신장 손상에 대한 대식세포의 기여도를 평가하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공함으로써, 이 접근 방식은 전임상 표적 선택 및 경로 분석의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 신장 손상 모델에서 M1/M2 대식세포 비율을 정량화함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: CD86/CD163 표면 염색과 함께 이중 CD45/CD68 게이팅을 사용하여 높은 특이도로 대식세포 표현형을 정의합니다.
- 예측적 가치: 대식세포 분극 상태를 섬유화 및 면역 조절 경로와 연결함으로써 타겟 위험 감소(de-risking)를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 대식세포 빈도 및 마커 발현에 대한 표준화된 정량적 유세포 분석 결과물을 생성합니다.
- 재현성: 낮은 세포 사망률과 보존된 무결성을 입증하여, 실험 전반에 걸쳐 일관된 표현형 판독을 가능하게 합니다.
- 후속 분석 활용성: 분리된 대식세포는 세포 분류, mRNA 및 단백질 분석이 가능할 정도로 생존력을 유지하여 멀티오믹스 후속 연구를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: 대식세포 표현형이 병인 기전을 주도하는 염증성 신장 질환 모델에 직접적으로 적용 가능함.
- 중개 연구의 연속성: 분리된 대식세포의 표현형 데이터는 전임상 연구에서 바이오마커 발견 및 기능적 검증에 유용한 정보를 제공할 수 있음.
- 리스크 조정 결정: 면역 조절 화합물이 대식세포 분극화에 미치는 영향에 대한 객관적인 평가를 가능하게 함.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 표적 검증부터 전임상 평가에 이르는 발견 연속체 내에 적합하며, 신장 질환 모델에서 리드 최적화 및 작용 기전 연구에 정보를 제공하는 면역학적 판독값을 제공합니다.
- 발견 생물학: 표현형 정량화를 통해 신장 손상 시 대식세포가 주도하는 경로에 대한 가설 검증을 촉진합니다.
- 스크리닝: 어세이 검증 및 화합물 스크리닝 캠페인에 적합한 재현 가능하고 정량적인 대식세포 데이터를 제공합니다.
- 분석: 그룹 간 비교 분석을 가능하게 하는 다중 파라미터 유세포 분석 판독값(M1의 경우 CD45+/CD68+/CD86+; M2의 경우 CD45+/CD68+/CD163+)을 제공합니다.
- 중개 연구: 대식세포 표현형 분석을 질환 관련 시스템 내의 하위 기능 어세이 및 유전자 발현 프로파일링과 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 신장 질환 모델 및 치료 영역에 적용 가능한 표준화된 면역 표현형 분석 워크플로우를 수립합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 정밀한 표현형 구분을 가능하게 하여 대식세포 매개 신장 손상의 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 핵심 유세포 분석 시설과 호환되는 표준화되고 변동성이 낮은 대식세포 분리 및 염색 방법을 제공합니다.
- 전략적 가치: 타겟 조절을 대식세포 분극화의 측정 가능한 변화와 연결함으로써 go/no-go 결정 능력을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 전임상 모델에서의 대식세포 표현형 조절을 기반으로 면역 조절 후보 물질의 위험 조정 우선순위 결정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 유세포 분석 보정(compensation), 게이팅 전략 및 대식세포 마커 검증에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 콜라게나제(collagenase) 소화 장비 및 멸균 세포 처리 인프라의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 재현 가능한 M1/M2 정량을 위해 여러 실험 사이트 간의 항체 패널 및 형광 대조군 표준화가 필수적입니다.
- 다른 조직에 적용할 경우 해리 효소 및 마커 패널의 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 더 광범위한 마우스 라이브러리에 비해 쥐(rat) 특이적 대식세포 마커(CD86, CD163)의 가용성이 제한적입니다.
