흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

이 방법은 개별 전위의존성 이온 채널이 특정 뉴런의 기능에 어떻게 기여하는지와 같은 신경생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이온 채널의 기능을 뉴런의 세포 내 수준에서 매핑할 수 있다는 것입니다. 9cm 페트리 접시에 뇌를 놓고 바닥을 SiliGuard 층으로 덮는 것으로 이 절차를 시작합니다.

다음으로, 얼음처럼 차가운 자당-ACSF로 뇌를 둘러쌉니다. 관상 동맥 절편을 준비하려면 소뇌와 뇌의 상부 부분을 제거하기 위해 두 번 자릅니다. 그런 다음 표본 트레이에 시아노아크릴레이트 접착제를 바르고 뇌 블록을 트레이에 붙여서 윗부분 부분이 슬라이스 단계를 향하도록 합니다.

그런 다음 뇌에 자당-ACSF 몇 방울을 바르고 트레이를 절단 챔버에 천천히 담그십시오. 그런 다음 수평면을 기준으로 15도 각도로 면도날을 조정합니다. 흑질(substantia nigra)에 도달하기 전에 코틀 코 방향으로 약 500마이크로미터의 관상 뇌 절편을 자릅니다.

그런 다음 두께를 조정하여 관심 영역이 포함된 300마이크로미터 슬라이스를 자릅니다. 면도날의 가장자리와 평행한 주사기에 부착된 매우 얇은 침투 바늘을 사용하여 조직 블록에서 조각을 분리합니다. 그런 다음 슬라이스를 섭씨 34도의 예비 챔버로 1시간 동안 옮깁니다.

이 절차에서는 뇌 절편을 기록실로 옮깁니다. 플래티넘 링으로 녹음 챔버 바닥에 슬라이스를 고정하고 슬라이스가 매끄럽고 균일한 표면의 좋은 품질인지 확인합니다. 그런 다음 같은 평면에서 장거리로 확장되는 수상돌기가 있는 뉴런을 선택하고, 관심 있는 수상돌기가 잘 정의된 소마까지 따라갈 수 있는지 확인합니다.

다음으로, 패치 피펫에 전극 용액을 채웁니다. 세포 부착 모드에서 수상돌기를 패치하려면 수상돌기의 일부를 식별하고 초점을 맞춥니다. 피펫에 양압을 가하고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 내립니다.

그런 다음 피펫을 멤브레인 가까이에 놓고 압력을 조정하여 작은 딤플을 만듭니다. 그런 다음 피펫 팁에 가해지는 압력을 해제하고 덴드라이트를 패치하면서 피펫 저항을 제어합니다. 셀 부착 기록의 경우 1기가옴보다 큰 밀봉 저항(기껏해야 3기가옴에서 10기가옴 사이)을 얻어 보십시오.

그 후, 피펫을 멤브레인에서 몇 마이크로미터 정도 후퇴시켜 수상돌림의 변형을 방지합니다. 여기에서 볼 수 있는 활동 흐름은 검둥이 뉴런의 자발적인 활동 전위를 나타냅니다. 작용 전류를 억제하려면 칼슘 및 나트륨 채널 차단제를 ACSF에 바르십시오.

그런 다음 0 밀리 볼트의 유지 전위에서 90 밀리 볼트의 전압 단계를 적용하여 초 분극 활성화 양이온 전류를 불러 일으킵니다. 기록이 끝나면 패치를 파열하여 전체 셀 모드를 얻습니다. 그 후, 신경세포막에서 수지상 피펫을 천천히 부드럽게 빼내어 바깥쪽 패치를 얻습니다.

전체 세포 모드에서 해당 소마에서 기록하려면 수상돌이의 해당 소마를 찾습니다. 5에서 10메가옴 사이의 저항을 가진 피펫을 칼륨 기반 세포 내 용액으로 세포체에 내립니다. 그런 다음 피펫 팁에 짧은 음압을 가하여 멤브레인을 파열시켜 전체 세포 모드를 달성합니다.

긴 하이퍼 및 탈분극 전류 단계를 적용하여 전류 클램프 모드에서 뉴런의 정체를 확인하고 피펫의 바이오시틴이 수상돌기를 따라 확산되도록 합니다. 10분 후 피펫을 빼서 바깥쪽 패치를 얻습니다. 피펫이 슬라이스 위에 있으면 세포막이 적절하게 닫히도록 일련의 짧은 측면 상향 이동을 사용하여 기록 챔버에서 완전히 빠져 나옵니다.

표준 ACSF에서 슬라이스를 추가로 15분 동안 기록 챔버에 유지하여 바이오사이틴과 기록된 뉴런이 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 그런 다음 조직학을 위한 표준 ACSF가 들어 있는 25ml 호박색 유리병에 슬라이스를 부드럽게 옮깁니다. 이 절차에서는 epiflourescence가 있는 슬라이스에서 형광으로 표지된 뉴런을 대략적으로 찾습니다.

뉴런의 수지상 가지(dendritic arbor)를 간략하게 검사하고 10X 대물렌즈를 사용하여 축삭돌기(axon)와 축삭돌기(axonal bleb)를 찾습니다. 다음으로, 컨포칼 현미경으로 전환하고 488 나노미터 레이저 다이오드를 선택하여 표지된 뉴런을 여기시킵니다. Z축에서 축삭돌기와 수상돌기의 확장을 따르고 전체 세포에 대한 Z 스택을 얻기 위해 연속적인 이미지를 기록합니다.

Z축의 해상도를 조정하고 저배율 및 고배율에서 세포의 컨포칼 이미지를 수집합니다. 마지막에 이미징 소프트웨어로 뉴런의 이미지 파일을 엽니다. Z 투영 이미지를 IR-DGC 이미지와 눈으로 비교하여 전기생리학적 기록 중 패치 피펫의 정확한 위치를 찾습니다.

여기에 표시된 것은 도파민 뉴런과 근위 수상돌이에 있는 피펫의 IR-DGC 이미지입니다. 전류 트레이스는 셀 부착 구성에서 5밀리볼트 전압 명령에 대한 응답으로 EN 누설 전류의 용량을 보여주며, 5기가옴의 밀봉 저항을 갖습니다. 0 밀리 볼트의 막 전위에서 과분극 전압 단계는 천천히 활성화되는 과분극 활성화 양이온 전류를 유도했습니다.

현재 트레이스는 반전되고 단일 지수 함수가 장착되어 632밀리초의 시간 상수를 제공합니다. 다음은 세포 부착 기록 중 활동 전위를 제거하기 위해 전압 개폐 나트륨 및 칼슘 전류 차단제가 있는 상태에서 1초 하이퍼 및 탈분극 전류 펄스에 대해 기록된 전체 세포의 전압 응답입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 하루 만에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 건강한 조직과 안정적인 기록 조건을 얻는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 기록된 뉴런의 정체와 같은 추가 질문에 답하기 위해 면역조직화학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 신경 생리학 분야의 연구자들이 흥분성 세포에서 전위의존성 이온 채널의 특성과 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 수상돌기에서 전압 의존성 이온 채널을 통해 흐르는 전류의 분포를 기록하고 검사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.