후보 인자 젖 구슬과 결합하여 불 침투성 장벽의 응용 프로그램은 병아리에서 유도 신호를 공부하기

본 외과적 중재의 목적은 신호 분자가 내측 조직에서 외측판 중배엽 세포로 확산되는 것을 방지하고 이것이 유전자 발현에 미치는 영향을 연구함으로써, 병아리 배아의 사지 유도 메커니즘을 규명하는 것입니다. 이 방법은 사지 싹 시작을 조절하는 유도 신호는 무엇인가와 같은 발생 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 병아리 배아가 외과적 조작이 가능하고 매우 강건하며, 추가적으로 수술하지 않은 반대측 대조군 사지 싹이 매우 유용한 내부 대조군 역할을 한다는 점입니다.

Susan Wilde가 절차를 시연하겠습니다. 먼저, 두께 0.013 mm의 알루미늄 호일을 1 cm 정사각형 모양으로 자르고 70% ethanol로 닦아 멸균합니다. 그런 다음, 이 정사각형 조각을 6 cm 멸균 플라스틱 페트리 접시 위에 놓습니다.

정전기 부착을 방지하려면 덮개를 버리고 동일한 호일로 접시용 덮개를 새로 만듭니다. 다음으로, 배양 접시를 1.6배 배율로 설정된 쌍안 현미경 아래의 스테이지 그라티큘 위에 놓습니다. 15번 메스 날을 사용하여 호일을 너비 1.3 mm, 길이 2 mm의 조각으로 자릅니다.

4번 시계 제작용 핀셋 두 쌍을 사용하여 호일 스트립을 분리합니다. 그 다음, 호일 장벽 중앙을 직각으로 구부려 힌지와 유사한 형태로 만듭니다. 배양 접시 중앙에 장벽들을 정렬하되, 한쪽 면은 접시에 밀착시키고 다른 쪽은 접시 밖으로 위를 향하게 배치하며, 실험 당일 전까지 20개 이상의 장벽을 미리 준비해 둡니다.

디쉬 위에 알루미늄 호일 덮개를 덮고, 배리어들이 방해받지 않는 곳에 보관하십시오. 달걀을 옆으로 눕힌 상태에서, AA형 강한 핀셋을 단단히 잡고 다른 한 손으로 달걀을 고정한 채, 공기 주머니가 있는 달걀의 뭉툭한 끝부분을 제어된 찌르기 동작으로 뚫습니다. 이때 내부 껍질 막이 확실히 파손되었는지 확인하십시오.

다음으로, 양손으로 알을 잡고 수평축을 따라 180도 회전시킵니다. 그 다음, 약 5 cm 정사각형 크기의 투명 테이프를 준비하여 알의 가장 윗면에 밀착시켜 붙임으로써, 알을 열 때 난각 조각이 배아 위로 떨어지는 것을 방지합니다. 곡선 가위를 사용하여 알의 가장 윗부분 중앙의 껍데기와 연결된 내부 세포막을 조심스럽게 뚫습니다.

가위 날 하나를 사용하여 배아 위쪽으로 공기가 들어갈 수 있도록 알에 아주 작은 구멍을 냅니다. 가위를 사용하여 껍질의 구멍을 지름 약 1 cm의 원형으로 넓힙니다. 껍질에서 분리된 이 조각을 제거합니다.

약 5 cm 정사각형의 투명 테이프로 알의 구멍을 덮습니다. 테이프의 나머지 부분은 떼어내기 쉽게 두고, 구멍의 가장자리 부분만 눌러서 고정합니다. 이렇게 하면 나중에 자유로운 테이프 부분을 잡아 알의 밀봉을 쉽게 해제할 수 있습니다.

인큐베이터에서 15단계 배아를 꺼내 3.2배 이상의 배율로 설정된 실체 현미경 아래의 알 받침대에 놓습니다. 그런 다음, 상단의 투명 테이프 층을 제거합니다. 스틸 마이크로 나이프를 사용하여 배아 오른쪽의 26~32번 체절에 인접한 난황막과 외측 판 중배엽을 절개합니다.

5번 마이크로 포셉을 사용하여 배리어의 한쪽 끝을 집어 올린 후, 배리어를 비틀어 자유단(free end)을 절개 부위 속으로 삽입합니다. 가능한 한 빨리 투명 테이프로 알을 밀봉하여 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 배리어와 함께 비즈를 삽입하려는 경우, 먼저 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 레티노산(retinoic acid)에 적신 비즈를 준비합니다.

다음으로, 비드와 5번 마이크로 핀셋을 사용하여 절개 부위의 원위측에 있는 외측 판중배엽의 절단면에 비드를 삽입합니다. 그 후, 비드의 근위측 절개 부위에 배리어를 삽입합니다. 난자를 밀봉하고 즉시 인큐베이터로 되돌립니다.

장벽 없이 비드를 삽입하려는 경우에는 긴 절개를 하지 마십시오. 대신, 비드를 배치할 위치의 난황막을 통해 측판 중배엽까지 작은 절개를 만듭니다. 그런 다음 비드와 5번 마이크로 포셉을 사용하여 측판 중배엽의 구멍 안으로 비드를 삽입하십시오.

포셉의 닫힌 끝부분을 사용하여 이를 조금 더 밀어 넣습니다. 인큐베이터에서 윈도우 처리된 stage 10 배아를 꺼내어, 3.2배율 또는 그 이상의 배율로 설정된 실체 현미경 아래의 에그 레스트(egg rest)에 알을 놓습니다. 그다음, 스틸 마이크로 나이프를 사용하여 배아 꼬리 쪽 원시선(primitive streak)의 외측이자 체절(somite)과 일직선이 되는 지점에서 난황막(vitelline membrane)과 외측판 중배엽(lateral plate mesoderm)을 따라 체절 약 6개 길이만큼 절개합니다.

다음으로, 5번 마이크로 핀셋을 사용하여 페트리 접시 밖으로 돌출된 배리어 끝부분을 잡고, 손목을 비틀어 배리어의 자유단을 절개 부위에 삽입합니다. 가능한 한 빨리 투명 테이프로 알을 밀봉하여 인큐베이터로 되돌립니다. 배리어 없이 비드를 삽입하려는 경우에는, 비드가 놓일 위치의 난황막을 통해 측판 중배엽까지 작은 절개를 냅니다.

그 다음, 비드와 5번 마이크로 포셉을 사용하여 측판 중배엽의 구멍에 삽입합니다. 마지막으로 포셉의 닫힌 끝부분을 이용해 약간 더 밀어 넣습니다. 여기에는 15단계 배아의 체절 26-32에 해당하는 다리 예정 부위의 배리어 위치가 표시되어 있습니다.

이러한 장벽으로 인해 수술한 쪽의 다리싹 부위에서는 Fhf10과 Fhf8 발현이 모두 나타나지 않았으나, 수술하지 않은 왼쪽에서는 발현되었습니다. 그러나 수술한 쪽에서도 stage 19와 stage 23 모두에서 Tbx4 발현이 관찰되었습니다. 이는 Tbx4 발현 단독으로는 lpm에서 뒷다리 성장을 유도하기에 충분하지 않음을 시사합니다.

레티노산(retinoic acid)을 흡수한 비드를 15단계의 장벽 원위부에 배치하면, Tbx4, Fgf10 및 Fgf8이 왼쪽 대조군 쪽과 마찬가지로 수술한 쪽에서도 모두 발현됩니다. 따라서 정상적인 발달 과정에서, 사지 싹(limb bud)의 성장이 시작되기 전에는 체절(somites)로부터 나오는 레티노산이 필수적입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 불투과성 장벽과 후보 인자를 흡수한 비드를 사용하여 닭 배아에서 유도 신호가 사지 싹의 개시를 어떻게 조절하는지 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.