마우스의 매트릭스 젤 플러그 분석을 사용하여 인간의 내피 - 주연 세포 상호 작용의 생체 내 연구에

이 생체 내 매트릭스 겔 분석의 전반적인 목표는 내피 세포와 기생충의 상호 작용을 조사하는 것입니다. 이 마트리겔 분석법은 연구자가 안드로 제네시스의 주요 단계를 연구하는 데 도움이 되도록 설계되었습니다. 또한 혈관 형성의 주요 단계를 담당하는 신호 경로와 기능 장애가 혈관 장애 및 기타 남성 형성의 이상을 유발할 수 있는 유전자를 식별할

이 기술의 주요 장점은 내피 세포와 그 지지 세포인 주피세포를 모두 포함하는 생체 내 혈관 형성을 연구할 수 있다는 것입니다. 먼저 100mm 플레이트에서 10ml의 적절한 배지로 인간 내피 및 기생충 세포 배양을 성장시킵니다. 세포가 80% 포화도에 도달할 때까지 2-3일마다 배지를 교체하십시오.

세포와 섞이기 위하여 모체 젤 해결책을 준비하기 위하여는, 4 섭씨 온도에 모체 젤의 주식을 밤새 녹입니다. 그런 다음 1.5ml의 분취액을 만들어 섭씨 영하 20도에서 장기간 보관하거나 섭씨 4도에서 최대 2주 동안 보관합니다. 각 실험용 플러그에는 200마이크로리터의 매트릭스 젤이 필요합니다.

따라서 하나의 재고가 있는 튜브는 6개의 플러그에 25% 초과분을 공급할 수 있습니다. 15마이크로리터의 해동된 100x beta-FGF 스톡을 추가하여 사용할 각 필요한 부분 표본을 준비합니다. 피펫팅을 통해 beta-FGF를 용액에 혼합한 다음 세포를 추가하기 전에 최소 30분 동안 얼음에서 배양합니다.

이 시점에서 주사를 맞을 28게이지 1cc 인슐린 주사기를 식히십시오. 배양 플레이트에서 세포를 수집하려면 배지를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. PBS를 제거한 후 트립신 용액 1ml를 넣고 플레이트를 1분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.

그런 다음 플레이트 위에 2ml의 배양 배지를 피펫으로 씌워 세포를 분리하고 배지를 15ml 튜브에 모읍니다. 이제 혈구계를 사용하여 수집품의 농도를 확인하십시오. 그런 다음 15ml 튜브에 세포의 부분 표본을 준비합니다.

100만개의 내피 세포와 200, 000개의 기생충의 조합이 실험 그룹에 사용됩니다. 다음으로, 세포 분취액을 400g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 계산된 부피의 매트릭스 겔을 세포 펠릿에 추가하고 기포를 주입할 수 없으므로 거품이 생성되지 않도록 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다.

이제 쥐가 주사할 준비가 될 때까지 얼음 위에 준비물을 보관하십시오. 이소플루란으로 마우스를 마취하고 발가락 꼬집기로 마취 상태를 확인한 후, 이소플루란을 공급하는 비재호흡 시스템에 마우스를 부착하고 복부 쪽이 아래로 향하게 하여 가열 패드에 놓습니다. 이제 양쪽 측면 뒷부분에서 약 1제곱센티미터의 털을 제거합니다.

그런 다음 70% 알코올을 사용하여 노출된 피부를 깨끗이 닦습니다. 다음으로, 준비된 세포 용액 1ml를 냉각 주사기에 넣으면 4개의 플러그에 충분합니다. 주사를 놓으려면 등 피부를 들어 올려 피하 공간을 찾습니다.

그런 다음 흉곽 후방의 피하 공간에 200 마이크로 리터를 천천히 골고루 주입하고 천천히 바늘을 제거하여 누출을 방지합니다. 주입 후 해당 부위에 융기가 형성됩니다. 알코올로 부위를 닦은 다음 나중에 찾을 수 있도록 영구 마커로 범프의 윤곽을 그립니다.

그런 다음 마우스 반대쪽에서 주입 절차를 반복합니다. 3분 이내에 모든 세포를 주입하지 않으면 주사기에 달라붙기 시작합니다. 주입 단계는 매트릭스 젤 플러그가 피부와 근육층 사이에 형성되어 플러그가 양호한 모양을 유지하고 확산되지 않도록 하는 것이 중요합니다.

다음 마우스 주입을 진행하기 전에 주입된 마우스를 1분 동안 열 패드에 그대로 두어 매트릭스가 겔화될 시간을 줍니다. 안락사 후 작동 단계에서 마우스를 설정하십시오. 주사 부위에서 다시 자란 모발을 제거한 후 플러그의 위치를 식별하는 마커 라인을 찾으십시오.

그런 다음 미세한 수술용 가위를 사용하여 플러그의 표시된 경계를 따라 피부에 수직으로 그리고 그 아래 근육까지 절개합니다. 표시된 테두리의 주변을 조심스럽게 자릅니다. 그런 다음 플러그를 제거하여 피부와 근육층 사이에 끼워 놓습니다.

즉시 PBS의 작은 비커로 플러그를 헹구어 혈액을 제거하십시오. 그런 다음 전체 플러그를 50ml 튜브에 25ml의 4% 파라포름알데히드가 들어 있습니다. 흔들림 없이 실온에서 24시간 동안 고정하십시오.

다음날 플러그를 25 밀리리터의 70 % 에탄올로 24 시간 동안 옮깁니다. 그런 다음 파라핀 포매를 진행합니다. 내피 세포만 포함하는 마개 절편은 일부 혈관이 생체 내에서 14일 후에 숙주의 혈액으로 관류되지 않음을 보여줍니다.

대조적으로, 내피 세포와 기생충을 모두 포함하는 플러그는 생체 내에서 14일 후에 많은 관류 혈관을 나타냅니다. 이 플러그에는 녹색으로 보이는 CD31 양성 내피 세포에 바로 인접한 빨간색으로 표시된 평활근 액틴 염색에 양성인 세포가 있습니다. 따라서 기생충은 초기 혈관 형성에 상당한 역할을 할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 여러 세포 유형에서 사용되는 혈관 형성을 연구하기 위해 이 강력한 생체 내 기술을 적용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 연구자들이 마우스 모델에서 혈관 생물학의 다양한 주제를 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다. 이 절차에 따라 정량적 PCR 및 서부 면역 블로팅과 같은 다른 방법을 실행하여 유전자 발현 및 단백질체학의 변화와 같은 추가 질문에 답할 수도 있습니다.

이 강력한 기술을 통해 연구자는 혈관 형성 중에 내피 세포와 기생충이 어떻게 상호 작용하는지 생체 내에서 연구할 수 있습니다. 이는 남성발생의 핵심 단계입니다. 이 강력한 기술을 통해 연구자는 폐 고혈압과 같은 혈관 질환을 이해하는 것과 관련된 다른 세포-세포 상호 작용을 연구할 수도 있습니다.