Name: 흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 배우세요 흑색질 도파민 뉴런의 수상돌기에서 세포 내 패치 클램프 기법을 활용한 이온 채널 기능 연구 방법. 이 기술은 신경생물학 연구에 필수적인 아세틸콜린 활성화 양이온 전류를 특성화하여 뉴런 신호 전달 메커니즘을 심층 분석합니다.

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나는 공 초점 현미경, 두 번째 Axopatch 200B 앰프의 선물 박사 자크 정해지다은 GIGA-영상과 조언에 대한 그의 지속적인 지원을위한 박사 빈센트 Seutin, 크리스 Gillissen과 우수한 기술 지원 로랑 Massotte, 박사 진 Defourny와 산드라 Ormenese 감사합니다 비판적 원고를 읽기 위해 공 초점 현미경 및 Imaris 소프트웨어 및 박사 스티븐 프리먼 공유를위한 플랫폼입니다. 이 작품은 벨기에 FRS에서 보조금에 의해 지원되었다 - FNRS (U.N002.13 및 T.N0015.13)와 벨기에 대학 재단의 지원 (Publié AVEC 르 콩쿠르 드 라 파운데이션 부문 Universitaire 드 벨기에 (프랑스어))를 발표했다.

저자는 그가 더 경쟁 재정적 이익을 가지고 있지 함을 선언합니다.

이 보고서는 듀얼 somatodendritic 전체 셀 녹음 및 지방 수상 기록을 구현하기위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 그것은 각각 시냅스 후 전위의 시간 경과에 이온 채널 (즉, I 높이)의 영향을 결정하고 흑색질 DA 뉴런의 somatodendritic 도메인 따라 이온 채널 (I 높이)의 분포를 매핑하는데 유용하다. 그 결과 전기 생리 측정은 세포 형태를 복구하기 위해 특별 조직 화학을 게시 결합된다. 절차는 흑색질에있는 DA 신경을 조사하기 위해 사용되었지만, 인접 흑색질 GABA 뉴런, 복측 피개 영역 DA 신경이나 중뇌 신경 대해 일반화 될 수있다. 모든 단계가 중요 수정없이 흑색질 신경 세포의 수상 돌기에 표현 된 다른 이온 채널을 검사 따라 할 수있다. 사후 시각화 축삭 베어링과 신경 세포에 특히 관련입니다이러한 흑색질 신경 세포 25, 26, 해마 oriens-alveus의의 interneurons 21 일부 CA1 피라미드 뉴런 (67) 등의 수상 돌기. 흥미롭게도,이 기능을 공유하는 신경 세포는 일반적으로 67 생각했던 것보다 더 일반적인 것 같다. 형태 학적 분석은 또한 전극과 축삭의 정확한 위치를 알 수있다. 후자의 면역 검출 68,69을 이용 축삭 초기 세그먼트 (전압 - 게이트 나 + 채널 또는 Ankyrin G)에서 발현 된 단백질의 라벨에 의해 최적화 될 수있다. 수지상 녹음 이후의 연결 라벨과 수집 된 데이터의 신뢰성은 변함없이 조각의 품질에 따라 달라집니다. 최대 노력이 필요하므로 조직 내 세포의 생존을 유지하기 위해 적용된다. 이는 슬라이스의 제조 건강한 동물 걸쳐 고품질 도구 및 시약 조직 빙냉 온도 충분한 산소 부드러운 핸들링 달성. 안정된 기록 조건 건강한 신경 세포의 선택에 의존한다. 전체 세포 모드에서, 직렬 저항은 처음에는 가능한 한 낮게하고, 실험 전반에 걸쳐 일정하게 유지한다. 녹음의 안정성은 드리프트과 진동없는 높은 품질의 조종에 더 의존한다. 피펫 홀더와의 연결을 확인하고 headstage하는 미세 조작기 케이블 슬랙 것을 제어하는 ​​온도 스테이지 이동의 급격한 변화를 방지하여 머니퓰레이터의기구에 의하면 이러한 교란은 피펫 안정성을 최적화함으로써 감소 될 수있다. 이중 기록 들어 메틸 설페이트 13,15,21는 세포 내 용액에 포함되었지만, 글루코 9,14,25 대안으로 사용될 수있다. 그러나, 주요 음이온 (70, 71) 전위 막의 일부 전압 의존 전류 (72)를 변경할 수있다. 세포 내 용액은 ATP, GTP와 physiolo을 유지하기 크레아틴 인산 보충 할 수있다신경 학적 기능을합니다. 인스턴스가 압력 응용 프로그램을 배치 할뿐만 아니라, 피펫 용액에 형광 염료를 추가 (예를 들어, 알렉사 594 또는 Sulforhodamine 101 41)가 도움이 될 수있는 체세포 기록하는 동안 수상 돌기를 시각화 (참조 그림 7. 41) 또는 전기 자극을 피펫. 세포 부착 녹음 용 피펫 솔루션은 대형 I의 시간을 기록하는 높은 K + 농도와 더 나 +가 포함되어 있습니다. 주목할 나 + / K + 농도 비는 전류 진폭 (10), 전류 (11)의 반전 전위 I의 H (73)의 게이트에 영향을 미친다. 또한, 나는 시간은 외부 아웃 (10)를 사용하여 기록 할 수 있습니다. 그러나이 기록 구성에서, 채널에 근접하여 세포 내 환경을 교란 할 수있다. 따라서, I의 전압 - 의존적 활성화의 차이 &lt;비교 전류가 세포 부착 된 패치 및 외부 아웃 (10)를 사용하여 얻은 경우 서브&gt; 시간이 관찰된다. 뉴런의 붓기는 때때로 패치 클램프 녹음 중에 발생하고, 종종 솔루션의 구성에 솔루션을 39 또는 오류 인트라와 세포 사이의 물 품질이 낮은 강한 불균형 삼투압이나 pH를 같이 별개의 원인으로 발생한다. 전기 생리 레코딩의 품질 회수 뉴런의 형태의 품질에 대한 직접 입사있다. 세포 내 환경 (14)의 희석을 최소화하기 위해 세포 부착 녹음 후 - (참고 문헌에서 6,11로, 10 MΩ. 6) 및 하나의 체세포 녹음에 대한 높은 저항 체세포 피펫 듀얼 레코딩에 사용됩니다. 셀에 연결된 기록 다음 전체 세포 체세포 기록 따라서 짧은 (&lt;10 분)로 유지된다. 체세포와 수지상 모두 피펫에서 외부 아웃 패치는 C의 적절한 폐쇄에 필수적이다엘 멤브레인 및 세포 형태의 이후의 복구. 세포의 구조뿐만 아니라, 신경 화학적 콘텐츠 기록 뉴런 59,74 대해 결정될 수있다. 예를 들어, 세포 내 단백질 티로신 수산화 효소는 DA 신경 (13)의 명확한 식별 immunolabeled 수있다. DA 신경 주로 SN에 집중되어 것은 SN 존재 훨씬 낮은 밀도, compacta을 갈 거예요 그들이 GABA 뉴런 (75)의 높은 수와 혼합되어 reticulata을 갈 거예요. DA 신경 세포의 세포체는 GABA 뉴런보다 종종 더 큰 반면, IR-videomicroscopy 이러한 세포의 시각적 식별 불확실 부분적 유리체의 compacta의 불투명도에 의해 방해된다. 이러한 제한을 피하기 위해, DA 신경의 예비 선택은 뉴런 (DA 신경 대한 TH 65 DAT, GAD 특정 인구 형광 마커를 발현하는 형질 전환 마우스를 이용하여 용이하게 할 수있다GABA 신경 세포) 및 표면 형광 조명. 대안 적으로, 형광 염료가 덴 드라이트의 시각화를 용이하게하기 위해 체세포 전극 용액에 포함될 수있다. 형광 세포의 증가 된 해상도는 Nipkow 회전 디스크 공 촛점 14,22,30 또는 IR-DGC (6)에 결합 된 두 광자 현미경 (7)에 의해하게된다. 여러 장점 DIC 비교 DGC 관련이있다. DIC 프리즘이 필요하지 첫째, 상기 IR-DGC 화상은 형광 이미지 49,52,53,76와 중첩 될 수있다. 둘째, DGC는 photostimulation와 77 optogenetics 결합 할 수 있습니다. 슬라이스 제제의 단점은 신경 세포의 무결성을 보존한다. DA 신경 세 평면 공간 78,79 그들의 수지상 연장 따라서 수지상 실의 절단이 완전히 조각 (80)을 회피 할 수 없다. 슬라이스 방향의 선택 (관상 수평 파라) 시상 트레이드 오프입니다. 신경 분포 및 실험 설계의 기원은 슬라이스의 오른쪽 방향을 선택하기 위해 고려되어야한다. 직접 수지상 세포의 패치는 다른 구획 기능성 이온 채널의 분포를 매핑하는 데 사용되는 기술이다. 또한,이 기술은 채널 (20)의 기능성의 변화를 결정하도록 제공한다. 보완 이온 채널의 위치와 밀도는 광 및 전자 현미경 수준에서 면역 17,23을 이용하여 확인 될 수있다. 이 접근법은 또한 패치 피펫에 액세스 할 수없는 작은 구경 구조에서 채널 밀도를 결정할 수있는 가능성을 제공한다. 그러나 이들 채널은 패치 클램프 기술을 이용하여 기록 된 것과 비교하여 고유 한 기능 상태 (24) 또는 비활성화 될 수있다. 두 기술은 위치 및 속성의 전체 사진을 얻을하는 것이 필요하다특정 세포 영역 (17)의 이온 채널. 전압 감응 염료의 발전 전압 촬상 여러 위치 81에서 AP와 뉴런 EPSPS의 전파를 조사하는 데 사용되어왔다. 듀얼 패치 클램프 기록에 대한 대안으로서,이 방법은 심지어 패치 피펫에 액세스하지 않지만, 신호 평균화의 정확한 보정을 필요 얇은 돌기에 구현 될 수있다. SN 및 복부 피개 영역에서 DA 뉴런 널리 생리 및 병리 생리 학적 맥락에서 체세포 녹음을 통해 조사하는 동안, 자신의 수상 돌기의 기능적 특성은 두 조건에 크게 알려지지 않은 남아있다. 수상 돌기에서 패치 성공 13,25,26으로 여러 그룹에 의해 흑색질 도파민 신경 세포에 대한 구현이 미세 세포 내 구조 8 고르기 속성을 해부하는 선택의 방법을 유지하고있다. 수지상 기록은 더 opportu을 제공NITY는 효율성과 시냅스 전달의 소성 및 수지상 흥분 82,83의 가소성을 자세히 조사합니다.

신경 세포는 수상 돌기에 주로 시냅스 정보를받을 수 있습니다. 흥분성 및 활동 전위 (APS)를 출력 신호로 유발되는 통합 사이트로 세대의 사이트에서 확산 억제 시냅스 신호. 길에서 시냅스 전위는 수상 돌기의 구조와 수동 및 능동 막 특성 사이의 상호 작용 모두에 의해 영향을 받는다. 이러한 고도의 가변 파라미터의 조합은 1,2- 뉴런의 계산 능력을 넓힌다. 그러나, 수상 돌기의 직경이 작은 그러나 자신의 전기적 특성의 연구를 방해한다. 6, 7을 수상 돌기 - (3 μm의의 Ø 0.7) 패치 클램프 기술 (3)의 지속적인 개발은 지난 수십 년 동안 광학 4 조각 준비 5 방법의 정제는 매우 얇은에서 녹음을 사용할 수있다. 이러한 방법은 있었고, 여전히 대부분 다양한 O를 수상 돌기의 흥분을 검사하는 데 사용됩니다F 뉴런 (8). 직접 수상 기록은 기능적 특성 별개의 신경 세포 구획에서 이온 채널의 20 ~ 22의 분포 9-19과 차이점을 확인하는 것이 필수적이다. 이러한 데이터는 광학 및 전자 현미경 (23, 24)에 결합하여 면역 조직 화학 검출 이온 채널 분포의 필요한 보완. 듀얼 somatodendritic 녹음 상세한 패시브 케이블 모델, 활동 전위 9,13-15,21,22,25-27 뉴런의 somatodendritic 도메인 따라 시냅스 전위 13,16,18 확산의 전파를 탐색 수득 구현 된 28- (30)는 신경 세포 통합 (31)의 시간 분해능을 조사. 흑색질 (SN)는 이러한 이동의 제어, 보상 및 습관성 행동 부호화 여러 기능에 관여 중뇌에있는 영역이다. 특정에 의한 도파민의 감소SN에서 도파민 (DA) 신경 세포의 손실은 파킨슨 병 (32)을 앓고있는 환자에서 관찰 된 운동 장애와 관련된다. 도파민과 GABA 성 신경 세포 다음 흑색질 회로는 두 가지 종류의 세포로 구성되어있다. 흥미롭게도,이 신경 세포는 다른 신경 세포와 구별 몇 가지 특정 기능을 가지고 있습니다. DA 뉴런 및 일부 GABA 신경 세포의 큰 비율의 축삭은 돌기의 아버는 이종 (축삭 베어링 및 축삭-부족 수상 돌기) 25,26,33가 있음을 나타내는 수지상 사이트에서 유래. 소마로, 수상 돌기에서 시작하여 최종적으로 34 축삭하는 이러한 신경 세포의 형태는 정보 전달 동적 Cajal에 의해 방출 편광의 법을 따라하는 신경 세포의 전형적인 조직에 따라서 대조. DA 뉴런은 그 돌기 (35)로부터 도파민을 방출 붕괴 활성 36 NMDA 수용체 가소성 (37)를 생성하는 것으로 알려져있다. dissec이러한 현상의 기 그들이 시작하는 사이트에서 직접 녹음하지 않고 애매하다. 정확한 위치 및 이온 채널의 기능적 특성과 흑색질 신경 세포의 수지상 흥분과 정보 전달의 역할 사이의 관계에 대한 통찰력을 얻기 위해, 직접 수상 기록은 선택의 방법입니다. 이 보고서는 흑색질 신경 세포의 수상 돌기 및 대응하는 사후 biocytin 레이블에서 싱글 및 듀얼 패치 클램프 녹음을 얻을 수 있습니다 상세한 절차를 설명합니다. 체세포와 수지상 막 패치에 대한 기본 원칙은 매우 유사하다. 실질적으로하지만, 수지상 사이트에서 녹음 체세포 녹음에 비해 특정 최적화가 필요합니다. 성공적인 수상 기록은 슬라이스, 광학의 최적의 조절, 녹음의 패치 피펫과 안정성의 부드러운 접근 방식의 품질에 의존한다.

<table><tbody><tr><td>이중 증류수</td><td>Millipore</td><td>Super Q</td><td>저항률 >14 M&Omega; cm, 이상적인 18.2 M&Omega; 25&nbsp에서 cm; &데그; C, 필터링됨(0.22 &micro; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>마이크로 필터 캔들</td><td>Robu</td><td>Porosity 3, 6mm 또는 13mm 직경</td><td></td></tr><tr><td>진동 프로브가 있는 조직 슬라이서</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>절단 매개변수: 속도 0.07, 진폭 1.40</td></tr><tr><td>조직 슬라이서</td><td>Dosaka</td><td>DTK-1000</td><td>절단 매개변수: 속도 4, 주파수 7</td></tr><tr><td>면도날</td><td>Gilette</td><td>슈퍼 실버</td><td></td></tr><tr><td>해부 도구</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>예비 챔버</td><td></td><td></td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>PP 베커</td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0.22 &micro; m</td><td></td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 접착제&nbsp;</td><td>UHU</td> <td>"Sekunden Kleber"</td><td>액체 접착제</td></tr><tr><td>녹음 챔버&nbsp;</td><td>루이그 & Neumann</td><td>Slice 미니 챔버</td><td></td></tr><tr><td>수평 피펫 풀러</td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>2mm o.d./1mm i.d. 유리 모세혈관, 끝 파이어폴리싱, 세척 치</td></tr><tr><td>과 왁</td>스 <td>Colt&egrave; ne/Whaledent</td><td></td><td>교정 트레이 왁스 스트립</td></tr><tr><td>백금 그리드</td><td></td><td></td><td>는 기록 챔버에 슬라이스를 고정하고 백금 디스크로 맞춤 제작</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>은 피펫 팁을 화염 연마하기 위해</td></tr> 황<tr><td>산 메틸</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>분자 프로브</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>를 사용합니다.압력계</td><td>GREISINGER 전자</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt 그라디언트 대비</td><td>Luigs & 노이만</td><td></td><td></td></tr><tr><td>매니퓰레이터</td><td>Luigs & Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>프레임 그래버</td><td>이미징 소스</td><td>DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>콘덴서</td><td>Zeiss</td><td></td><td>오일로 작업하는 높은 개구 콘덴서</td></tr><tr><td>대물렌즈</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>63X 배율, 장거리, 높은 개구수 1.0 침수 객관적인</td></tr><tr><td>포폴드 체인저</td><td>Luigs & 카메라와 현미경 사이의 노이만</td><td></td><td></td></tr><tr><td>흑백 비디오 모니터</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>16인치, 850 TV 라인, 아날로그</td></tr><tr><td>샘플 병, 호박색 유리, 캡 포함</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>셋업에서 조직학실로 슬라이스 전송</td></tr><tr><td>The Axon Guide</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Book</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>전기생리학적 데이터 분석</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그</td>마 <td>441244</td><td>사용 전 안전 데이터 시트 및 위험 물질 지침(EU) 참조</td></tr><tr>고정 <td>슬라이스 염색을 위한</td><td>Well cell culture plate</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>사용</td></tr> <tr><td>전 안전 데이터 시트 및 위험 물질 지침(EU) 참조마우스 anti-TH monoclonal primary</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>작업 농도: 1/1,000</td></tr><tr><td>염소 anti-mouse 2차 항체 - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>작업 농도: 1/500</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade</td><td>Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Avidin DCS</td><td>Vector Lab</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td> <td>plugin for ImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>바이오사이틴 충전 뉴런 재구성</td></tr><tr><td>뉴로맨틱</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td> <td>바이오사이틴으로 채워진 뉴런의 재구성</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>전기생리학적 데이터 분석</td></tr></tbody></table>

흑색질 도파민 뉴런의 somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

도파민 뉴런의 수상 돌기 수신 및 시냅스 입력, 지원 활동 전위 역 전파 및 신경 전달 물질 방출을 전달. 이러한 기본적인 기능을 이해하는 것은 이러한 신경 세포의 정보 전달을 밝혀됩니다. 수지상 패치 클램프 기록을 직접 돌기 및 기저 전압 관문 이온 채널의 전기적 특성을 검사 할 수있는 가능성을 제공한다. 그러나 이러한 미세 구조 때문에 작은 직경의 패치 피펫에 쉽게 액세스 할 수 없습니다. 이 보고서는 급성 조각에서 도파민 뉴런의 수상 돌기에서 안정적인 기록을 수집하는 단계별 절차를 설명합니다. 전기 생리 측정은 세포 형태의 사후 복구와 결합된다. 성공적인 실험은 조각, 솔루션과 피펫, 기록 된 구조와 접촉하는 광학 및 피펫의 안정성의 적절한 조정의 개선 준비에 의존하고 있습니다. 솜의 기본 원칙ATIC 패치 클램프 녹음 수상 돌기에 있지만 피펫의 완만 한 접근 방식으로 적용됩니다. 이러한 다양한 기술은 수상 돌기의 흥분 특성에 관한 다양한 질문을 해결하기 위해 구현 될 수있다.

상술 프로토콜 수지상 패치 클램프 기록을 이용하여 데이터의 수집을 용이하게하고자한다. 사후 조직 화학 결합이 기술은, 원산지 또는 수상 돌기로 확산 많은 전기 신호의 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 패치 피펫과 수상 돌기에 직접 액세스는 어렵지만 몇 가지 방법 론적 측면에 특별한주의는 녹음의 성공률을 향상시킬 수 있습니다. 충분히 안정 체세포 기록에 경험 실험자는 시도의 대부분에 높은 저항 (GΩ) 물개와 완벽한 실험을 얻을 것으로 예상 할 수있다. 두 고품질 수상 녹화 한 해부에 따라 회수 할 수있다. 건강 인 somata과 수상 돌기를 포함하는 높은 품질의 뇌 조각의 가용성은 이러한 미세 구조 (그림 1)에 액세스하기위한 전제 조건입니다. criteri이러한 신경 세포를 선택하기위한 모든 셀 최적 조정 광학 관찰 낮은 콘트라스트 및 소마 돌기 위에 매끄럽고 균일 한 표면이다 (도 1a 및도 1b). 선택 뉴런이 너무 강하게 일반적으로 대조 불안정 기록 (그림 1C 및 1C)에 연결됩니다. 따라서 이러한 뉴런 피해야한다. 다른 신경 세포에 비해, 흑색질 DA 뉴런 특정 형태 및 전기 생리 특성을 표시합니다. 일반적으로 하나의 체세포 피펫으로 평가 이러한 기능은 듀얼 체세포 (그림 2)와 somatodendritic 녹음 (그림 3)에서 관찰 할 수있다. 긴 hyperpolarizing 현재 주사 (도 2B와 5D) &#39;처지&#39;라는 막 잠재적 인 정류를 유도한다. 식별 된 엑손은 수지상 사이트에서 대부분의 경우, 발신이러한 신경 세포의 수지상 구획 이기종 것을 나타내는, 보완 기준 13,25,26를 사용하여 (그림 3A - 3B). 13,25,26 - 그 결과, AP는 처음 관찰되는 구획 축삭은 (3D도 3c)를 나온다 된 구획에 대응한다. 축삭은 일반적으로 64 슬라이스 동안 축삭의 절단에 의한 축삭 여과포로 종료되지만,이 구조를 체계적으로 감지되지 않습니다. 연속 I (H)의 활성화에 흑색질 DA 뉴런에서 관찰되는 뚜렷한 저하는 HCN 서브 유닛의 높은 발현을 의미한다. 시냅스 신호의 적분에 I (H)의 영향을 결정하기 위해 연접 형 전류 (EPSC) 파형 생성 somatodendritic 듀얼 레코딩 55 (&lt;동안 수지상 기록 전극을 통해 주입 하였다강한&gt; 그림 4). 이러한 시뮬레이션 EPSCs의 반응 속도는 실제 자발적 EPSCs의 상승 및 감쇠 시간 상수에 근거했다. 그 결과 aEPSP는 체세포 전극으로 기록되었다. 는 I의 시간 차단제 ZD 7288의 목욕 응용 프로그램은 시냅스 신호 (그림 4B)의 시간 코스 I (H)의 기여도를 나타내는 aEPSP의 지속 시간을 증가했다. ZD 7288은 확인도 막 잠재적 인 정류를 폐지하는 I (H)의 활성화 (그림 4C)에서 처짐 결과. EPSPS 시뮬레이션으로 얻은 결과는 전기적 유발 EPSPS 65을 이용하여 실험에 상관 될 수도있다. DA 신경 세포의 somatodendritic 영역에서 채널의 정확한 분포를 매핑하려면, 세포 부착 녹음 (그림 5)를 구현 하였다. 높은 저항 씰 (&gt;&gt; 1 GΩ)는 (그림 5B 세포 부착 녹음을 위해 절대적으로 필요하다 </강한&gt;). DA 뉴런의 수상 돌기, 나는 시간이 긴 hyperpolarizing 전압 단계를 서서히 활성화되고 이전에 (66)와 같이 현재의 정상 상태는, MS (그림 5C)의 수백 후에 달성된다. 이 관찰은 DA 뉴런의 수상 돌기로 표현 HCN 채널 피라미드 뉴런 또는 다른 세포 유형 10,16,66에서와 비교하여 다른 서브 유닛을 가지고 있음을 나타냅니다. 채널의 분배가 수지상 구획 비균질하고 하듯 수지상 실 자체 이질적이기 때문에, 덴 드라이트 (엑손 베어링 또는 nonaxon 함유 수지 상정)의 신원은 공 촛점 이미지로 IR-DGC 화상을 비교함으로써 밝혀 biocytin 염색법 (도 3A와 B) 후. 세포 형태의 복구는 모두 듀얼 somatodendritic 녹음 및 이후의 체세포 전체 셀 녹음을 통해 세포 부착 된 레코딩을위한 필요가있다. 적외선 Videomicroscopy를 사용하여 흑색질 도파민 뉴런의 소마와 근위 Dendrites에서 시각화 그림 1. 소마와 인접 수상 돌기 모두 체세포와 수지상 피펫을 보여주는 흑색질 DA 신경 세포의 (A) IR-DGC 이미지입니다. 이중 somatodendritic 기록이 성공적이 건강한 신경 세포에서 수행 하였다. 모든 세포의 somatodendritic 도메인에 대한 낮은 콘트라스트와 매끄러운 표면을 관찰한다. (B) 건강한 DA 신경 세포의 또 다른 예입니다. (C) DA 신경 세포를 거친 고르지 않은 표면과 강한 대조. 이중 기록이 수득되었지만, 인해 두 피펫의 접속 저항의 점진적인 증가 (~ 15 분) 안정성이 최적이며, 기록 시간은 짧았다. (D) 도시하는 DA 신경 세포의 두 번째 예 강한 대조 소마와 인접 수상 돌기. 이 경우, 상기 접속 저항의 강한 증가는 전체 셀 모드에서 브레이크 직후 관찰되었다. 음의 압력에 의해 액세스 저항을 감소하려는 시도가 실패했습니다. 패널 C와 D의 뉴런은 슬라이스 과정에서 손상되었을 수 및 실험 피해야한다. (E) 기록의 시작 부분에 건강한 DA 신경 세포에서 동시 이중 체세포 기록. (F)와 패널 E에서와 같은 신경 세포 ~ 17 분 후 부어 세포체. 대비의 전체 부재를 참고 소마의 공 같은 모양과 건강한 신경 세포에서 명확하지 않은 큰 핵의 존재는. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> 그림 2. </strong&gt; 동시 두 번 체세포 DA 신경 세포에서 녹음. DA 신경 세포에서 두 번 체세포 녹화 중 (A) IR-DGC 이미지입니다. (B) Hyperpolarizing 1의 긴 현재 주사 탈분극 (-160 pA에 80을, 아빠 (80)를 증가) 및 해당 전압 변화는 두 패치 피펫과 동시에 기록했다. 탈분극 전류 펄스 동안의 긴 hyperpolarizing 현재 단계와 AP 후 후 과분극 대형와 전압 추적의 처짐의 존재를합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> 그림 3. DA 신경 세포에서 이중 S omatodendritic 기록. (A)는 DA 신경 세포의 IR-DGC 이미지입니다. 수지상 및 소마 간의 거리는틱 피펫은 플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC)에 결합 아비딘으로 표시 패널 (A)에서 신경 세포의 29 μm의. (B) 공 촛점 z를 프로젝션 이미지입니다. 신경 세포는 녹화 중에 biocytin으로 가득 차 있었다. 축삭은 화살표로 표시된 바와 같이 소마 가까운 기단 수지상 유래. 소마 (블랙 전압 트레이스) 및 수지상 기록 패널 A.의 AP에서 신경 세포로부터 (C)의 동시 듀얼 somatodendritic 전체 셀 전압 녹화 (적색 전압 블랙 현재 추적)과 오른쪽 선택적으로 수지상 피펫 (; 체세포 (왼쪽 통해 하나의 긴 전류 주입 단계에 응답 흔적) 빨간색 현재 추적) (D) 체세포와 수지상 AP 확장 된 시간 스케일에 표시.. 체세포 또는 수지상 전류 주입 중 하나로, 체세포 AP (블랙) 수지상 AP (적색) 앞에. 이 신경 세포에서의 AP 사이의 지연은 120 μs의 각각 체세포와 수지상 전류 주입, 210 μS했다. 지연액세스 포인트의 상승 단계에서 AP 반 최대 진폭을 측정 하였다. AP는 축삭 이전의 관찰 25, 26을 확인, 나온다되는 가까운 구획에 처음 관찰된다. 이 경우, 돌기의 기록은 엑손 - 결핍 수지상 만들어진다. 축삭 베어링 수지상 참조에에서 기록의 예. 13 (자신도. 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> DA 뉴런의 Somatodendritic 축을 따라 인공 EPSPS 그림 4. 전파. (A)는 DA 신경 세포의 IR-DGC 이미지입니다. 수지상 체세포 피펫 사이의 거리는 45 μm의 것이다. 두 패치 피펫 전체 셀 전류 클램프 기록 모드에있다. (B) 현전류 클램프 수지상 피펫 기록 인공 EPSP (상부). 현재는 EPSC 같은 파형의 주입에 의해 얻어진다 (; τ 붕괴 = 3 MS] τ 상승 = 0.6 밀리 진폭 = 100 씩) 수지상 기록 피펫 (55)를 통해. (적색 추적 30 μM) 하단에 제어 조건 (검은 색)의 소마 기록 aEPSPs을 전파하고 I의 시간 차단제 ZD7288의 목욕 신청 후. 각 전압 추적 40 단일 스윕의 평균입니다. 30 μM의 ZD 7288의 도포 후 (제어 상태 (흑)의 소마에서 녹화 흔적은 전압. (C)를 EPSPS 시간 경과에 I (H)의 기여를 나타내는 ZD7288의 존재 EPSP 기간에서 큰 증가를 관찰 긴 (30 pA에 대한 응답에서 빨간색) 1 초) hyperpolarizing 현재 단계. 나는 &lt;의 막힘 후 막 잠재적 인 정류 (처짐)의 부재를 참고서브&gt; 시간. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> DA 신경 세포의 Dendrites에서의 I h를 그림 5. 존재. 근위 수상 돌기에 DA 신경 세포와 피펫의 (A) IR-DGC 이미지입니다. (B) 세포 부착 구성에서 5 MV 전압 명령 중 정전 용량과 누설 전류. 밀봉 저항이 예에서는 5 GΩ이었다 (C) Hyperpolarizing 전압 단계.; MV는 천천히 활성화 I h를 유도 0의 막 전위 (90 MV 위). 현재 트레이스 반전 τ = 632 ms의 시간 상수를 제공 한 지수 함수를 장착 하였다. (D) 전압하나의 하이퍼로 전체 셀 기록 소마 (패널 A)의 반응과 탈분극 전류 펄스 (120 pA에에 -160, 40 아빠 증가). 체세포 전체 셀 기록이 세포 부착 후에 기록 하였다. 때문에 세포 부착 녹음 중에 자연 발화를 억제하는 TTX 및 카드뮴 2+의 세포 외 응용 프로그램에 액세스 포인트의 부재를합니다. 이 전압 - 게이트 나 + 및 CA 2+ 전류 차단기 동작 전류를 억제하도록 하였다. 패널 A - D는 같은 신경 세포에서있는 다른 DA 신경 세포와 수지상 피펫 (E) IR-DIC 이미지 -120 MV에서 50 밀리의 프리 펄스에서 0 MV에 테스트 펄스에 의해 활성화 (F) 전압에 의존하는 전류.. 패널 E. 지주의 신경 세포의 근위 수상 돌기 잠재적 -80 MV에서 절제 외부 아웃 패치입니다. 현재의 시간에 따른 불 활성화를합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 버전입니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 물질 </td><td> g / 몰 </td><td> 집중 </td><td> 1 L에 대한 </td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 58.443 </td><td> 125 밀리미터 </td><td> 7.305 g </td></tr><tr><td> 의 NaHCO3 </td><td> 84.007 </td><td> 25 mM의 </td><td> 2.100 g </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 74.551 </td><td> 2.5 밀리미터 </td><td> 0.186 g </td></tr><tr><td> 의 NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1.25 밀리미터 </td><td> 0.172 g </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 198.17 </td><td> 25 mM의 </td><td> 4.95 g </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 </td><td> 1 M (솔루션) </td><td> 1 ㎜ </td><td> 1 mL의 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td><td> 1 M (솔루션) </td><td> 2 밀리미터 </td><td> 2 mL의 </td></tr><tr><td colspan="4"> 삼투압 ~ 310 mOsmol / L (최적의 범위: 314-325 mOsmol / L), pH는 7.4 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 인공 뇌척수액 (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 물질 </td><td> g / 몰 </td><td> 집중 </td><td> 1 L에 대한 </td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 58.443 </td><td> 87 mM의 </td><td> 5.084 g </td></tr><tr><td> 의 NaHCO3 </td><td> 84.007 </td><td> 25 mM의 </td><td> 2.1001 g </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 7.551 </td><td> 2.5 밀리미터 </td><td> 0.18637 g </td></tr><tr><td> 의 NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1.25 밀리미터 </td><td> 0.17248 g </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 </td><td> 1 M (솔루션) </td><td> 7 밀리미터 </td><td> 7 mL의 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 198.17 </td><td> 10 mM의 </td><td> 1.9817 g &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> 자당 </td><td> 342.29 </td><td> 75 mM의 </td><td> 25.672 g </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td><td> 1 M (솔루션) </td><td> 0.5 밀리미터 </td><td> 0.5 mL의 </td></tr><tr><td colspan="4"> 삼투압 ~ 326 mOsmol / L, pH는 7.4 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 자당 - ACSF는 조각을 준비한다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 물질 </td><td> g / 몰 </td><td> 집중 </td><td> 100 ㎖에 대한 </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150.2 </td><td> 120 밀리미터 </td><td> 1.8024 g </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 74.56 </td><td> 20 mM의 </td><td> 0.14912 g </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 </td><td> 1 M (솔루션) </td><td> 2 밀리미터 </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td> 나 2 ATP </td><td> (5)51.1 </td><td> 2 밀리미터 </td><td> 0.1102 g </td></tr><tr><td> 나 2 GTP </td><td> 523.2 </td><td> 0.5 밀리미터 </td><td> 0.02661 g </td></tr><tr><td> 나 2 -Phosphocreatine </td><td> 255.1 </td><td> 5 밀리미터 </td><td> 0.1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380.4 </td><td> 0.1 mM의 </td><td> 3.803 mg의 </td></tr><tr><td> 헤 페스 </td><td> 238.31 </td><td> 10 mM의 </td><td> 0.23831 g </td></tr><tr><td> Biocytin </td><td> 1 ㎎ / ㎖ </td><td></td><td> 0.1 g </td></tr><tr><td colspan="4"> 삼투압 ~ 302 mOsmol / L, pH는 7.2로 조정 KOH </td></tr></tbody></table> 표 3 : 듀얼 레코딩을위한 세포 내 솔루션입니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 물질 </td><td> g / 몰 </td><td> 집중 </td><td> (100)mL의 </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 74.56 </td><td> 120 밀리미터 </td><td> 0.8947 g </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td><td> 1 M (솔루션) </td><td> 2 밀리미터 </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 </td><td> 1 M (솔루션) </td><td> 1 ㎜ </td><td> 100 μL </td></tr><tr><td> 헤 페스 </td><td> 238.31 </td><td> 10 mM의 </td><td> 0.23831 </td></tr><tr><td> TEA-CL </td><td> 165.7 </td><td> 20 mM의 </td><td> 0.3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94.11 </td><td> 5 밀리미터 </td><td> 0.04705 g </td></tr><tr><td> BaCl 2 </td><td> 244.26 </td><td> 1 ㎜ </td><td> 0.02443 g </td></tr><tr><td> 을 CDCl3 2 </td><td> 183.32 </td><td> 0.02 밀리미터 </td><td> 0.3666 mg의 </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 ㎜ </td><td> 200 nm의 </td><td> 20 μL </td></tr><tr><td colspan="4"> 삼투압 ~ 290 mOsmol / L, D-포도당 (참고 16.)로 조정; pH가 7.4 </td></tr></tbody></table> 표 4 : 세포 부착 된 레코딩을위한 전극 솔루션입니다.

Subcellular patch-clamp recordings는 수상돌기의 기능적 특성을 조사할 수 있는 가능성을 제공합니다. 그러나 이러한 미세한 구조는 직경이 작기 때문에 쉽게 접근할 수 없습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 in vitro에서 도파민 뉴런의 수상돌기로부터 안정적이고 신뢰할 수 있는 기록 수집을 용이하게 하는 것을 목표로 합니다.

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

이 방법은 개별 전압 개폐성 이온 채널이 특정 뉴런의 기능에 어떻게 기여하는지와 같은 신경생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 뉴런의 세포 내 수준에서 이온 채널의 기능을 매핑할 수 있다는 점입니다. SiliGuard 층으로 바닥을 덮은 9 centimeter 페트리 접시에 뇌를 놓는 것으로 이 절차를 시작하십시오.다음으로, 뇌를 얼음처럼 차가운 sucrose-ACSF로 둘러쌉니다. 관상 단면(coronal slices)을 준비하려면, 소뇌와 뇌의 전방(rostral) 부위를 제거하기 위해 두 번 절단합니다. 그 후 시편 트레이에 cyanoacrylate 접착제를 바르고, 뇌 블록의 전방 부위가 절단 스테이지를 향하도록 트레이에 고정합니다.그 후, 뇌 위에 sucrose-ACSF를 몇 방울 떨어뜨리고 트레이를 절단 챔버 속으로 천천히 잠기게 합니다. 이어서, 수평면을 기준으로 면도날의 각도를 15도로 조정합니다. 흑질(substantia nigra)에 도달하기 전까지 코-미추 방향(rostral-caudal direction)으로 약 500 micrometers 두께의 관상면 뇌 절편을 절단합니다.그런 다음 두께를 조절하여 관심 영역을 포함하는 300 micrometer 두께의 절편을 자릅니다. 주사기에 연결된 매우 가는 정밀 바늘을 면도날 가장자리에 평행하게 배치하여 조직 블록에서 절편을 분리합니다. 그 후, 절편을 34 °C의 보존 챔버로 옮겨 1시간 동안 둡니다.이 과정에서는 뇌 절편을 기록 챔버로 옮깁니다. 백금 링을 사용하여 기록 챔버 바닥에 절편을 고정하고, 절편의 표면이 매끄럽고 균일하며 품질이 양호한지 확인합니다. 그다음, 동일한 평면상에서 긴 거리로 뻗어 있는 수지상돌기를 가진 뉴런을 선택하고, 해당 수지상돌기가 명확하게 정의된 세포체까지 이어지는지 확인합니다.다음으로, 패치 피펫을 전극 용액으로 채웁니다. 세포 부착 모드(cell-attached mode)로 수지상돌기를 패치하려면, 수지상돌기의 일부를 찾아 초점을 맞춥니다. 피펫에 양압을 가하고, 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 내립니다.그 다음 피펫을 막에 가까이 배치하고 압력을 조절하여 작은 홈(dimple)을 만듭니다. 이어서 피펫 팁의 압력을 해제하면서 피펫 저항을 제어하며 수상돌기를 패치합니다. 세포 부착 기록(cell-attached recordings)의 경우, 씰 저항(seal resistance)을 1 GΩ보다 크게, 가급적 3~10 GΩ 사이로 확보하십시오.그 후, 수지상 돌기의 변형을 방지하기 위해 피펫을 막에서 수 µm 정도 뒤로 뺍니다. 여기서 관찰되는 활동 전류는 흑질 뉴런의 자발적 활동 전위를 나타냅니다. 활동 전류를 억제하려면 ACSF에 칼슘 및 나트륨 채널 차단제를 첨가하십시오.그다음, 과분극 활성 양이온 전류를 유도하기 위해 0 mV의 유지 전위에서 90 mV의 전압 단계를 가합니다. 기록이 끝나면 패치를 파열시켜 전세포 모드(whole cell mode)로 전환합니다. 이후 수지상 돌기 피펫을 신경세포막에서 천천히 그리고 조심스럽게 제거하여 외부-외부 패치(outside-out patch)를 얻습니다.전세포 모드(whole-cell mode)로 해당 세포체(soma)에서 기록하려면, 수지상 돌기와 연결된 해당 세포체를 찾습니다. 칼륨 기반의 세포 내 용액이 채워진 5~10 MΩ 저항의 피펫을 세포체까지 내립니다. 그런 다음 피펫 팁에 짧게 음압을 가해 세포막을 파열시켜 전세포 모드를 구현합니다.긴 과분극 및 탈분극 전류 단계를 적용하여 전류-클램프 모드에서 뉴런의 정체성을 확인하고, 피펫의 biocytin이 수상돌기를 따라 확산되도록 합니다. 10분 후, 피펫을 회수하여 outside-out 패치를 얻습니다. 피펫이 슬라이스 위에 위치하면 짧은 측면 상향 이동을 반복하여 세포막이 적절하게 닫히도록 유도한 뒤, 기록 챔버에서 완전히 꺼냅니다.biocytin과 기록된 뉴런이 평형을 이룰 수 있도록 표준 ACSF가 담긴 기록 챔버에 슬라이스를 15분 더 유지합니다. 그 후 슬라이스를 조직학적 분석을 위해 표준 ACSF가 들어 있는 25 milliliter 갈색 유리병으로 조심스럽게 옮깁니다. 이 과정에서 에피형광 현미경(epiflourescence)을 사용하여 슬라이스 내 형광 표지된 뉴런의 대략적인 위치를 확인합니다.10배율 대물렌즈를 사용하여 뉴런의 수지상 돌기 구조를 간략히 관찰하고, 축삭과 축삭 팽대부(axonal bleb)의 위치를 확인합니다. 그다음 공초점 현미경으로 전환하여 488 nm 레이저 다이오드를 선택해 표지된 뉴런을 여기시킵니다. Z축 방향으로 축삭과 수지상 돌기의 연장을 추적하며 연속 이미지를 기록하여 세포 전체의 Z-스택(Z stack)을 얻습니다.Z축의 해상도를 조절하고, 저배율 및 고배율에서 세포의 공초점 이미지를 수집합니다. 마지막으로 영상 소프트웨어를 사용하여 뉴런의 이미지 파일을 엽니다. Z 투영 이미지와 IR-DGC 이미지를 육안으로 비교하여 전기생리학적 기록 중 패치 피펫의 정확한 위치를 찾습니다.여기에 도파민 뉴런과 근위 수지상 돌기에 놓인 피펫의 IR-DGC 이미지가 제시되어 있습니다. 전류 기록은 5 GΩ의 밀폐 저항을 가진 cell-attached 구성에서 5 mV 전압 명령에 반응하는 EN 누설 전류의 용량을 보여줍니다. 0 mV의 막 전위에서 가해진 과분극 전압 단계는 서서히 활성화되는 과분극 활성 양이온 전류를 유도하였습니다.현재의 트레이스를 반전시키고 단일 지수 함수로 피팅한 결과, 시간 상수는 632 밀리초였습니다. 여기 세포 부착 기록 중 활동 전위를 제거하기 위해 전압 개폐성 나트륨 및 칼슘 전류 차단제를 처리한 상태에서, 세포체에서 기록한 전체 세포의 1초 과분극 및 탈분극 전류 펄스에 대한 전압 반응이 제시되어 있습니다. 숙달되면, 적절하게 수행할 경우 이 기술은 하루 만에 완료될 수 있습니다.이 절차를 수행할 때 건강한 조직을 확보하고 안정적인 기록 조건을 유지하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 기록된 뉴런의 정체와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 면역조직화학법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 발전은 신경생리학 분야의 연구자들이 흥분성 세포 내 전압 개폐성 이온 통로의 특성과 역할 및 기능을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 수상돌기 내 전압 개폐성 이온 채널을 통해 흐르는 전류의 분포를 기록하고 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는, 우리는 쥐의 뇌 조각의 전체 세포 구성에 기록된 dopaminergic 신경 세포로 전도성을 적용하는 방법을 보여줍니다. 이 기법은 동적 클램프라고합니다.

동적 클램프 기법을 사용 랫 Midbrain Dopaminergic 뉴런에서 NMDA 수용체의 전도의 응용

amperometric 기술은 자연 도파민의 산화에 의해 생성 된 산화 전류를 검출하여 하나의 세포에서 도파민 릴리스를 측정합니다. 동시 전압 클램프 및 amperometry 방법론은 도파민 수송과 도파민의 역방향 전송에서이 활동의​​ 규제 역할의 전체 '활동'사이의 기계론의 관계를 알 수있다.

동시 전압 클램프 및 Amperometry과 도파민 릴리스의 단일 세포 측정

이 비디오는 수지상 멤브레인 표면에서 패치 클램프 기록 기술을 보여줍니다. 이는 도파민 뉴런에서 수상돌기와 그 아래에 있는 전위의존성 이온 채널의 전기적 특성을 직접 조사하는 데 도움이 됩니다.

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

이 비디오는 뉴런 발화 패턴을 분석하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 척수 절편의 SG(substantia gelatinosa) 뉴런에서 전기생리학적 기록을 수행하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 척수의 SG 뉴런의 자극에 대한 신경 반응을 연구할 수 있습니다.

척수 절편의 실질체 젤라티노사 뉴런에서 기록하는 전체 세포 패치 클램프

이 비디오는 패치 클램프 기술을 사용하여 유변기저와 막 전위를 측정하고 증분 전류 주입에 대한 뉴런의 반응을 분석하여 등쪽 신경절의 감각 뉴런 흥분성을 검사하는 방법을 보여줍니다.

온전한 쥐 등쪽 뿌리 신경절에 대한 전체 세포 패치 클램프 기록

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

이 프로토콜은 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하기위한 기본 절차 단계를 설명합니다. 이 기술은 신경 세포의 전기적 동작의 연구를 허용하고, 뇌 조각에서 수행하는 경우, 여전히 상대적으로 잘 보존 된 뇌 회로에 통합되어 신경 세포에서 다양한 신경 기능의 평가를 할 수 있습니다.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

이 원고는 패치 클램프 기록을 위해 온전한 등쪽 뿌리 신경절을 준비하는 방법을 설명합니다. 이 제제는 뉴런과 위성 신경교세포의 미세환경을 유지하여 해리된 DRG 뉴런에서 볼 수 있는 표현형 및 기능적 변화를 방지합니다.

성인 쥐에서 본래 등쪽 뿌리 신경절에 패치 클램프 녹음

이 프로토콜은 평면 장착 준비에서 망막 신경 세포에 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음

이 프로토콜에는 중요 한 단계 및 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 하는 데 필요한 조치 설명 합니다. 이 기술은 패치 클램프 기록 특징 하나의 세포에서 유전자의 미리 결정 된 집합 식 프로 파일을 분석 하는 간단 하 고 효과적인 방법입니다.

패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응

여기에 제시된 방법은 내이의 전정 신경절 및 나선형 신경절 뉴런에서 해부, 해리, 배양 및 패치 클램프 기록에 대한 자세한 지침을 제공합니다.

Patch-Clamp 기록을 위해 신생아 설치류에서 전정 및 나선형 신경절 소마타를 분리 및 배양합니다.

배우세요 흑색질 도파민 뉴런의 수상돌기에서 세포 내 패치 클램프 기법을 활용한 이온 채널 기능 연구 방법. 이 기술은 신경생물학 연구에 필수적인 아세틸콜린 활성화 양이온 전류를 특성화하여 뉴런 신호 전달 메커니즘을 심층 분석합니다.

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

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