Name: 후보 인자 젖 구슬과 결합하여 불 침투성 장벽의 응용 프로그램은 병아리에서 유도 신호를 공부하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 배우세요 병아리 배아에서 수술적 장벽과 후보 인자 구슬을 이용한 사지 유도 신호 연구 방법을. Tbx4, Fgf10, Fgf8 유전자 발현 분석을 통해 발달 생물학의 핵심 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

우리는 병아리 배아 사지 싹 형성을 방지하는 불 투과성 장벽의 사용을 설명한다. 이 기술은 중요한 단계들을 갖는다. 예비 실험에 따라, 우리는 9에 사용 된 경첩 모양의 장벽, 10 직선 장벽보다 훨씬 더 나은 배아에 그대로 남아 있음을 발견했다. 장벽의 말단 평평한면은 난황 막에 스틱과 장소 (그림 2C &#39;)의 장벽을 유지합니다. 프로토콜 단계 1.6에 기재된 바와 같이 알루미늄 박의 힌지 형 장벽 조심 준비 동작의 성공에 필수적이다. 두 번째 중요한 단계는 계란이 너무 오래 윈도우를 다음과 배아에서 작동하기 전에 준비를위한 인큐베이터에서 제외되지 않도록하는 것입니다. 우리의 경험에서, 배아는 동작이 수행되는 때까지 또는 배양 온도는 근처에있는 경우 동작 더 생존. 따라서 작업 가능한 빨리 수행되어야하고 계란 프롬프트를 재 밀봉LY 좋은 생존율을 보장합니다. 많은 연구자들은 인큐베이터에 달걀을 반환하기 전에 미세 다음 배아에 항생제의 드롭을 추가합니다. 액체의 존재는 위치에 잘 붙지 장벽을 막았다. 항생제의 추가도 배치 후 구슬을 제거 할 수 있습니다. 따라서 항생제, 빠른 작업 및 악기에 좋은 청결을 사용하지 않는 것이 감염을 방지하는 것이 좋습니다. 작업의 모든 단계 다음 70 % 에탄올로 악기를 닦기 (프로토콜 단계 3.1.2.2 참조) 장벽 또는 구슬 모두 집게에 부착시킬 수있는 난황 막과의 접촉에서 스티커가되는 계기를 방지하기 위해 필수적이다. 사용하는 구슬의 두 종류가 작업 다음과 같은 장소에서 떨어질 수 있습니다. 배리어 위치 다음날 체크되었을 때 비드이 제자리에 남아 있는지 여부를 확인하기 위해 장벽을 볼 수 없었다. 비드 밖으로 떨어진 경우에 날개 꽃 봉오리 가지가 구출되지 않았다 ( <st룽&gt; 표 1). 를 주입 할 때 비드와 액체를 전송 피하는 것은 구슬 (프로토콜 2.3.2.3 참조) LPM의 절단면에 더 쉽게 스틱 것을 의미한다. 마지막 배아 수확 좋은 후속 유전자 발현 분석에 중요 직후 고정되는 것을 보장 (프로토콜 단계 4.2 참조). 이 프로토콜은, 사지 꽃 봉오리 개시를 방지하기 위해 장벽을 사용 이전에 발행 된 실험을 수정 장벽에 대한 특정 최적의 폭을 정의하고 유전자 발현 분석 한 다음 결합 장벽 비드 위치를 소개합니다. 우리는 저렴하고 모든 실험실에서 쉽게 사용할 기존의 알루미늄 호일을 사용하여 발견, 이전에 탄탈륨 포일을 사용하는 것과 동일한 결과를 생성합니다. 호일 계내 혼성화 (도 2C &#39;)에서 수행 할 때 배아에 남아 있지만, 하나 이상의 배아 배아 손상 포일의 날카로운 모서리를 방지하기 위해 처리되는 경우, 우리는 일반적으로 제거 될 수있다. 피ILOT 연구 레그 영역 장벽의 폭이 특히 중요하다는 것을 보여 주었다. 처음 평가판을 장벽이 너무 짧습니다되었고 다리 버드 파생물을 방지하지 않았다. 1.2-1.3 mm 완전히 다리 꽃 봉오리 가지를 차단하는 장벽에 대한 최적의 폭이다. 하나 정확하게 배치 할 수있는 좁은 날개 장벽은 꽃 봉오리 가지가 가장 생존율을 줄 방지합니다. 이것은 0.5 내지 0.7 mm만큼 좁아 질 수있다. 그러나, 조금 더 넓은 장벽 (우리는 0.7-1 mm를 사용)가 배치 약간의 부정확성을 허용하기 때문에 날개 꽃 봉오리 가지의 완전한 차단이 발생할 가능성이 더 높습니다. 혈관의 회피는 때 절개를 만드는 것은 날개 꽃 봉오리 수준의 장벽 중요합니다. 반 투과 장벽은 이전에 병아리 사지 꽃 봉오리를 양분하는 데 사용되었다. MacCabe과 파커, 1976 Summerbell 1979 년 모두 사용되는 필터는 각각 0.45 μm의 0.8 μm의 기공 크기, 16, 17. 그들은 확산 신호가 필터 및 그 구멍을 통과 할 수 있다고보고결과는 반 투과 장벽이 불 침투성 탄탈 박 장벽없이 존재하는 장벽과 하나 사지 꽃 봉오리 사이의 중간이었다 사용되었습니다. 이 프로토콜은 크기 나 확산 신호의 동적을 수정하는 기초 후보 신호를 구별하기 위해 다양한 기공 크기의 반 투과 장벽을 사용하도록 구성 될 수있다. 이 프로토콜은 주로 모델 생물 자체와 관련된 다양한 제한 사항이 있습니다. 이러한 기술은 사지 개발에 추가 질문도 척추 동물 배아의 다른 질문을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 단은 병아리 배아 개입에 액세스 할 때 해당 기관 / 지역 개발해야한다는 것입니다. 장벽이 배치 될 필요가있는 영역의 큰 혈관의 존재는 차단 위치 이후 단계 13 또는 14보다 기술적 도전한다. 큰 혈관 장벽 배치하는 동안 절단하는 경우이 태아 사망의 원인이 될 수 있습니다. 전사가 T 요인을 때의 조사bx5 및 Tbx4가 먼저 LPM에 유도는 우리가 나중에 각각 반대 하나 날개 또는 다리 새싹을 끝낼 것 장벽을 배치 할 수있는 초기 단계에 의해 제한되었다. 낭배에 가까운 초기 단계에서 TBX 유전자 도입을 차단하는 시도를 조명 할 수있다. 초기 배리어가 추정 윙 영역에 배치 될 수 성공적 스테이지 (8)이었고, 이후의 급속한 성장은 배리어 결과를 변위 때문에 다리 영역 스테이지 (10)에서이 프로토콜은 아마도 사지 싹 단계 이후의 유전자 발현 연구에 적합하지 않다 단지 배리어의 초기 위치에 관한 것이다. 이러한 맥락에서 병아리 배아의 한계를 관련하는 데, 다른 척추 동물 모델 생물을 통해 그 장점이 많다. 병아리 배아는 척추 동물 배아의 물리적 간섭이 유형의 매우 적합한 동물 모델이다. 배아 비교적 크고 throu 쉽게 접근달걀 껍질을 GH. 하나는 추가 실험을위한 배아로 돌아갈 수 있습니다 (예를 들면, 비드 (18) 또는 장벽의 제거) 또는 단순히 테이프 창을 제거하여 진행 상황을 확인. 라이브 영상 또는 시간 경과 영상을 포함 가능 범위가 있습니다. 우리는 특히 초기 단계의 배아에서 작동에 적합 닭 계란을 윈도하는 방법을 설명합니다. 사지 연구의 경우에 각 생물학적 복제 이상적인 내부 대조군으로서 작용 각 실험에 대한 반대측 제어 사지가 매우 중요하고 유용하다. 신호 분자에 침지 사지 가지 비즈 않도록 투과성 장벽을 이용하는 조합은 이전에보고되지 않았다. 이러한 개입을 다음과 mRNA 발현의 우리의 분석은 또한 소설이다. 이러한 기술은 사지 특정 전사가 Tbx5 및 Tbx4도 LPM에 유도하는 요인 때의 어려운 문제를 해부 할 수있게이상, 종래 새싹 개시 사지 것을 보여주기 위해 상기 LPM TBX 이러한 유전자의 존재 Fgf10 전사의 활성화 및 사지 싹 생장 개시 충분하지 않다. 2G, 2D 및 2E는 또한 이러한 결과를 도시한다. 그림 2G에서 스테이지 (10)에서 장벽의 삽입 다음 Tbx4 식의 부재는 Tbx4의 유도 후, 단계 15에서 장벽 삽입 다음 2D 및 2E에서 자신의 존재에 대한 대조적이다. RA 배어 구슬의 주입 장벽 삽입 및 사지 꽃 봉오리 가지 시작하기 전에 LPM에 필수 인 somites에서 RA 너무 포인트를 다음과 사지 버드 개시의 구조를 촉진. 이러한 기술은 사지 개발에 더 질문뿐만 아니라 척추 동물 배아의 다른 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 뇌, 눈과 트렁크의 분야 적합 할 것으로 보인다.

고전 발생 학자들은 전통적으로 배아 발달을 조절하는 메커니즘을 심문하는 물리적 인 기술을 사용. 1960 년대와 1970 년대 연구자들은 배아 동안 유도 신호의 중요성을 보여주기 위해 개발 배아의 조직 사이에 삽입 불 투과성 장벽을 사용하는 기술을 개발했다. 우리의 관심은 사지 꽃 봉오리 가지를 앞에 어떤 이벤트 척추 사지 개발에 특히입니다. 예를 들어, 배리어 삽입는 반대측, 작동이되지 않는 측에서 정상적으로 진행시키면서 병아리 배아의 한쪽에 발생하는 사지 싹 생장을 방지 할 수있다. 이러한 장벽을 변화하기 위해 사용 재료; 예를 들어, 운모 판 (1) 및 탄탈륨 호일이. 이 장벽은 효과적으로 somites에서 사지 꽃 봉오리 형태, 근축 중배엽에서 형성되는 측면 판 중배엽 (LPM)를 분리합니다. 외과 이식 기술은 가까운 관계 위트를 보여사지 꽃 봉오리 개시가 LPM 3 사에서 발생하는 경우 시간이 somites이 필수적이다. 80 년대와 90 년대에 발달 생물 학자들은 발달 과정을 조절하는 필수적인 신호 분자 확산을 발견했다. 이러한 신호 전달 분자와 적신 비즈는 배아의 특정 지역에 이식 및 배아 발달에 변화를 생성 할 수 있습니다. 병아리 배아 주입 및 숫자 5의 거울상 중복을 생성 할 때, 예를 들어, 이온 교환 비드 차지하는 레티노 산 (RA)가 24 시간에 걸쳐 방출된다. FGF 단백질을 함유 헤파린 아크릴 구슬은 interlimb의 LPM 6에서 사지 꽃 봉오리 가지를 시작할 수 있습니다. 최근에 마우스와 물고기 유전학 (7 검토) 새로운 시대로 척추 사지 개시의 연구를 수행하고있다. 사지 싹 개시 전의 somites에서 RA 존재는 LP에 필요한 필수적인 확산 신호 인 것이 좋은 증거가있다M은 사지 신진를 시작합니다. 우리는 사지 꽃 봉오리 개시시 주변의 LPM에서 유전자 발현에 장벽 주입의 효과를 해부하는 병아리 배아의 접근성과 실험 견고성을 악용하고 싶었다. 우리의 방법의 새로운 적응은 장벽을 결합하는 것입니다 장벽에 의해 차단 된 외생 적 공급 후보 내생 적 요인 장벽에 비드 배치 측면과 축 조직에서 블록 신호. 다음 프로토콜은 사지 봉오리 유도 및 개시의 메커니즘을 애타게하기 위해 개발 된 것들이다. 사지 꽃 봉오리 개시를 공부하는 것은 초기 단계의 배아를 사용하는 것을 의미한다. 먼저 피하 주사 바늘로 공기 주머니를 통해 알부민의 일부를 제거하여 많은 연구자 창 닭고기 달걀. 노른자의 상단에 놓여 배아는 다음 계란에 낮은 거짓말을합니다. 이는 전기 일부 기술에 대한 장점이지만, 배아 수술 조작을 원하는 경우 단점이 될 수있다.가능이 장점으로 우리는 계란의 구멍에 가까운 배아를 갖는 찾을 수 있습니다. 질문은 척추 동물의 사지 꽃 봉오리 유도 및 개시를 제어하는 ​​신호에 대한 남아 다음과 같은 프로토콜은이를 해결하기 적합하다. 우리는 초기 단계 (12) (8)보다 단계에서 병아리 다리 버드 파생물을 방지하기 위해 장벽의 삽입을위한 프로토콜을 개발하는 첫 번째입니다. 이러한 프로토콜의 수정 된 버전은 또한 primordium가 유도되는에 접근 유도부 조직이 인접한 자리하고있는 곳 기원과 유도 단서의 타이밍에 다른 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 배아의 지역 관련 개발 단계에서 액세스 제공, 다음 장벽은 공부 두 조직 및 개발 결과의 변화 사이에 배치 될 수있다. 예를 들면, 간 또는 신장 유도 뇌 발달 축 확장 가능성이 장기 개발에서 발견 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Dumont No. 5 워치메이커 집게, x2</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 4 워치메이커 집게, x2</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>www.finescience.de 11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 강력한 집게, AA형</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>11210-10</td><td></td></tr><tr><td>2.5cm 길이의</td> <td>칼날이 있는 곡선형 가위고급 과학 도구&nbsp; www.finescience.de</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>무딘 끝의 곡선 펜치, 끝 약 0.5&nbsp; cm 길이의</td><td>Fine Science Tools www.finescience.de</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>스틸 핀, 0.2mm 너비</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>숫돌, 사각형</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>투명 테이프, 50 mm x 66&nbsp; m</td><td></td><td>www.5staroffice.com 295985</td><td></td></tr><tr><td>FGF4 단백질</td><td></td><td></td><td>Cliff Tabin의 선물.</td></tr><tr><td>모든 트랜스 레티노산</td><td>시그마 www.sigmaaldrich.com</td><td>R2625-50MG</td><td>빛으로부터 보호하는 것을 잊지 마십시오.</td></tr><tr><td>BMS 493</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>B6688-5MG</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드 No. 15</td><td>www.swann-morton.com</td><td>cat no. 0105</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Blue, 친화 크로마토그래피 젤</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>153-7301</td><td>단백질 전달용 비드.</td></tr><tr><td>AG1-X2 이온 교환 수지</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>140-1251</td><td>RA 또는 BMS 493 전달용 비드.</td></tr><tr><td>계란 부화기</td><td>Memmert www.hce-uk.com</td><td>LAB128</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>시그마 www.sigmaaldrich.com</td><td>P6148-1KG</td><td>유해하고 자극적이며 부식성이 있습니다. 완전한 보호복으로 연기가 나는 곳에서 분말을 처리하십시오.</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마 www.sigmaaldrich.com</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도</td>당 <td>Gibco www.thermofisher.com</td><td>41965-039</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드 (DMSO)</td><td>Fisher Scientific webshop.fishersci.com</td><td>D/4121/PB08</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>쌍안 현미경&nbsp;</td><td>라이카 www.leica-microsystems.com</td><td>MZ6</td><td>M60</td></tr><tr><td>닭고기 달걀</td>로 교체 <td>Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com</td><td></td><td>갈색 달걀</td></tr></tbody></table>

후보 인자 젖 구슬과 결합하여 불 침투성 장벽의 응용 프로그램은 병아리에서 유도 신호를 공부하기

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

병아리 배아은 직접 방식으로 개발 질문을 해부하는 데 사용할 수있는 최상의 척추 동물 모델을 제공합니다. 수술 적 치료 다음의 접근성과 안정성이 중요한 실험의 강점이다. 운모 판 병아리 사지 싹 개시 한 것을 방지하기 위해 사용되는 제 장벽이었다. 날개 꽃 봉오리 또는 다리 꽃 봉오리 유도 또는 개시에 불 투과성 장벽으로 알루미늄 호일을 사용하여 프로토콜 설명한다. 우리는 장벽에 의해 차단 된 공급 후보 내생 적 요인을 외생하는 장벽에 비드 배치 측면과이 기술을 결합합니다. 결과는 다음 유전자 발현 원위치 혼성화에 사용하여 분석된다. 우리의 주요 초점은 유도에서 레티노 산 신호와 병아리 배아 앞과 뒷다리 이후 개시의 역할이다. 우리는 BMS (493) 사용 (레티노 산 수용체의 역작용을 (RAR)) 측면 판 중배엽 (LPM) 이식 불린 비드 바의 영향을 모방rier somites (레티노 산의 소스 (RA)) 및 사지 싹이 자라는에서 LPM 사이에 위치. 이러한 프로토콜의 수정 된 버전은 또한 유도 큐의 기원 및 다른 시점에 질문을 해결하기 위해 사용될 수있다. 병아리 배아의 지역 관련 개발 단계에서 액세스 제공, 장벽은 공부 두 조직 및 개발 결과의 변화 사이에 배치 될 수있다. 예를 들면, 간 또는 신장의 유도로, 현상 뇌 축 확장 및 개발 기관에서 발견 될 수있다.

위에서 설명한 프로토콜은 니시 모토 등의 알에 사용 된 방법을 설명합니다. 2015 년 논문은 전면과 병아리 배아의 뒷다리 모두 사지 꽃 봉오리 유도 및 개시를 연구합니다. 앞다리 새싹의 생장을 방지하기 위해 불 침투성 장벽의 삽입 다음과 같은 결과는 이전 1, 2, 9을 발표되었지만 다리 버드 개시 1을 방지 단 하나의 연구 기술 장벽이되고있다. 니시 모토 등의 알에서 뒷다리 데이터입니다. 2015 년은 장벽 삽입 다음 mRNA 발현의 연구의 대표적인 결과로 여기에 표시됩니다. LPM에서 Tbx4 표현은 뒷다리 파생물을 시작하기에 충분하지 않습니다 : 도 2B와 C (표 2) 단계 15 (그림 2A)에서 그 장벽 삽입을 보여 모두 Fgf10 리드 (프로토콜 3.2 참조)및 Fgf8 표현은 운영 오른쪽에 (괄호로 표시) 다리 새싹 지역의 결석. 작동이되지 않는 왼쪽 비교. 그러나 Tbx4 식은 조작 측 (도 2D 및 E)의 양 단 (19)과 스테이지 (23)에서 관찰된다. 우리는 혼자 Tbx4 표현은 LPM에서 사지 파생물을 시작하기에 충분하지 않습니다 결론 지었다. 병아리의 다른 연구 TBX 유전자 발현은 앞다리 봉오리 형성 (12, 13)을 개시하기에 충분한 것을 제안했다. 도 2c는 &#39;장벽이 배아 포스트 고정의 다리 부분에 새겨 져 보이는 방법을 설명하기 위해 포함되어 있습니다. 경우 장벽의 대부분에서 사전 현장 하이브리드 (프로토콜 4.3)의에 제거 하였다. Somites에서 RA는 Fgf10 유도 사지 버드 O 전에 LPM 필수적이다utgrowth : 도 3A는 스테이지 (15) (프로토콜 3.2.1.3)에 삽입 배리어에 RA 침지 비드 선단부의 추가를 나타내는 개략도이다. (별표로 표시)이 작업 사지 꽃 봉오리 가지가 컨트롤 왼쪽에있는대로 봉오리로 표현되는 동작 오른쪽과 Tbx4, Fgf10 및 Fgf8에 관찰 이후 (그림 3B, C 및 D, 표 2) . 따라서, LPM에 RA를 첨가 배리어 사지 싹 개시 진행의 효과를 극복한다. 우리는 사지 꽃 봉오리 가지가 시작되기 전에 somites에서 정상적인 개발 RA의 LPM에 필수적이라고 결론 지었다. 얻어진 사지 싹은 제어 측보다 일반적으로 작다. 이 LPM은 야생형 상황에 해당하지 인에서 RA 용량 때문일 수 있습니다. 적경 용량이 너무 높으면 꼭대기 외배엽 릿지 (AER)를 짧게 할 수 있고 작은 싹 초래14, 15. LPM에서합니다 (somites에서) 그 RA를 확인하는 것은 정상적인 사지 꽃 봉오리 개시 RAR, BMS (493)의 역작용 필요, 사용되었다. 비즈 스테이지 (15)의 다리 지역 LPM에 주입된다 (그림 3E)을 (프로토콜 3.2.1.4 참조). Fgf10 식 제어 측 (표 3도 3f)에 비해 작은 사지 싹 결과 493 비즈 LPM에서 BMS의 다음 프로그램을 하향 조절한다. 제어 DMSO 비즈는 이러한 결함 (표 3도 3G 및 3H)를 발생하지 않습니다. BMS (493) 애플리케이션에 따라 관찰 된 결함은 배리어 조작에 의한 것보다 온화한; 즉,이 Fgf10 여전히 표현과 사지 싹이 형성된다. BMS 493의 효과가 구슬 주위에 로컬로 제한되며, AXI에 의해 생성 된 모든 RA를 적대시하지 못할 수 있기 때문 될 가능성이 높습니다등 조직. 조기 축 신호는 나중에 Tbx4 급행 LPM 셀을 지정합니다 : LPM은 미래의 다리 형성 영역에서 Tbx4을 표현하는 능력을 획득 할 때 우리는 시험했다. 장벽 이후 다리 버드 파생물을 차단하는 것 삽입 할 수있는 초기 단계는, 우리는 무대보다 이전 단계에서 근축 중배엽 및 추정 다리 사이에 삽입 (12) 장벽 장벽을 삽입하는 프로토콜을 개발 최초로 단계 10입니다 스테이지 (10)에 LPM은 스테이지 (10)의 축선 조직에서 신호의 이상 발현을 위해 필요하다는 것을 시사 블록 레그 봉오리 형성 레그 형성 LPM을에 Tbx4의 발현 (도 2F 및 2G, 표 2) (프로토콜 34 참조) 뒷다리 LPM에서 Tbx4. 나중에 장벽 삽입 Tbx4 식을 수도 2D 및 E와이 결과를 비교설립합니다. 또한, 우리는이 축 신호가 RAR의 역작용이 Tbx4 발현을 저하 여부를 관찰하여 RA가 될 수 있는지 여부를 테스트했다. 스테이지 (10) (프로토콜 3.4.1.3 참조)에서 뒷다리 LPM에 배치 BMS 493 비드 DMSO에 배어 제어 비즈 Tbx4 식 (도 2J 및 2K)에 영향을주지 않는 반면, Tbx4 식 (그림 하반기 및 2I)을 downregulates. 함께, 이러한 결과는 축 조직에서 RA 신호가 긍정적으로 뒷다리 LPM 7 Tbx4을 조절함으로써 사지 유도를 조절하는 모델을 지원합니다. 수술 후 죽음 : 표 1, 2 및 3에 게시 작업 수확 전에 사망 병아리 배아의 개수를 포함한 실험 결과의 세부 사항을 제공한다. 일부 사망이 자연 미세 후 예상하여야한다. 숫자의 죽음은 유지 될 수있다<html> 악기가 깨끗한 지 확인함으로써 최소로, 계란의 구멍은 배아이 마지막 지점 운영과 함께, 최소한의 시간에 대한 접착 테이프 인감의 보호없이 왼쪽되어, 최소 크기 필요하다 가능한 빨리 수행된다. 이러한 작업 중에 아주 많은 시간이 소요되지만 구슬과 장벽을 포함하는 작업이 좀 더 시간이 걸릴 수 없습니다. 이러한 조치에도 불구하고, 작업은 초기 단계에서 수행과 날개 지역의 사람들은 사망을 초래할 가능성이 더 높습니다. 죽음으로 인한 혈액 손실로 이어질 수있는 사지 형성 지역과 이들 선박의 사고 파열 주변의 큰 혈관이 있습니다. 우리는 계란 누구의 배아에 작동되지 않은, 종종 그 다음날에 의해 죽을 것이다 단계 8 또는 9에서 열 것을 찾을 수 있습니다. 따라서이 문제의 유일한 해결책은 실험의 높은 숫자를 수행하는 것입니다. D / 54618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; 추정 다리 수준에서 배리어 또는 구슬 삽입을 다음 그림 2. 마커 유전자 발현의 변화. (A) 단계 15 배아의 추정 다리 레벨 (somites 26-32)에서 도식 보여주는 장벽 위치 (녹색 선). (B - E 및 G) 운영 배아에 위시 분석. 다리 지역 (괄호)에 설명되어있다. (B) Fgf10 식은 작동 LPM에 존재하지만 강력한 발현 왼쪽 뇌에서 검출된다. (C) Fgf8 발현은 AER이없는 암시 상기 구동 측 부재. (C &#39;) 장벽이 제거되기 전에 동일한 배아. (D)은 제어 Tbx4 새싹 같은 rostro - 꼬리 LPM 수준에서 표현된다. (E) Tbx4 발현 사지 성장의 부재에도 불구하고 오른쪽 다리 영역에 유지된다. (F) 단계의 개략도<html> 추정 적 다리 수준에서 차단 위치 (녹색 선)를 보여주는 10 병아리 배아. (G) Tbx4 표현식은 운영 오른쪽 LPM (브라켓)에 존재하지 않는다. (H)를 추정 다리 수준에서 BMS 493 비드 위치 (보라색 원)을 보여주는 스테이지 (10) 병아리 배아의 개략도. (I) Tbx4 식 BMS 493 (J) 제어 DMSO 비드 위치 (회색 원)을 보여주는 스테이지 (10) 병아리 배아의 개략도 치료 다음 운영 오른쪽에 하향 조절된다. (K) Tbx4 단독 DMSO로 처리 추종 제어 좌측과 유사한 수준에서 작동 오른쪽에 표시된다. 이 그림은 7에서 수정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> D / 54618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3. RA 구출 사지 버드의 부재는 배리어 삽입에 의한과 다리 버드 파생물에 앞서 LPM에서 필수입니다. (A)를 추정 다리 레벨 (somites 26-32)와 RA-적신 비드 (빨간색 원)에서 차단 위치 (녹색 선)를 나타내는 개략도. (B - D) (별표로 표시) RA 구출 다리 꽃 봉오리 가지. (B) Tbx4 발현은 수술하지 않은면에 동일한 구조의 다리 뇌에 존재한다. (C) Fgf10은 구출 다리되지 않은 운영 측면과 유사한 꽃 봉 오리 표현된다. (D) Fgf8는 구출 오른쪽 다리 버드의 AER 표현된다. BMS 493 비즈 (보라색 원)가 단계 15 배아의 추정 다리 LPM에 배치 된 위치 (E) 도식을 나타낸다. (F) Fgf10 표현은 운영 오른쪽에 하향 조절하고 다리 새싹 작은 다음과 BMS 49입니다(3) 치료. 비즈는 * 표입니다. 제어 DMSO 비드 (회색 원)의 위치를 나타내는 (E) 내지 (G) 유사 개략도. (별표로 표시) (H) DMSO 비즈 Fgf10 표현이나 다리 봉오리의 크기에 영향을 미치지 않았다. 이 그림은 7에서 수정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 스테이지 장벽 배치 (+ 비드) * </td><td> 수 운영 </td><td> 날개없는 ** </td><td> 윙 본 ** </td><td> 번호 죽은 </td></tr><tr><td> 스테이지 12 ~ 14 </td><td> (40) </td><td> (24) </td><td> 1 </td><td> (15) </td></tr><tr><td> 단계 8/9 </td><td> (65) </td><td> (23) </td><td> 0 </td><td> (42) </td></tr><tr><td> 스테이지 12 ~ 13 (FGF4 비드) </td><td> (41) </td><td> 7 (비드 누락) </td><td> (17) </td><td> (17) </td></tr><tr><td> 스테이지 12 ~ 13 (RA 비드) </td><td> (75) </td><td> 9 (비드 누락) </td><td> (32) </td><td> (34) </td></tr><tr><td> 스테이지 (13) (제어 비드) </td><td> (5) </td><td> 삼 </td><td> 0 </td><td> 이 </td></tr><tr><td colspan="5"> * somites 15 ~ 20과 측면 판 중배엽 사이에 위치 0.7-1 mm 박 장벽. 0.35 ㎎ / ㎖ FGF4 비드. 0.05-0.1 ㎎ / ㎖의 RA 구슬. </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSO 제어 비드. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 병아리 배아 고정 단계 21-23 </td></tr></tbody></table> 표 1. 윙 레벨 장벽과 구슬 실험 성과. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 스테이지 장벽 배치 (+ 비드) * </TD&gt; <td> 수 운영 </td><td> 다리 누락 ** </td><td> 다리 본 ** </td><td> 번호 죽은 </td></tr><tr><td> 스테이지 12 ~ 15 </td><td> (43) </td><td> (39) </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 무대 10/11 </td><td> (23) </td><td> (16) </td><td> 0 </td><td> (7) </td></tr><tr><td> 스테이지 15 (FGF4 비드) </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> (5) </td><td> 삼 </td></tr><tr><td> 스테이지 15 (RA 비드) </td><td> (18) </td><td> 0 </td><td> (18) </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * somites 26-32과 측면 판 중배엽 사이에 0.7-1.3 mm 박 장벽. 0.35 ㎎ / ㎖ FGF4 비드. 0.05-0.1 ㎎ / ㎖의 RA 구슬. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 병아리 배아 고정 단계 18 ~ 24 </td></tr></tbody></table> 표 2. 다리 레벨 장벽과 구슬 실험 성과. <table bor데르 = &quot;1&quot;FO : 유지-together.within 페이지 = &quot;1&quot;FO : 유지 -에 - next.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <tbody><tr><td> 수 운영 </td><td> 다리는 작은 꽃 봉오리 </td><td> 다리가 약간 작은 꽃 봉오리 </td><td> 다리 새싹 정상 크기 </td><td> 번호 죽은 </td></tr><tr><td> BMS 493 구슬 * </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> (15) </td><td> (12) </td><td> 삼 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> DMSO 비즈 ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> (12) </td><td> 0 </td><td> 삼 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 5 밀리그램에 담가 2 ~ 3 구슬 / ㎖ BMS 493 다리의 수준에 적절한 단계 14 ~ 15 LPM에 위치. </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSO에 배어 ** 2-3 구슬 혼자 다리의 수준에 적절한 단계 15 LPM에 위치. </td></tr><tr><td colspan="5"> 병아리 배아 단계에서 고정 (1)7-19. </td></tr></tbody></table> 표 3. 다리 레벨 BMS 493 구슬 실험 성과.

사지 형성에 필요한 병아리 배아에서 본체 축과 측면 조직 사이의 유도 이벤트를 차단하기 위해 불침투성 장벽을 사용하는 프로토콜이 설명되어 있습니다. 후보 유도 신호에 적신 구슬은 장벽 배치의 영향을 극복하는 데 사용되며 유전자 발현 분석을 통해 이를 확인할 수 있습니다.

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

본 외과적 중재의 목적은 신호 분자가 내측 조직에서 외측판 중배엽 세포로 확산되는 것을 방지하고 이것이 유전자 발현에 미치는 영향을 연구함으로써, 병아리 배아의 사지 유도 메커니즘을 규명하는 것입니다. 이 방법은 사지 싹 시작을 조절하는 유도 신호는 무엇인가와 같은 발생 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 병아리 배아가 외과적 조작이 가능하고 매우 강건하며, 추가적으로 수술하지 않은 반대측 대조군 사지 싹이 매우 유용한 내부 대조군 역할을 한다는 점입니다.Susan Wilde가 절차를 시연하겠습니다. 먼저, 두께 0.013 mm의 알루미늄 호일을 1 cm 정사각형 모양으로 자르고 70% ethanol로 닦아 멸균합니다. 그런 다음, 이 정사각형 조각을 6 cm 멸균 플라스틱 페트리 접시 위에 놓습니다.정전기 부착을 방지하려면 덮개를 버리고 동일한 호일로 접시용 덮개를 새로 만듭니다. 다음으로, 배양 접시를 1.6배 배율로 설정된 쌍안 현미경 아래의 스테이지 그라티큘 위에 놓습니다. 15번 메스 날을 사용하여 호일을 너비 1.3 mm, 길이 2 mm의 조각으로 자릅니다.4번 시계 제작용 핀셋 두 쌍을 사용하여 호일 스트립을 분리합니다. 그 다음, 호일 장벽 중앙을 직각으로 구부려 힌지와 유사한 형태로 만듭니다. 배양 접시 중앙에 장벽들을 정렬하되, 한쪽 면은 접시에 밀착시키고 다른 쪽은 접시 밖으로 위를 향하게 배치하며, 실험 당일 전까지 20개 이상의 장벽을 미리 준비해 둡니다.디쉬 위에 알루미늄 호일 덮개를 덮고, 배리어들이 방해받지 않는 곳에 보관하십시오. 달걀을 옆으로 눕힌 상태에서, AA형 강한 핀셋을 단단히 잡고 다른 한 손으로 달걀을 고정한 채, 공기 주머니가 있는 달걀의 뭉툭한 끝부분을 제어된 찌르기 동작으로 뚫습니다. 이때 내부 껍질 막이 확실히 파손되었는지 확인하십시오.다음으로, 양손으로 알을 잡고 수평축을 따라 180도 회전시킵니다. 그 다음, 약 5 cm 정사각형 크기의 투명 테이프를 준비하여 알의 가장 윗면에 밀착시켜 붙임으로써, 알을 열 때 난각 조각이 배아 위로 떨어지는 것을 방지합니다. 곡선 가위를 사용하여 알의 가장 윗부분 중앙의 껍데기와 연결된 내부 세포막을 조심스럽게 뚫습니다.가위 날 하나를 사용하여 배아 위쪽으로 공기가 들어갈 수 있도록 알에 아주 작은 구멍을 냅니다. 가위를 사용하여 껍질의 구멍을 지름 약 1 cm의 원형으로 넓힙니다. 껍질에서 분리된 이 조각을 제거합니다.약 5 cm 정사각형의 투명 테이프로 알의 구멍을 덮습니다. 테이프의 나머지 부분은 떼어내기 쉽게 두고, 구멍의 가장자리 부분만 눌러서 고정합니다. 이렇게 하면 나중에 자유로운 테이프 부분을 잡아 알의 밀봉을 쉽게 해제할 수 있습니다.인큐베이터에서 15단계 배아를 꺼내 3.2배 이상의 배율로 설정된 실체 현미경 아래의 알 받침대에 놓습니다. 그런 다음, 상단의 투명 테이프 층을 제거합니다. 스틸 마이크로 나이프를 사용하여 배아 오른쪽의 26~32번 체절에 인접한 난황막과 외측 판 중배엽을 절개합니다.5번 마이크로 포셉을 사용하여 배리어의 한쪽 끝을 집어 올린 후, 배리어를 비틀어 자유단(free end)을 절개 부위 속으로 삽입합니다. 가능한 한 빨리 투명 테이프로 알을 밀봉하여 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 배리어와 함께 비즈를 삽입하려는 경우, 먼저 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 레티노산(retinoic acid)에 적신 비즈를 준비합니다.다음으로, 비드와 5번 마이크로 핀셋을 사용하여 절개 부위의 원위측에 있는 외측 판중배엽의 절단면에 비드를 삽입합니다. 그 후, 비드의 근위측 절개 부위에 배리어를 삽입합니다. 난자를 밀봉하고 즉시 인큐베이터로 되돌립니다.장벽 없이 비드를 삽입하려는 경우에는 긴 절개를 하지 마십시오. 대신, 비드를 배치할 위치의 난황막을 통해 측판 중배엽까지 작은 절개를 만듭니다. 그런 다음 비드와 5번 마이크로 포셉을 사용하여 측판 중배엽의 구멍 안으로 비드를 삽입하십시오.포셉의 닫힌 끝부분을 사용하여 이를 조금 더 밀어 넣습니다. 인큐베이터에서 윈도우 처리된 stage 10 배아를 꺼내어, 3.2배율 또는 그 이상의 배율로 설정된 실체 현미경 아래의 에그 레스트(egg rest)에 알을 놓습니다. 그다음, 스틸 마이크로 나이프를 사용하여 배아 꼬리 쪽 원시선(primitive streak)의 외측이자 체절(somite)과 일직선이 되는 지점에서 난황막(vitelline membrane)과 외측판 중배엽(lateral plate mesoderm)을 따라 체절 약 6개 길이만큼 절개합니다.다음으로, 5번 마이크로 핀셋을 사용하여 페트리 접시 밖으로 돌출된 배리어 끝부분을 잡고, 손목을 비틀어 배리어의 자유단을 절개 부위에 삽입합니다. 가능한 한 빨리 투명 테이프로 알을 밀봉하여 인큐베이터로 되돌립니다. 배리어 없이 비드를 삽입하려는 경우에는, 비드가 놓일 위치의 난황막을 통해 측판 중배엽까지 작은 절개를 냅니다.그 다음, 비드와 5번 마이크로 포셉을 사용하여 측판 중배엽의 구멍에 삽입합니다. 마지막으로 포셉의 닫힌 끝부분을 이용해 약간 더 밀어 넣습니다. 여기에는 15단계 배아의 체절 26-32에 해당하는 다리 예정 부위의 배리어 위치가 표시되어 있습니다.이러한 장벽으로 인해 수술한 쪽의 다리싹 부위에서는 Fhf10과 Fhf8 발현이 모두 나타나지 않았으나, 수술하지 않은 왼쪽에서는 발현되었습니다. 그러나 수술한 쪽에서도 stage 19와 stage 23 모두에서 Tbx4 발현이 관찰되었습니다. 이는 Tbx4 발현 단독으로는 lpm에서 뒷다리 성장을 유도하기에 충분하지 않음을 시사합니다.레티노산(retinoic acid)을 흡수한 비드를 15단계의 장벽 원위부에 배치하면, Tbx4, Fgf10 및 Fgf8이 왼쪽 대조군 쪽과 마찬가지로 수술한 쪽에서도 모두 발현됩니다. 따라서 정상적인 발달 과정에서, 사지 싹(limb bud)의 성장이 시작되기 전에는 체절(somites)로부터 나오는 레티노산이 필수적입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 불투과성 장벽과 후보 인자를 흡수한 비드를 사용하여 닭 배아에서 유도 신호가 사지 싹의 개시를 어떻게 조절하는지 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

성장 요인과 단백질의 다양한 세포가 개발하는 동안 다른 세포 운명을 맡을 유도하는 상호 작용. 여기 E2.5 여자의 배아에 구슬을 배치하여 개발에 서로 다른 단백질 간의 상호 작용 가능성을 해결하기 위해 비켜 준비의 사용을 보여줍니다.

초기 치킨 태아의 성장 팩터 - 코팅 비즈 배치

신경 유도는 뇌의 형성의 첫 단계입니다. 그것은 Hensen의 노드 (주최자), 신경 운명을 채택할에 인접한 조직을 지시하는 메커니즘이며, 신경 계통을 일으키다하는 즉. 이 비디오는 여자의 배아에서 신경 유도에 대한 분석을 보여줍니다.

칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석

이 문서는 craniofacial 개발 중에 신호 및 표면 두부 ectoderm의 patterning 속성을 테스트하도록 설계되었습니다 조직 이식 기술을 설명합니다.

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초기 여자는 배아에서 Morphogenetic 조직 Deformations 추적

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발달 중에 닭 배아를 보고 접근하는 것은 어려울 수 있습니다. 우리는 간단하고 비용 효율적이며 교실이나 연구 환경에서 쉽게 사용할 수 있는 ex ovo 방법을 개발했습니다. 이 방법은 배아가 배아 발달의 후기 단계로 들어갈 수 있도록 합니다(HH 40).

최적화 전 비켜 개발의 고급 단계에 병아리 배아의 배양

성장 인자 또는 신호 전달 경로의 특정 억제제에 적신 구슬을 발달 중인 배아에 접목함으로써 생체 내에서 그 효과를 직접 테스트할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 비드를 사지 싹에 이식하여 이러한 분자가 유전자 발현 및 신호 전달에 미치는 영향을 확인합니다.

유전자 발현에 영향을 미치는 신호 전달 진학을 확인하기 위해 닭 배아 사지 개발에 구슬의 접목

여기에서는 투과광과 형광 현미경을 사용하여 타임 랩스 이미징을 위해 병아리 배아를 배양하는 새로운 기술을 소개합니다. 수중 여과지 샌드위치는 액체 배양 배지에 완전히 잠긴 병아리 배아를 배양할 수 있는 잘 정립된 여과지 운반 기법1의 변형입니다.

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침지된 비드 분석은 세포 분화 및 형태형성의 조절을 연구하기 위해 임의의 발달 시점에서 시험 시약의 표적화된 전달을 포함한다. 세 가지 다른 유형의 침지 된 구슬을 준비하고 닭 배아의 교차 숫자에 이식하기위한 모든 실험 동물 모델에 적용 가능한 상세한 프로토콜이 제시됩니다.

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조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

배우세요 병아리 배아에서 수술적 장벽과 후보 인자 구슬을 이용한 사지 유도 신호 연구 방법을. Tbx4, Fgf10, Fgf8 유전자 발현 분석을 통해 발달 생물학의 핵심 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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