식물 조직에서 유기산을 정량화하는 모세관 전기 영동을 사용하여 : 테스트 케이스 검사

이 실험 절차의 전반적인 목표는 식물 조직에 존재하는 유기산의 수치를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 환경 자극이 뿌리 성장, 작물 발달, 식품 또는 음료의 품질에 미치는 영향과 같은 식물 생화학 및 생리학 분야의 질문을 해결하는 데 사용될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 시료 준비 과정이 최소화된다는 점, 처리량이 높다는 점, 그리고 모세관 전기영동이 질량 분석법보다 비용 효율적이라는 점입니다.

이 방법은 식물의 생리적 반응을 규명하는 데 사용되지만, 유기산이 풍미, 안전성 및 안정성에 결정적인 영향을 미치는 식품 과학 및 식품 품질 분야에도 적용될 수 있습니다. 먼저, 단쇄 카복실산(SCCA) 추출을 위한 시료를 수집하십시오. 처리 후에도 충분한 양의 시료가 남을 수 있도록 커피 씨앗을 한 번에 1 g씩 준비하십시오.

최대 SCCA 추출 효율을 위해 균일한 입자 크기를 얻으려면, 먼저 막자사발과 막자를 액체 질소로 예냉합니다. 막자사발에 소량의 액체 질소와 함께 샘플을 넣습니다. 국자를 사용하여 샘플이 완전히 잠길 때까지 막자사발에 액체 질소를 충분히 추가합니다.

생커피콩과 같이 분쇄하기 어려운 시료를 액체 질소에 넣습니다. 분쇄 전 10~30초 동안 냉동시킵니다. 수직으로 누르는 동작을 통해 조직을 더 작은 조각으로 부숩니다.

그런 다음, 원을 그리듯 가는 동작으로 조직 분쇄를 완료합니다. 동결 및 분쇄 단계를 두 번 더 반복하여 샘플을 총 세 번 분쇄합니다. 일반적으로 세 번의 연속적인 분쇄 과정을 거치면 샘플이 밀가루와 같은 일관성을 가진 분말로 됩니다.

분말을 유리 바이알 또는 1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 분쇄 직후 후속 공정을 시작하거나, 추출 준비가 될 때까지 시료를 80 °C에서 보관하십시오. SCCA 농도 결정에 사용할 외표준 및 내표준 용액을 만들기 위해 관심 대상인 SCCA의 인증 표준 물질을 준비합니다.

커피 시료의 경우, 분석 대상 산으로 시트르산, 말산, 아세트산 및 젖산을 포함하고, 내부 표준물질로 아디핀산을 사용합니다. 10 mL 부피 플라스크에 표준물질 100 mg을 넣어 10 mg/mL 농도의 표준 용액을 만듭니다. 초순수를 사용하여 부피 플라스크의 10 mL 표시선까지 채워 산을 용해합니다.

각 스톡 용액을 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene) 라이닝 캡이 있는 깨끗한 15 milliliter 유리 튜브로 옮기고 플라스틱 파라핀 필름으로 밀봉합니다. 스톡 용액은 밀봉된 튜브 상태로 4 °C에서 일주일 동안 보관할 수 있습니다. 내부 표준물질 스톡 용액을 초순수로 희석하여 0.05 mg/mL 농도로 만들어 50 milliliters의 SCCA 추출 용액을 준비합니다.

내부 표준 물질 스톡 용액 250 µL를 물 49.75 mL에 첨가하여 이를 수행합니다. 그런 다음, 분석하고자 하는 SCCA의 표준 곡선 시료를 준비합니다. 시료에서 예상되는 SCCA 농도를 포괄하며 선형 응답 범위 내에 있는 농도로 최소 5개 이상의 지점을 설정하십시오.

각 SCCA를 초순수를 사용하여 새로운 마이크로 원심분리 튜브에 정해진 농도로 1 mL 부피가 되도록 희석하십시오. 각 농도 지점에 4가지 산 표준물질과 내부 표준물질이 정확한 농도로 모두 포함되었는지 확인하십시오. 추출할 샘플을 보관 장소에서 꺼내 얼음 위에 두십시오.

SCCA 추출을 위해 샘플 100 milligrams를 칭량합니다. 변동성을 줄이기 위해 가능한 한 목표 질량에 가깝게 샘플 양을 측정하십시오. 각 샘플을 칭량한 후, 조직을 깨끗한 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다.

검출된 SCCA의 양은 샘플 질량을 사용하여 정규화되므로, 측정된 각 샘플의 질량을 기록해 두십시오. 모든 샘플의 무게를 잰 후, 각 샘플 튜브에 추출액 1 mL를 첨가합니다. 모든 추출 과정에서 추출액과 조직 질량의 비율을 일정하게 유지하십시오.

10초 동안 보텍싱하여 잘 섞습니다. 샘플을 상온에서 1시간 동안 그대로 둡니다. 이 1시간 동안, 15분마다 각 튜브를 10초 동안 보텍싱하여 섞어줍니다.

1시간 동안 추출한 후, 샘플을 마지막으로 한 번 더 혼합하고 샘플 튜브를 마이크로 원심분리기(micro-centrifuge)로 옮깁니다. 고형 물질을 침전시키기 위해 4 °C에서 10,000 ×g로 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 샘플을 여과하기 위해 시린지 장착형 디스크 필터를 준비하며, 각 필터가 시린지에 정확하게 부착되었는지 확인합니다.

표준 곡선 시료를 포함하여 분석할 각 시료마다 디스크 필터가 장착된 시린지 하나를 준비하십시오. 상층액을 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브에 직접 여과하십시오. 여과 후, 여과액이 담긴 튜브를 닫고 시린지 필터 장치를 폐기하십시오.

각 모세관 전기영동(CE) 바이알에 1 mL의 샘플을 옮기되, 바이알 목 부분에 샘플이 튀지 않도록 주의하십시오. 샘플을 옮긴 후, 각 바이알에 CE 캡을 씌웁니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 SCCA 검출 실행을 설정하십시오.

제조업체 지침에 따라 표준 곡선 지점과 분석할 샘플이 담긴 바이알을 입구 샘플 트레이에 로드하십시오. 자동 샘플러 프로그래밍을 위해 각 바이알의 위치를 기록하십시오. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 컨디셔닝을 마친 후, 소프트웨어의 Control 메뉴를 열고 Run Sequence를 선택하여 샘플 분리를 시작하십시오.

적절한 분리가 이루어지는지 확인하기 위해 포토다이오드 어레이(photodiode array) 또는 PDA 트레이를 모니터링하십시오. 첫 번째 트레이스를 관찰하여 베이스라인이 평탄한지, 그리고 개별 산 피크가 명확하게 분리되었는지 확인하십시오. 샘플 피크를 적분하려면 첫 번째 파일을 열고 자동 적분 단계를 설정하여 분석 시작 후 처음 3분 동안은 제외하십시오.

동일한 메뉴에서 피크 선택 기준을 최소 피크 너비 50 units, 피크 면적 100 units로 설정하여 적절히 높은 수준의 선택성을 확보함으로써, 트레이스의 배경 소음으로부터 산 피크를 분리하십시오. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 데이터 분석을 수행합니다. 여기에는 과적재된 샘플을 강조하는 PDA 트레이스의 비교 결과가 표시되어 있습니다.

분석물 농도가 증가함에 따라, 개별 피크의 기하학적 구조가 비대칭으로 변하기 시작할 수 있습니다. 0.05 mg/mL 농도에서 아세트산은 뚜렷한 양측 대칭 피크를 나타냅니다. 아세트산의 농도가 0.07 또는 0.10 mg/mL로 증가하면 피크가 비대칭이 되며 피크 꼬리(peak tail)가 형성됩니다.

이러한 피크 테일링(peak tailing)은 시료가 과부하되었음을 나타내는 좋은 지표입니다. 여기에는 그린 커피 시료 내의 유기산을 보여주는 PDA 트레이스 예시가 표시되어 있습니다. 그린 커피 시료는 CE 바이알에 로딩하기 전 1:10으로 희석되었습니다.

관심 대상 산으로는 아세트산, 구연산, 젖산, 말산 및 내부 표준 물질인 아디핀산이 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 재현성을 극대화하고 실험 오차를 최소화하기 위해 샘플을 균일한 일관성으로 분쇄하고, 샘플을 주의 깊게 피펫팅하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 모세관 전기영동(CE)을 이용하여 식물 샘플로부터 유기산을 정량하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한 식물 샘플을 분쇄하고, 유기산을 추출하며, 후속 CE 분석을 위한 식물 추출물을 준비할 수 있게 될 것입니다.