와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석

형광 세포 추적 기반 분석의 전반적인 목적은 Bacille Calmette-Guerin(BCG)을 발바닥에 감염시킨 후, 피부에서 배출 림프절로 이동하는 특정 표적 세포 집단을 모니터링하고 특성화하는 것입니다. 당사는 이 기술을 사용하여 BCG 피부 감염 후 배출 림프절로 귀환하는 수지상 세포 집단을 식별하였습니다. 이 기술을 통해 정해진 24시간 창 내에 종양을 주입함으로써 세포 이동을 연구할 수 있었습니다.

발바닥 주사와 림프절 분리 단계는 텍스트만으로는 학습하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. microbacterium Bovus BCG 주사를 위해, 발가락 꼬집기(toe pinch)로 적절한 진정 수준을 확인한 후, 29-gauge 1/2 inch 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 8~12주 된 마우스의 뒷발바닥에 30 µL의 PBS에 희석된 1 × 10⁶ CFU의 박테리아를 접종합니다. 대조군 발바닥에는 PBS만 주입합니다.

그 후 동물들이 완전히 회복되어 주사한 발바닥에 체중을 실을 수 있을 때까지 관찰하십시오. CFSE 주사의 경우, BCG 주사 후 적절한 시점에 실온 상태의 5 mM CFSE 한 바이알을 PBS로 10배 희석하며, 이때 용액을 충분히 재현탁시키도록 주의하십시오. 그다음, 희석된 CFSE를 주사기에 채워 첫 번째 주사를 맞았던 동일한 뒷발바닥에 20 µL를 투여하십시오.

CFSE 주입 24시간 후, 뒷허벅지에 조심스럽게 수직 절개를 가하고 근육 지방을 제거합니다. 다음으로 가위와 핀셋을 사용하여 무릎 오금의 지방낭 깊숙이 위치한 슬와 림프절(Popliteal Lymph Node)을 노출시켜 절제합니다. 림프절을 얼음 위에 둔 0.5 milliliters의 멸균 PBS로 옮기고, 5 milliliters의 PBS가 담긴 6-웰 플레이트의 한 웰 내에서 70 micron 세포 스트레이너를 통해 3 milliliters 주사기의 뒷부분으로 림프절을 균질화합니다.

스트레이너를 버퍼 5 mL로 다시 세척하고, 세포 용액을 15 mL 튜브로 옮깁니다. 그 다음, 세포를 원심 분리하고 펠릿을 적당한 양의 버퍼에 재부유시킵니다. 유세포 분석을 위해 세포를 표지하려면, 1~10 × 10⁶개의 세포를 5 mL 라운드 바텀 폴리스티렌 튜브에 분주하고 신선한 FACS 버퍼로 세포를 세척합니다.

펠릿을 얼음 위에서 빛을 차단한 상태로, FACS 버퍼 내의 anti-mouse CD16 CD32가 포함된 적절한 항체 칵테일 50~100 \textmu L에 재현탁하여 비특이적 FC 매개 상호작용을 차단합니다. 30~45분 후, FACS 버퍼로 세포를 세척하고 펠릿을 신선한 FACS 버퍼 50~100 \textmu L에 재현탁합니다. 슬와 림프절 내 CFSE 라벨링의 대부분은 MHC-II high 및 CD11c positive low 세포에서 관찰되며, 이는 피부 배출 림프절로 이동하는 피부 수지상 세포의 특성과 일치합니다.

PBS를 주입한 대조군과 비교했을 때, BCG에 감염된 마우스의 오금 림프절에서는 이러한 표지 세포의 빈도와 총 수가 모두 증가한 것으로 나타났으며, 이는 BCG가 이러한 세포들의 배출 림프절로의 재배치를 촉진함을 시사합니다. 피부 수지상 세포는 감염 후 최대 5일까지 배출 림프관으로 계속 진입하며, 이는 본 모델에서 수지상 세포의 이동이 오금 림프절 내 항원 특이적 CD4 양성 T세포의 초기 활성화 일정보다 훨씬 더 오래 지속됨을 보여줍니다. 또한, 이동성 피부 수지상 세포는 공동 자극 분자를 높은 수준으로 발현하며, 이는 이러한 이동성 수지상 세포가 활성화되었다는 개념을 뒷받침합니다.

중요한 점은, 수입 림프관이 아닌 고내피세정맥(high endothelial venules)을 통해 염증이 생긴 림프절로 진입하는 림프절 저항성 단핵구양 및 형질세포양 수지상세포 모두 CFSE 음성으로 나타나, CFSE 표지가 주로 발바닥 패드에서 일어남을 추가로 검증한다는 것입니다. 또한, 추가적인 유세포 분석을 통해 EpCAM low CD11b high 세포의 하위 집단이 BCG 감염에 반응하여 오금 림프절로 이동하는 주요 피부 수지상세포 하위 집단임을 알 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 5분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 과정을 수행할 때는 주사 부위와 주사량에 주의하는 것이 중요하며, 박리 과정 중 배출 림프절이 손상되지 않도록 각별히 주의해야 합니다. 절차 이후에는 서브셋 특이적 세포 미세 발현을 추가로 분석하기 위해 유세포 분석법이나 공초점 현미경법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 연구자들이 감염 또는 백신 접종에 반응하여 24시간 이내에 피부에서 배출 림프절로 이동하는 세포를 추적할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 발바닥 주사 수행 방법과 관심 있는 이동성 수지상 세포 집단의 추적 및 특성 분석을 위해 배출 림프절을 찾아 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.