Name: 마우스의 매트릭스 젤 플러그 분석을 사용하여 인간의 내피 - 주연 세포 상호 작용의 생체 내 연구에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 배우세요 마우스 매트릭스 젤 플러그 분석을 통해 인간 내피-주연 세포 상호작용을 생체 내에서 연구하는 방법을. 혈관 형성 신호 경로와 혈관 질환 관련 유전자를 식별하여 혈관 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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K. Yuan 박사는 미국심장협회 과학자 개발 보조금(15SDG25710448)과 폐고혈압협회 개념 증명상(SPO121940)의 지원을 받았습니다.V. de 예수 Perez 박사는 Robert Wood Johnson Foundation의 경력 개발상, NIH K08 HL105884-01 상, 폐고혈압 협회상, 미국 폐 협회의 생물의학 연구상, 중개 연구 및 응용 의학의 지원을 받았습니다 스탠포드 대학에서 상을 받았습니다.

윤리 정책 : 동물 과목을 포함하는 절차는 의학의 스탠포드 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 주 : 동물은 3 % 이소 플루 란 기화기와 O 2 가스의 3 % 공급 마취하에. 눈에 수의사 연고의 사용은 마취 상태에서 건조를 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 1. 셀 준비 <ol><li> 적절한 용지의 10 ml의 100mm 판에 인간의 내피 세포와 혈관 주위 세포 문화를 성장. 세포까지 삼일 80 % 포화 상태에 도달 - 매 2는 새로운 배지 10 ㎖를 교체합니다. <ol><li> 회사 보충 완전한 내피 세포 배지 (ECM)에서 배양 된 혈관 내피 세포 (EC에)는 5 % 소 태아 혈청 (FBS), 10 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 10 %의 내피 세포 성장 보충 공급된다. </li><li> 회사 전체 주연 세포 보충 미디어 (PM)에서 배양 혈관 주위 세포는 2 % FBS, 10 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 10 % 주연 세포 성장 보충 공급된다. </li&gt; </ol></li><li> 세포 혼합물을 준비 <ol><li> 실험 및 제어 그룹에 대한 세포의 필요한 수를 계산합니다. 참고 : 실험 그룹의 각 플러그는 백만 (× 10 6 1) 인간되는 EC 및 이십만 (2 × 10 5) 혈관 주위 세포가 포함되어 있습니다. 대조군의 경우, 각 플러그는 120 만 인간되는 EC 만 포함되어 있습니다. 음성 대조군은 기질 겔만을 갖는다. 각 그룹은 플러그가 마우스의 허리의 양쪽에 주입 될 수있는 두 개의 마우스를 필요 최소한 네 개의 플러그를 포함한다. 세 개의 플러그는 실험 중으로 역할 것이며, 네 번째는 하나가 실패 할 경우에 사용될 수있다. 젤의 여분의 볼륨에 맞게 25 % 추가 세포를 준비합니다. </li><li> 수집 및 배양 접시에서 세포를 계산합니다. <ol><li> 세포를 분리하려면, 미디어를 제거하고 실내 온도 1 배 인산 완충 식염수 (PBS)로 한 번 씻는다. , PBS를 제거 1 ml의 0.25 % 트립신 / 2.21 mM의 EDTA를 추가하고, 1 분 동안 품어. (2)를 추가하여 플레이트 떨어져 세포를 씻으ML의 중간 15 ML 튜브에 수집합니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 혈구를 사용하여 셀을 계산합니다. </li><li> 5 분 동안 400 XG에서 펠릿으로 세포의 적절한 수를 원심 분리기. 실험 그룹, 원심 분리되는 EC 아래로 함께 한 펠렛으로 혈관 주위 세포 모두에 대해. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 매트릭스 젤 준비 <ol><li> 4 시간 또는 균질 용액을 수득 밤새 4 ℃에서 완전히 겔 매트릭스를 해동. 아니 혼합이 필요하지 않습니다. </li><li> 4 ° C에서 나누어지는 매트릭스 1.5 ml의 튜브 젤 및 저장. </li><li> 사전 진정 멸균 1.5 ml의 튜브와 4 ℃에서 28 G 1 cc의 인슐린 주사기. 주의 : 항상 얼음에 매트릭스 젤을 유지합니다. </li><li> 부피비 1 bFGF를 차가운 매트릭스 겔 믹스 : 100 (bFGF를 최종 농도 = 0.5 μg의 / ml의 bFGF를는 원액 =를 50㎍ / ml)로 수회를 피펫 팅 상하로 매트릭스 겔 용액을 혼합 한 후, 얼음에 부화 60 분 B - 30는 efore 단계 3.1에서 세포와 혼합. 참고 : 혼합하기 전에 주식의 bFGF를 해동. 주입에 필요한 플러그의 수를 계산합니다. 예를 들어, 각 플러그 200 μL 매트릭스 겔을 필요로한다. 따라서, 25 % 추가 젤을 준비합니다. </li></ol> 세포 3. 믹스 매트릭스 젤 <ol><li> 각 그룹에 대해, bFGF를 함유 매트릭스 겔의 부피 계산 (적합한 세포 수를 포함) 세포 펠렛을 재현 탁. 거품을 방지하고 쥐가 주입을 위해 준비 될 때까지 얼음에 15 ML 튜브에두고 가볍게 섞는다. </li></ol> 4. 마우스 준비 <ol><li> 유도 챔버에서 3 % 아이소 플루 란에서 5 분 플러스 3 % O 2 1 SCID 마우스를 마취. 한 번에 하나의 실험 그룹 또는 2 마우스에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 다운 가열 패드 복부 측의 유도 챔버로부터 발생 마우스를 제거하고 신속 인제 걸쳐 마취를 공급하는 비 호흡 낭 시스템을 통해 마우스의 얼굴에 주둥이 노즐 부착ction 절차. 비 호흡 낭 시스템으로 유도 챔버에서 가스 흐름을 전환하여 1.5 % 아이소 플루 란 1.5 % O 2 가스 압력을 낮출. </li><li> 면도기 나 헤어 제거 크림 (1cm 직경 약) 두 측면 뒷 영역에서 머리를 제거합니다. </li><li> 70 % 알코올 패드로 피부 부위를 닦아주십시오. </li><li> 유도 챔버에 마우스를 반환하고 반복 4.2 단계 - 4.4 두 번째 마우스. </li></ol> 5. 매트릭스 젤 주입 <ol><li> 비 호흡 낭 시스템에 연결하고 아래로 가열 패드 복부 측면에 배치하여 주사 한 마우스를 준비합니다. </li><li> 한 번에 미리 냉장 28 G 1 cc의 인슐린 주사기 하나의 마우스로 매트릭스 젤을로드합니다. <ol><li> 주사기에 두 개의 플러그 (200 플러그 당 μl의 플러스 25 % 추가)에 대한 매트릭스 젤의 전체 500 μl의 볼륨을로드합니다. </li><li> 확인 세륨을 방지하기 위해 주사기로 세포를 로딩 3 분 이내에 쥐에 매트릭스 겔을 주입해야주사기의 측면에 고정되고 주사기 내부 고화 매트릭스 겔을 방지 내지 LLS. </li></ol></li><li> 다음, 피하 공간을 찾아 흉곽의 뒷면 후방의 피하 공간으로 천천히 고르게 매트릭스 젤의 200 μl를 주입하기 위해 다시 피부를 들어 올립니다. </li><li> 주사 부위에서 누출 매트릭스 겔 않도록주의하면서 천천히 주사 바늘을 제거합니다. 범프는 주사 부위에서 형성된다. 알코올 솜으로 주사 부위를 닦아주십시오. </li><li> 1 분은 열 패드의 매트릭스 겔의 겔화를 허용하는 다음의 뒷면에 마우스를두고 마우스의 뒷면의 반대편에 5.5 - 반복 주입은 5.2 단계를 반복합니다. </li><li> 십사일 후 범프를 식별하기 위해 영구 마커를 사용하여 두 범프 개요. 일부 머리 위로 성장 후에, 범프를 쉽게 찾을 수있을 것이다. </li></ol> 6. 매트릭스 젤 플러그 분리 : 14 일 주입 후 <ol><li> 동물을 인도적으로 노출시켜 마우스를 안락사죽음을 보장하기 위해 자궁 경부 전위 다음 이산화탄소 흡입&gt; 5 분에. </li><li> 마우스의 뒷면에서 매트릭스 겔 플러그를 제거합니다. <ol><li> 조심스럽게 플러그가 4.3 단계를 반복하여있는 주사 부위 주변 재성장 머리를 제거합니다. 마커 라인 피부 아래 원래 범프의 크기를 나타낸다. </li><li> 각각 플러그의 상부 및 하부 측면 상에 장착 된 주변 피부와 근육 층과 함께 플러그를 절제. <ol><li> 미세 수술 가위를 사용하여 피부에 수직 인 플러그의 뚜렷한 경계에 절개를하고, 플러그 아래 근육의 실수. 그리고, 신중 표시된 테두리를 따라 플러그의 둘레 잘랐다. </li><li> 그것은 피부와 근육 층 사이에 끼워 유지, 플러그를 제거합니다. 즉시 여분의 피를 씻어 1X PBS와 작은 비커에 헹군다. 플러그 (다음 단계, 6.3)는 이제 해결 될 준비가되어 있습니다. </li></ol></li></ol></li><li> PLU 수정4 % 파라 포름 알데히드에서 g. <ol><li> 요동없이 실온에서 24 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 25 ㎖와 50 ㎖ 튜브에서 피부와 근육 층을 포함하는 전체 플러그 두지. 다음날, 파라핀 매립하기 전에 또 다른 24 시간 동안 70 % 에탄올 25 ㎖에 플러그를 옮긴다. 참고 :주의 파라 포름 알데히드를 처리합니다. 장갑을 착용 할 것. </li></ol></li></ol> 7. 파라핀 프로세스 매트릭스 젤 플러그 <ol><li> 파라핀 삽입의 플러그를 준비합니다. <ol><li> 도 1a에 도시 된 바와 같이 플러그의 방향; 플러그의면이 위를 향하게되고, 모두 피부와 근육 층 절편 중 첫번째 절단 될 조직 블록의 표면을 볼 수 있도록 조직 카세트에 플러그를 배치했다. </li></ol></li><li> 파라핀 파라핀 매립 표준 프로토콜 13에 따라 플러그를 삽입. </li><li> 현미경 코르 슬라이드에 조직 블록 떨어져 10 μm의 두께 섹션 및 마운트 - 8 컷표준 파라핀 절편 프로토콜 13 땡. </li><li> 염색에 대한 준비가 될 때까지 실온에서 시원하고 건조한 장소에 슬라이드를 저장합니다. </li></ol> 헤 마톡 실린 및 에오신 얼룩 (H &amp; E) 8. 얼룩 섹션 (13) <ol><li> 회 100 % 크실렌으로 슬라이드를 전달하여 조직 절편을 드 - paraffinize, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 70 % 에탄올, 마지막 1X PBS, 실온에서 5 분간 각. 다음 단계까지 1X PBS에서 슬라이드를 둡니다. </li><li> 피펫 100 μL H &amp; E 섹션 상 용액 1 부화 - 5 분, 또는 10 배 배율로 수직 광 현미경으로 볼 때 셀에 파란색 핵와 핑크 세포질 사이의 명확한 대비가있을 때까지. 어떤 H &amp; E 솔루션은 목표에 닿지 않도록주의하십시오. </li><li> 수돗물의 큰 비이커 슬라이드 덩크하여 슬라이드 씻어 H &amp; E 용액 후 비커 랙에 슬라이드를 넣고 2 분 동안 흐르는 물에 세척 할. </li><li> 모슬라이드 마운트 9.8 단계했습니다. </li></ol> 인간의 모세 혈관과 혈관 주위 세포 9. 얼룩 다른 슬라이드 <ol><li> 회 100 % 크실렌으로 슬라이드를 전달하여 조직 절편을 드 - paraffinize, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 70 % 에탄올, 마지막 1X PBS, 실온에서 5 분간 각. 다음 단계까지 1X PBS에서 슬라이드를 둡니다. </li><li> 항원 검색 솔루션의 섹션을 끓인다. <ol><li> 2 L의 비이커에서, 가열 블록에 95 ° C에서 항원을 검 용액 1X 시트르산 완충액을 사용하여 (PH 7.0) 끓는 제조. </li><li> 비등하면, 금속 랙에 슬라이드를 넣고 20 분 동안 끓는 항원 검색 용액에 잠기. </li><li> 조심 여전히 잠겨 슬라이드와 가열 블록의 비이커를 제거하고 용액을 서서히 약 30 분 동안 실온으로 복귀 할 수있다. </li><li> 다음 단계까지 1X PBS에서 슬라이드를 놓습니다. </li></ol></li><li> 블로킹 완충액의 섹션 (1X PBS, 5 % 염소 혈청 0 차단0.3 % 트리톤 X-100). <ol><li> 팹 펜으로 각 섹션의 가장자리 주위에 소수성 원을 그립니다. </li><li> 트레이 하단에 증류수와 습도 트레이에 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 확인 모든 조직으로 만드는 부분 상에 피펫 100 μl를 차단 버퍼가 유체에 의해 덮여있다 (이상 100 μl를 요구할 수있다). </li><li> 1 시간 동안 버퍼를 차단하여 섹션을 품어. </li></ol></li><li> 일차 항체와 섹션을 품어. <ol><li> CD31되는 EC ()와 희석액에 희석 평활근 액틴 (혈관 주위 세포)에 대한 각 섹션 (1X PBS, 1 % BSA, 0.3 %는 트리톤 X-100)를 조사하기 위해 두 개의 일차 항체와 하나의 솔루션을 준비합니다. 참고 : 여기, 항 CD31 농도 1:50이며, 안티 - 평활근 액틴 농도는 1 : 300. </li><li> 하룻밤 증류수를 포함하는 습도 트레이에 100 ㎕의 일차 항체 4 ° C에서 섹션을 품어. </li></ol></li><li> 1X PBST (1X PBS + 0.1 % TWE에서 슬라이드를 세 번 씻으5 분마다 세척을위한 EN20). </li><li> 차 항체와 섹션을 품어. <ol><li> 희석액에 희석 항 CD31 토끼 항체를 인식하는 형광 결합 염소 항 - 토끼 이차 항체 용액을 준비한다. <ol><li> 참고 : 평활근 액틴 차 항체가 이미 CY3의 형광 물질과 결합되어, 그래서 차 항체 염색이 필요하지 않습니다. 250 : 염소 안티 토끼 차 항체 농도는 1입니다. </li></ol></li><li> 증류수가 들어있는 습도 트레이에 100 μL 차 항체와 1 시간 동안 섹션을 품어. </li></ol></li><li> 5 분마다 세척을 위해 1X PBST에서 슬라이드를 세 번 씻으십시오. </li><li> 슬라이드를 탑재합니다. <ol><li> 각 섹션 상에 DAPI 핵 염색 antifade 장착 솔루션의 - (60 μL ~ 40) - 피펫 2 3 방울. </li><li> 조심스럽게 노를 놓습니다. 유체가 섹션을 통해 확산 할 수 있도록 섹션 및 설치 솔루션, 이상과의 가장자리에 1.5 커버 슬립커버 슬립. 조심스럽게 섹션 위에 위치 할 수있다 기포를 눌러 손가락을 사용합니다. </li><li> 슬라이드가 취급하기 전에 최소 1 시간 동안 건조 시키십시오. </li></ol></li></ol> 10. 정량화 모세관 밀도 및 구조 (14) <ol><li> H &amp; E 염색 절에 모세 혈관의 수를 계산, # / mm 2로 표시됩니다. <ol><li> 40X 배율에서 직립 광학 현미경에 네 가지 분야의 사진을 획득. 참고 : 모세 혈관은 적혈구 가득 튜브로 식별됩니다. </li><li> 대안 적으로, 수동으로 계산하는 대신 모세 혈관 등 혈관 수 평균 용기의 길이와 직경과 분기점 각종 혈관 변수 정량화 이미지 분석 소프트웨어 (예 Wimasis 이미지 분석)을 사용한다. </li></ol></li><li> 면역 염색 섹션 모세관 구조를 분석. <ol><li> 거꾸로 형광 현미경에 네 가지 분야의 사진을 획득FITC와 TxRed 필터 큐브. <ol><li> 488 nm 파장에서 여기로 이미지되는 EC에 FITC 큐브를 사용하여 594 nm 파장에서 여기로 이미지 혈관 주위 세포에 TxRed 큐브를 사용합니다. <style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
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경쟁하는 금전적 이해관계가 동봉되지 않습니다.

매트릭스 겔 플러그 분석은 혈관 신생, 혈관 신생 및 생체 내 혈관 형성 화합물의 유전자 조절을 평가하기 위해 시험 관내 테스트를 보완하기 위해 더욱 강력한 방법으로 입증되었다. 여기서는 상세히 용기 형성시 내피 세포와 주연 세포 간의 상호 작용을 조사 인간 혈관의 신규 매트릭스 겔 플러그 어 세이를 기술한다. 이 프로토콜에 몇 가지 새롭고 중요한 단계가 있습니다. 낮은 통로 (통로 1-4)에서 세포를 젊은 세포가 14 일 실험 설정에서 더 생존 할 수 있기 때문에 바람직하다. 사용하는 내피 세포의 개수는 최소 백만이며 주연 세포에 대한 EC의 비율은 5 : 1; 그러나, 증가 된 혈관 주위 세포 수는 모세 혈관에서의 커버리지를 향상시킬 것이다. 단독 내피 세포 실험군의 경우, 주입 된 세포의 총 수는 120 만 인 내피 세포 및 혈관 주위 세포의 합, 그에되어야E는 플러그 당 총 세포 수는 일치한다. 세포 수 및 겔 매트릭스 부피의 적절한 양...

혈관 신생은 새로운 혈관이 정상 개발 관련 질병에 이르기까지 다양한 분야에 걸쳐 지속적인 연구의 초점을 기존의 혈관 망 (1)로 형성하고있다하는 과정이다. 이 역동적 인 과정은 증식과 혈관 내피 세포되는 EC () 및 산소와 영양 공급이 필요합니다 사이트 향하는 혈관 튜브를 구성하는 혈관 주위 세포의 모집의 이동을 포함한다. 이 프로세스는 동일 동적 분석, 관 형성의 3 차원 성질 요점을 되풀이 할 가장 중요한 하나가 필요보고자. 시험관 차원 매트릭스 분석이 요구를 충족하기 위해 개발되어 연구자 혈관 제자리 3, 4, 5, 6 소요되는 시간과 공간에서의 개별 단계를 정의 할 수 있도록 잘 작동 하였다. 그러나, 이러한 시험 관내 3D 행렬 모델은 비 혈관 관류 공부에 한정D 따라서 혈관 신생 과정과 관련된 중요한 구성 요소 부족 (예를 들어, 혈관 침대에서 성장 및 저해 요인, 자연스러운 긴장 / 힘을 순환) 라이브 조직에 존재하는 복잡한 환경을 시뮬레이션하는 데 실패합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 여러 가지의 생체 내 혈관 신생 어 세이가 우리 보고서 (8, 9)의 초점이 될 매트릭스 겔 플러그 분석 포함 7 개발되었다. 매트릭스 겔 플러그 분석은 혈관 신생에 다른 세포 물질의 역할을 테스트하기위한 강력한 플랫폼을 제공하기 때문에 연구자 호소 잘 확립 된 생체 내 혈관 신생 어 세이이다. 매트릭스 겔을 37 ℃에서 겔과 같은 물질로 고형화 Engelbreth-Holm이 - 스웜 (EHS) 마우스 육종 세포주에 의해 분비 된 시판 기저막 솔루션이다. 매트릭스 겔 같은 성장 인자와 같은 인제 세포 및 / 또는 물질과 혼합 될 수있다마우스에 피하 cted. 호스트되는 EC는 14 일 동안 플러그를 침공 혈관 네트워크를 형성하고, 호스트의 혈액 관류 될 것입니다. 현재까지, 매트릭스 겔 플러그 분석이 분석은에 공동 문화 내피 세포와 혈관 주위 세포를 사용할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 노력은 아직하지 않았습니다 우리가 아는 한, 그러나, 혈관 신생 동안 내피 세포 행동의 연구에 독점적으로 초점을 맞추고있다 이 두 종류의 세포가 혈관 신생 동안 상호 작용하는 방법을 연구한다. 특히, 내장 컴퓨터와 주연 세포 간의 관계를 이해하는 것은 미세 혈관 허혈 및 말초 혈관 질환을 10, 11, 12을 포함한 혈관 손실 병적 인 질환을 연구하는데 유용하다. 여기에서는 인간의 EC 및 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)와 함께 매트릭스 겔 혼합물에 인간 유래 혈관 주위 세포를 도입하는 프로토콜을 기술한다. 이 혼합물을 내가 피하 주입 될 수있다n은 SCID 마우스의 배부는 완전한 기능을, 주연 세포 코팅, 하이브리드 혈관의 형성을 허용합니다. 우리의 프로토콜 또는 SCID 마우스 및 방법 중요한 혈관 신생 엔드 포인트에 대한 조직 학적 섹션을 분석하는 방법으로 인간의 혈관 주위 세포, 배치하지 않고 두 사람의 EC를 포함하는 매트릭스 겔 플러그를 준비하는 방법에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>PBS(인산염 완충 식염수)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신/0.53mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>내피 세포 배지(ECM) 키트</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td>에는 배지, EC 성장 보조제 및 페니실린/스트렙토마이신이 포함되어 있으며, 각각 쉽게 혼합할 수 있도록 적절한 용량으로 공급됩니다</td></tr>. <tr><td>Pericyte Media(PM) 키트</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td>배지, pericyte 성장 보충제 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함하며, 각각은</td></tr><tr><td>1차 인간 폐 미세혈관 내피 세포</td>를 쉽게 혼합할 수 있도록 적절한 부피로 공급됩니다. 폐<td>고혈압 돌파구 이니셔티브</td><td></td><td>이 세포 유형은 상업적으로도 이용 가능합니다. 통로 1-4에서 사용되는 세포 1-4</td></tr><tr><td>일차 인간 폐 pericytes</td><td>폐 고혈압 돌파 이니셔티브</td><td></td><td>이 세포 유형은 상업적으로 이용 가능하지 않지만 뇌 paricytes는 이용 가능합니다.&nbsp; 통로 1-4</td></tr><tr><td>bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)</td>에서 사용되는 세포<td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>원액은 50 &mu; PBS에서 0.1% BSA의 g/ml, 50 &mu에서 부분 표본; l -20도에서 보관</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>BD</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1 cc Insluin 주사기</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>SCID (Severe Combined Immune Deficiency) 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NOD. SCID IL2R 감마 녹아웃 변형이 가장 좋은 변형입니다. 생후 4-6주</td></tr><tr><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브, 멸균</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15ml 나사 상형 튜브, 멸균</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>PAP 펜</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Nair 제모 크림</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD31 primary antibody</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B4737</td><td>working solution is 1:50</td></tr><tr><td>anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>working solution is 1:300</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>working solution is 1:250</td></tr><tr><td>Prolong Gold DAPI solution</td><td>Cell 시그널링</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>no. 1.5 커버 슬립</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>구연산염 완충액 10x</td><td>Millipore</td><td>21545</td><td></td></tr><tr><td>초미세 수술용 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>포르말린(파라포름알데히드)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>245-685</td><td></td></tr><tr><td>티슈 카세트</td><td>Simport</td><td>M492-12</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스의 매트릭스 젤 플러그 분석을 사용하여 인간의 내피 - 주연 세포 상호 작용의 생체 내 연구에

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

혈관신생은 기존 혈관에서 새로운 혈관이 형성되는 과정입니다. 새로운 혈관 성장은 관형 구조를 형성하기 위해 조정된 내피 세포 증식, 이동 및 정렬을 필요로 하며, 벽화 지지를 제공하고 혈관 성숙을 촉진하기 위해 주피 세포를 모집해야 합니다. 현재의 체외 세포 배양 접근법은 내피 세포와 주피 세포가 상호 작용하여 기능적 혈관을 생성하는 복잡한 생물학적 환경을 완전히 재현할 수 없습니다. 우리는 중증 복합 면역 결핍 돌연변이(SCID) 마우스를 사용하여 내피-주막 세포 상호 작용 및 기능적 혈관 형성을 연구하기 위해 생체 내 매트릭스 젤 플러그 분석의 새로운 응용 프로그램을 제시합니다. 간단히 말해서, 매트릭스 겔을 주피세포가 있거나 없는 내피 세포를 포함하는 용액과 혼합한 다음 마취된 SCID 마우스의 뒤쪽에 주입합니다. 14일 후, 조직학적 분석을 위해 매트릭스 겔 플러그를 제거, 고정 및 절편화합니다. 성숙한 혈관의 주위 세포 적용 범위(내강에 적혈구의 존재로 정의됨)의 길이, 수, 크기 및 범위는 상업적인 통계 플랫폼을 사용하여 실험 그룹 간에 정량화하고 비교할 수 있습니다. 혈관 신생 분석법으로 사용하는 것 외에도 이 매트릭스 겔 플러그 분석은 유전자 연구를 수행하고 약물 발견을 위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다. 결론적으로, 이 프로토콜을 통해 연구자들은 내피-주피세포 상호 작용 및 전신 또는 폐 혈관 신생과의 관련성 연구를 위해 사용 가능한 체외 분석을 보완할 수 있습니다.

매트릭스 겔 플러그 부분의 대표 H &amp; E 및 면역 염색은 플러그가 대부분 포함 플러그 반면 혈액 (왼쪽 그림 2 위에, 검은 색 화살표)를 관류되지 않는 일부 선박되는 EC 및 혈관 주위 세포가 모두 관류 여러 표시를 표시 EC에서 그림 2. 섹션을 표시됩니다 CD31 양성되는 EC 바로 옆에 긍정적 인 SMA 염색에 의해 입증 직경이 크고 완전한 주연 세포의 범위와 선박. 이러한 결과는 혈관 주위 세포는 신생 혈관 형성이 역동적 인 과정이 효과적으로 요약 쉽게 생체 내 모델에서 분석 될 수있는 중요한 역할을한다는 것을 제안한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54617/54617fig1.jpg" /> 조직 카세트...

우리는 매트릭스 겔 플러그 혈관 분석의 변형을 사용하여 마우스에서의 인간 내피 주연 세포의 상호 작용을 연구하는 프로토콜을 제시한다.

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

본 인비보(in-vivo) 매트릭스 겔 분석의 전반적인 목표는 내피 세포와 기생충의 상호작용을 조사하는 것입니다. 이 매트릭젤 분석은 연구자가 혈관 형성(androgenesis)의 주요 단계를 연구하는 데 도움을 주도록 설계되었습니다. 또한, 이는 혈관 형성의 주요 단계에 관여하는 신호 전달 경로뿐만 아니라, 기능 이상 시 혈관 질환 및 기타 혈관 형성 이상을 유발할 수 있는 유전자를 식별할 수 있게 해줍니다.이 기술의 주요 장점은 혈관 내피세포와 그 지지 세포인 주세포(pericytes)가 모두 관여하는 생체 내(in-vivo) 혈관 형성을 연구할 수 있다는 것입니다. 우선, 100mm 플레이트에 10mL의 적절한 배지를 사용하여 인간 내피세포 및 주세포 배양을 수행합니다. 세포가 80%의 합류도(confluency)에 도달할 때까지 2~3일마다 배지를 교체합니다.세포와 혼합할 매트릭스 겔 용액을 준비하려면, 매트릭스 겔 스톡을 4 °C에서 하룻밤 동안 해동하십시오. 그 후, 장기 보관용으로 -20 °C에 저장하거나 최대 2주 동안 4 °C에 보관할 수 있도록 1.5 mL씩 소분하십시오. 각 실험용 플러그에는 200 µL의 매트릭스 겔이 필요합니다.따라서 보관된 튜브 하나로 25%의 여유분을 포함하여 6개의 플러그에 공급할 수 있습니다. 해동된 100x beta-FGF 스톡 15 µL를 첨가하여 사용에 필요한 각 분주량을 준비하십시오. 피펫팅을 통해 beta-FGF를 용액에 혼합한 후, 세포를 첨가하기 전 최소 30분 동안 얼음 위에서 배양하십시오.이 시점에서 주입에 사용할 28-gauge 1cc 인슐린 주사기를 냉각합니다. 배양 플레이트에서 세포를 수집하려면, 배지를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. PBS를 제거한 후, 트립신 용액 1 mL를 첨가하고 플레이트를 인큐베이터에 1분 동안 다시 넣습니다.그런 다음, 세포를 떼어내기 위해 플레이트에 2 mL의 배지를 피펫으로 분주하고, 해당 배지를 15 mL 튜브에 수집합니다. 이제 헤모사이토미터를 사용하여 수집된 세포의 농도를 확인합니다. 그 후, 15 mL 튜브에 세포 분주액을 준비합니다.실험군으로 100만 개의 혈관 내피 세포와 200,000마리의 기생충 조합을 사용합니다. 다음으로, 세포 분취액을 400g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음, 계산된 부피의 매트릭스 겔(matrix gel)을 세포 펠렛에 첨가하고, 공기 방울이 주입되면 안 되므로 거품이 생기지 않도록 부드럽게 피펫팅하여 섞습니다.이제 마우스에 주입할 준비가 될 때까지 준비물을 얼음 위에 보관하십시오. isoflurane으로 마우스를 마취시킨 후, 발가락 꼬집기(toe pinch)로 마취 상태를 확인하고, isoflurane을 공급하는 비재호흡 시스템에 마우스를 연결한 뒤 복측이 아래로 향하게 하여 가열 패드 위에 놓으십시오. 이제 양쪽 뒷다리 외측 부위에서 약 1cm² 정도의 털을 제거하십시오.그런 다음 70% alcohol을 사용하여 노출된 피부를 깨끗이 닦아냅니다. 다음으로, 준비된 세포 용액 1 mL를 냉각된 주사기에 충전하며, 이는 4개의 플러그에 충분한 양입니다. 주사를 놓기 위해 등 피부를 들어 올려 피하 공간을 찾습니다.그 다음 200 µL를 갈비뼈 뒤쪽의 피하 공간에 천천히 고르게 주입하고, 약물이 새지 않도록 바늘을 천천히 제거합니다. 주입 후에는 해당 부위에 부풀어 오른 부분이 형성됩니다. 해당 부위를 알코올로 닦아낸 후, 나중에 찾을 수 있도록 유성 마커로 부풀어 오른 부위의 외곽선을 표시합니다.그런 다음, 마우스의 반대편에 동일한 주입 절차를 반복합니다. 세포가 주사기에 달라붙기 시작하므로 3분 이내에 모든 세포를 주입해야 합니다. 주입 단계는 매우 중요하며, 피부와 근육층 사이에 매트릭스 겔 플러그가 형성되어 플러그가 좋은 형태를 유지하고 확산되지 않도록 해야 합니다.다음 마우스를 주입하기 전에, 주입된 마우스를 가열 패드 위에 1분 동안 두어 매트릭스가 겔화될 시간을 줍니다. 안락사 후, 마우스를 수술대 위에 배치합니다. 주입 부위에서 다시 자라난 털을 제거한 후, 플러그의 위치를 식별하는 표시선을 찾습니다.그 다음, 미세 수술 가위를 사용하여 표시된 플러그 경계를 따라 피부에 수직이 되도록 절개하여 아래쪽 근육층까지 자릅니다. 표시된 경계의 주변부를 조심스럽게 절개합니다. 그런 다음 피부층과 근육층 사이에 플러그가 끼인 상태를 유지하며 플러그를 제거합니다.혈액을 제거하기 위해 플러그를 PBS가 담긴 작은 비커에서 즉시 헹굽니다. 그런 다음, 전체 플러그를 4% paraformaldehyde 25 mL가 들어 있는 50 mL 튜브에 넣습니다. 교반 없이 실온에서 24시간 동안 고정시킵니다.다음 날, 플러그를 25 mL의 70% ethanol에 넣고 24시간 동안 둡니다. 그 후, 파라핀 임베딩을 진행합니다. 혈관내피세포만 포함된 플러그의 절편을 통해 일부 혈관은 체내(in-vivo) 14일 후에도 숙주의 혈액이 관류되지 않음을 확인할 수 있습니다.반대로, 내피세포와 기생충을 모두 포함하는 플러그는 체내(in-vivo)에서 14일 후 많은 관류 혈관을 나타냅니다. 이러한 플러그에는 빨간색으로 표시된 smooth muscle actin 염색 양성 세포가 초록색으로 표시된 CD31 양성 내피세포 바로 인접하여 관찰됩니다. 따라서, 기생충은 초기 혈관 형성에 상당한 역할을 할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 여러 세포 유형에서 혈관 형성을 연구하기 위해 이 강력한 in-vivo 기법을 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기법은 연구자들이 마우스 모델을 통해 혈관 생물학의 다양한 주제를 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다. 본 절차에 이어, 유전자 발현 및 프로테오믹스의 변화와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 quantitative PCR 및 Western immunoblotting과 같은 다른 분석 방법들도 수행할 수 있습니다.이 강력한 기술을 통해 연구자는 혈관 형성 과정에서 내피 세포와 기생충이 어떻게 상호작용하는지 생체 내(in-vivo)에서 연구할 수 있습니다. 이는 혈관 신생의 핵심 단계입니다. 또한, 이 강력한 기술을 통해 연구자는 폐고혈압을 비롯한 다양한 혈관 질환을 이해하는 데 중요한 다른 세포 간 상호작용을 연구할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기서 우리는 인간의 코드 혈액 유래 내피 식민지 - 형성 세포 (ECFCs) 및 골수 - 유래 subcutaneously immunodeficient 마우스로 콜라겐 / fibronectin 겔에 포함된 mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)를,.을 제공하는 방법을 설명 이 셀 / 젤 조합은 마우스 vasculature와 연결하는 인간의 혈관 네트워크를 생성합니다.

Immunodeficient 마우스의 생체 공학 인간 Microvascular 네트워크

이 비디오에서는 복강내에 지질다당류를 주입한 마우스 모델의 장간막 정맥에서 혈액 세포-내피 상호 작용의 실시간 시각화를 보여줍니다.

염증 마우스 모델에서 혈액 세포-내피 상호 작용을 분석하기 위한 생체 내 현미경 검사

내피 내피 / glycocalyx 표면 층은 이상적인 intravital 현미경을 사용하여 공부하고 있습니다. Intravital 현미경은 기술적 같은 폐 등 움직이는 장기에 도전하고 있습니다. 우리는 동시 brightfield 및 형광 현미경은 자유롭게 - 이동에 내피 표면 층의 두께를 추정하는 데 사용할 수 있습니다 방법을...

마우스 폐 내피 표면 층의 생체 측정

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

우리는 암세포가 분비하는 인자 풀의 혈관 형성 가능성을 설명하기 위해 초음파와 내시경이라는 두 가지 상보적인 이미징 방식을 사용하여 마트리겔 플러그 분석을 설명합니다. 세포외 기질(ECM)-모방 겔인 마트리겔(matrigel)은 조건화된 배지(C.M.)로 분비되는 혈관 형성 인자를 숙주(마우스)에 도입하는 데 사용됩니다.

고속 성장하는 종양 생성 세포에 의해 분비 요인에 의해 보충 모니터링 기능 및 혈관의 형태학

전단 응력을 받는 혈관과 박테리아의 상호 작용을 연구하기 위해 혈관 접착에 기여하는 박테리아 및 숙주 요인을 해부할 수 있는 유동 챔버 및 생체 내 장간막 생체 내 현미경 모델이 설명됩니다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

마우스의 장간막 정맥에 대한 이 단순화된 생체 내 현미경 검사는 백혈구-내피 및 혈소판-백혈구 상호 작용을 관찰하기 위해 다양한 염증 모델에 사용할 수 있습니다.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

혈액 뇌 장벽의 범위를 유지하는 것은 중추 신경계의 항상성을 유지하기위한 열쇠입니다. 이 프로토콜은 혈액 - 뇌 장벽 범위를 조정하는 근본적인 병적 과정을 묘사하는 체외 기술을 설명합니다.

혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법

이 프로토콜 선물 소설 체 외에서 구슬 시험을 더 적절 하 게 vivo에서 pericytes를 통합 하 여 신생을 돋 아의 프로세스 모델. 이 수정 구슬 분석 결과를 내 피 세포와 신생에 대 한 중요 한 벽화 셀 간의 heterotypic 세포 상호 작용을 더 충실 하 게 정리를 수 있습니다.

분석 결과 돋 아 내 피 세포 구슬 Pericytes 통합

이 분석은 3D 콜라겐 젤에서 배양된 배아체로 분화된 마우스 배아 줄기 세포를 활용하여 시험관 내에서 발아 혈관신생을 제어하는 생물학적 과정을 분석합니다. 이 기술은 약물 테스트, 질병 모델링 및 배아적으로 치명적인 결실의 맥락에서 특정 유전자를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석

여기에 제시된 방법은 염색 없이 생체 내에서 혈관신생 또는 혈관 투과성에 대한 시약의 효과를 평가할 수 있습니다. 이 방법은 꼬리 정맥을 통한 덱스트란-FITC 주입을 사용하여 신생 혈관 또는 혈관 누출을 시각화합니다.

혈관신생 연구를 위한 수정된 In Vivo Matrix Gel Plug Assay

배우세요 마우스 매트릭스 젤 플러그 분석을 통해 인간 내피-주연 세포 상호작용을 생체 내에서 연구하는 방법을. 혈관 형성 신호 경로와 혈관 질환 관련 유전자를 식별하여 혈관 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

마우스의 매트릭스 젤 플러그 분석을 사용하여 인간의 내피 - 주연 세포 상호 작용의 생체 내 연구에

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