Name: 골수 증식 종양의 전달-이식 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 배우세요 골수 증식 종양 연구를 위한 전달-이식 마우스 모델 기법을 사용하여 조혈 세포에서 특정 유전자를 발현시키는 방법을 익히세요. 이 기술은 혈액 악성 종양 및 정상 조혈 과정 연구에 필수적입니다.

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이 작업은 V Foundation Scholar(AGF)와 MPN Research Foundation(AGF)의 지원을 받습니다.

이 연구는 승인 및 캘리포니아 대학교 어바인에서 기관 동물 관리 및 사용위원회의 권고에 따라 실시 하였다. 모든 절차는 이소 플루 란 마취하에 수행 된 모든 노력은 고통을 최소화 하였다. Ecotropic 레트로 바이러스의 1 세대 <ol><li> 상업적 맥시 프렙 키트 또는 세슘 클로라이드 정제를 이용하여 적어도 1 μg의 / μL의 농도로 고품질 플라스미드를 준비한다. 주의 : 이러한는 MSCV 백본 (CALR 7,8이 경우에) 관심의 유전자를 코딩 벡터 및 (등 GFP, 네오) 선택의 마커뿐만 아니라 ecotropic 포장 플라스미드, 인코딩 개그-POL-ENV를 포함 (함 여기 플라스미드 등). </li><li> DMEM에서 해동 및 확장 낮은 통로 293T 세포는 페니실린 / 스트렙토 마이신 (D10)와 10 % FBS와 L 글루타민 보충. 가습에서 10cm 조직 배양 처리 접시에 접시 5 × 10 6 세포조직 배양, 37 ℃ 배양기에서 5 % CO 2. </li><li> 문화 293T 세포를 확장합니다. 형질 전환 전날에, 진공 플라스크에 1 ml의 PBS와 대기음 뜨는을 추가하여 세포를 씻으십시오. </li><li> 세포를 Trypsinize하기 2ml의 0.05 % 트립신을 추가 부화 요리 2 습윤 조직 배양 인큐베이터에서 - 3 분, 37 ℃에서 5 % CO 2. </li><li> , 트립신을 중지 15 ML 원뿔 관에 접시 3 ML의 D10 및 전송 셀을 추가합니다. 10 분 동안 400 XG에 세포를 스핀. </li><li> 2 ML의 D10의 진공 플라스크에 resuspend 세포 펠렛에 기음 뜨는. </li><li> 혈구를 사용하여 트리 판 블루 배제하여 세포를 계산합니다. </li><li> 시드 생성 된 바이러스에 세 10cm 조직 배양 처리 된 요리로 접시 당 2 × 10 6 세포. 참고 : 최적의 결과를 얻으 세포가 30을 초과하는 것을 허용하지 않습니다 - 형질 전환 또는 가난한 바이러스 수율을 얻을 수 있습니다 시간에 50 %의 합류. </li><li> 즉시 형질 전에,진공 플라스크에 넣고 흡인 미디어는 5 ml의 신선한 D10으로 대체합니다. </li><li> 모든 10cm를 들어 페트리 접시는 개별 멸균 1.5 ㎖의 microcentrifuge 관을 준비 형질합니다. </li><li> 피펫 각 microcentrifuge 관으로 감소 혈청 매체의 760 μL는 조심스럽게 직접 미디어로 형질 전환 시약의 40 μl를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 조직 배양 후드에서 튜브 부화. </li><li> 관심의 유전자 (빈 벡터를 사용하여 15 μg의 경우)뿐만 아니라 각각의 튜브에 플라스미드 5 μg의와 MSCV 벡터의 30 μg의를 추가로 pipetting 아래로 부드럽게 섞는다. 추가로 15 분 동안 조직 배양 후드에서 실온에서 인큐베이션. 참고 : 작은 벡터가 높은 바이러스 성 수율을 갖는 경향이있다. </li><li> 조심스럽게 드롭 현명한 각각의 10cm 페트리 접시에 각각 반응 (약 800 μL)의 전체 볼륨을 추가하고 부드럽게 섞어 좌우로 접시를 기울이십시오. 가습 조직의 세제곱에 세포를 반환lture 인큐베이터. </li><li> 조직 문화 인큐베이터에서 8 시간 또는 하룻밤 배양 후, 부드럽게 흡인 진공 플라스크에 넣고 미디어와 신선한 D10의 10 ㎖로 교체합니다. </li><li> 48 시간 후 - 형질 감염에 35 mL의 주사기에 상등액을 수집하고 세포 찌꺼기를 제거하기 0.45 ㎛의 멤브레인 필터를 통하여. </li><li> 선택 사항 : 293T 세포 및 추가 바이러스에 장소 10 ml의 신선한 D10 백 72 시간의 후 형질 전환 수확 할 수있다. </li><li> 추가 바이러스가 수집되지 않을 때 생물 학적 폐기물 293T 세포를 폐기하십시오. </li><li> (예 : 바이러스 역가를 1 ml의 또는 BM 감염 6.5 ml의 경우) 단일 사용 볼륨으로 나누어지는 바이러스 상층 액. -80 ℃에서 액체 질소 저장 바이러스 플래시 동결 바이러스. 주 : 크게 바이러스 역가 감소로 반복 동결 / 해동 사이클을하지 마십시오. </li></ol> 2. 유동 세포 계측법에 의해 상대 바이러스 역가를 결정 <ol><li> 3T3 세포를 해동 및 D10에 유지한다. 10cm의 문화 세포조직 배양 CO 2, 37 ℃에서 가습 된 조직 배양 인큐베이터에서 접시를 처리하고, 5 %. </li><li> 세중에서 바이러스 역가를 수행합니다. 진공 플라스크에 1 ml의 PBS와 대기음 뜨는을 추가하여 세포를 씻어 세포를 준비합니다. </li><li> 세포를 Trypsinize하기 2ml의 0.05 % 트립신을 추가 부화 요리 가습 조직 배양 인큐베이터에서 37 ℃, 5 % CO 2. </li><li> , 트립신을 중지 15 ML 원뿔 관에 접시 3 ML의 D10 및 전송 셀을 추가합니다. 10 분 동안 400 XG에 세포를 스핀. </li><li> 2 ML의 D10의 진공 플라스크에 resuspend 세포 펠렛에 기음 뜨는. </li><li> 혈구를 사용하여 트리 판 블루 배제하여 세포를 계산합니다. </li><li> 시드 3T3 다섯 60mm 조직 배양 처리 된 접시에 1 × 105 세포의 밀도로 세포를 밤새 배양한다. </li><li> 3 1:10 1:30, 1 : 1 ML의 총 D10을 사용하여 고정 해제 바이러스 상층 액의 100 희석 일을합니다. 또한 바이러스가없는 컨트롤을 포함한다. </li><li> 저를 대기음진공 플라스크에 넣고 3T3 세포의 직경과 D10의 4 ㎖로 교체합니다. </li><li> 바이러스 상등액의 희석과 3T3 세포를 오버레이 각 접시 8 μg / ML의 최종 농도로 폴리 브렌을 추가한다. 37 ℃에서 조직 배양 인큐베이터에서 48 시간 및 5 % CO 2 부화. </li><li> 유동 세포 계측법에 의해 상대적으로 바이러스 역가를 결정합니다 : <ol><li> 세포를 세척하기 위해 진공 플라스크에 미디어를 대기음 5 ml의 PBS를 추가합니다. </li><li> 진공 플라스크에 PBS를 대기음. 1 ml의 0.05 % 트립신을 추가하고 2, 37 ° C에서 부화 - 5 분 ​​접시에서 세포를 분리. </li><li> 플레이트에서 남아있는 세포를 분리 아래로 3 ㎖의 D10을 추가하고 최대 피펫합니다. 10 분 동안 400 XG에서 FACS 튜브와 원심 분리기에 세포를 전송합니다. </li><li> 뜨는을 가만히 따르다 3 ml의 PBS로 세포를 씻어. 10 분, 디 캔트 상층 액 400 XG에 원심 분리기. 200 ㎕의 PBS에 재현 탁. </li><li> 9 사이토 흐름에 실행 세포. t에서 30,000 이벤트 - 20000 사이를 수집그는 (SSC 대 FSC에 의해 결정) 세포 게이트를 살고 GFP +와 GFP의 비율을 계산 - 세포. 참고 : 바이러스 역가가 허용 고려할 때 바이러스 성 뜨는 수율 50 % 이상에 GFP + 3T3 세포의 1시 반 희석. 경우 50 % 미만 GFP + 세포의 희석이 결과는 다음 차선 전달 결과를 얻을 수있다. 바이러스 역가를 결정하는 계산은 리몬 등의 알에서 적응했다. 혈액 (1997) 9. </li><li> 바이러스 역가 = 입자 형성 단위 (PFU) / ㎖ = [(GFP + 세포의 주파수 × 3T3 세포의 수) 상층 액 (㎖)의 / 볼륨] × 희석 요인 : 상대적 바이러스 역가를 결정하려면 방정식을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 3. 형질 도입 기증자 골수 세포 <ol><li> 골수 공여 마우스를 준비하기 (BM) 수확 먼저 5 % 결합 기업의 유량으로 기화기에 의해 이소 플루 란 마취 생쥐/ 분 1 L의 산소. 응답 성을 평가하기 위해 발을 꼬집어. 참고 : (미만 8 주 오래 된) 기증자 마우스 (8 일 전에 이식) 오일 전에 골수 수확 준비를해야합니다. 하나의 공여 마우스는 2 이상의 수신자에 충분한 세포를 제공 할 것이다. </li><li> 주사 150 밀리그램 / kg 27 G × ½ &quot;니들을 사용하여 마취시킨 쥐의 레트로 궤도를 통해 주입 5- 플루오로 우라실 (5-FU). 주의! 5-FU 항암 화학 요법 제. 항상 공인 된 화학 물질 흄 후드 나 덕트 바이오 안전성 캐비닛 내부에 5-FU를 처리합니다. 5-FU 치료 쥐의 적절한 라벨링을 결정하는 기관의 실험실과 동물 안전위원회에 문의하십시오. <ol><li> 옆으로 마취 된 마우스를 놓고 눈은 헤드로부터 약간 돌출되도록 엄지와 집게 손가락을 모두 사용하여 억제. </li><li> 내측 눈구석과 위를 향하도록 경사와 바늘 측면을 시작으로, 45에서 바늘을 삽입내측 방향으로 각도를 ° 바늘이 중간에 삽입 될 때 중지합니다. 천천히 세포를 주입 조심스럽게 바늘을 제거하십시오. 주 :이 기술이 정확하게 수행되는 경우, 눈은 약간 수축한다 아무런 저항 바늘 삽입시 생각되어서는 안된다. </li><li> 이러한 부종이나 출혈 등의 부상의 흔적을 위해 마우스를 검사합니다. </li></ol></li><li> 수확 골수 오일 (이식 3 일 이전) 5-FU 치료 후. <ol><li> / 분 1 L의 5 % 혼합 보충 산소의 유량으로 기화기 이소 플루 란 마취하여 쥐. 응답 성을 평가하기 위해 발을 꼬집어. </li><li> 자궁 경부 전위로 마우스를 희생. 모피는 젖은 될 때까지 70 % EtOH로 관대하게 분사하여 마우스를 소독. </li><li> 가위를 해부하여, 피부에 절개를 멀리 다리 근육의 근막을 해부하다. 다음으로, 고관절에서 대퇴골과 발목의 경골을 절단하여 마우스에서 떨어져 다리를 해부하다. </li><li> 굽히다ㄱ &quot;L&quot;모양으로 다리가 해부 가위로 무릎 관절에서 절단하여 각 다리 뼈를 분리합니다. </li><li> 각 다리 뼈의 말단부에 연골을 제거하려면, 연골이 해제 될 때까지 부드럽게 다리 뼈의 한쪽 끝을 향해 근육을 긁어 해부 가위를 사용합니다. </li><li> 27 X G ½ 인치 바늘 주사기를 이용하여 PBS로 세척 각 다리 뼈는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 100 μM 나일론 막 위에 2 % FBS가 보충. 뼈까지 세척 뼈 수확 된 세포의 수를 최대화하기 위해 흰색집니다. </li><li> 단일 세포 현탁액을 수득하기 위해 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 나일론 막을 통해 세포 매쉬 주사기의 플런저를 사용한다. 다른 마우스 다리로 반복합니다. </li></ol></li><li> 4 ℃에서 원심 분리기 세포 400 XG에 10 분 동안 상층 액을 버린다. 재현 탁 BM 5 ml의 염화 암모늄 칼륨 (ACK) 버퍼에 적혈구를 용해시키기 위해. 10 분 동안 얼음에 세포를 품어. </li><li> 세포 용해를 중지 PBS로 튜브를 입력합니다. 센트리4 ° C에서 fuge 세포 400 XG에 10 분 동안 상층 액을 버린다. BM 펠렛은 붉은 색이있는 경우 용해 단계를 반복합니다. </li><li> 5 ml의 PBS에 재현 탁하고 혈구를 사용하여 트리 판 블루 배제하여 세포를 계산합니다. </li><li> DMEM은 20 % FBS, L- 글루타민, 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 포함 배 사전 STIM 칵테일 m 당 2 × 106 개 세포로 재현 탁 세포, IL-3 (14 NG / ㎖), IL-6 (24 NG / ㎖) 및 SCF (112 NG / ㎖). 플레이트 6 웰 플레이트에 웰 당 2 ml의. </li><li> 37 ℃에서 하룻밤 동안 세포를 인큐베이션하고, 5 % CO 2. </li><li> 각 웰 포함 BM 세포에 바이러스 상층 액을 2 ㎖를 추가하고 폴리 브렌 (/ ㎖ 8 μg의)를 추가합니다. 1,500 × g으로 90 분 동안 30 ° C에서 스핀 플레이트를 하룻밤 동안 조직 배양 배양기에 플레이트를 반환한다. </li><li> 피펫 세포 원뿔 튜브에 서스펜션과 400 XG에 10 분 동안 4 ℃에서 원심 분리기는 판을 버리지 않습니다. 이 용액에 재현 탁 세포는 신선한 배 사전 STIM 아니라 당 칵테일과 원래의 우물로 돌아갑니다. </리&gt; <li> 단계 3.7-3.9를 반복하여 2 차의 spinoculation을 수행합니다. </li></ol> 받는 사람 마우스에 4 이식 기증자 세포 <ol><li> 24 시간 전에 BM 세포의 주입에 치사량 전신 조사 &lt;와 이식 동계받는 사람 마우스를 준비합니다. 참고 : BALB / c 마우스에 대한 치명적인 선량 조사는 일반적으로 800-900 cGy의 및 C57B / 6 10 1,000-1,200 cGy의입니다. 용량은 일반적으로 적어도 3~4시간 이격 조사의 두 세션으로 분할된다. </li><li> 부드럽게 원뿔 튜브에 뜨는을 피펫 팅하여 6 웰 플레이트에서 단계 3.11, 수확 형질 공여 세포로부터 계속됩니다. 잔여 세포를 수집하고 50 ML 원뿔 튜브에 추가 할 PBS 1 ml의 잘 각을 씻으십시오. </li><li> 웰을 0.05 % 트립신 0.5ml를 추가 5 분 동안 조직 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 우물 1 ML의 D10을 추가하고 부드러운 피펫으로 남아있는 세포를 분리. 각각의 튜브에 세포를 추가400 × g으로 10 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 단계 4.2 펠릿에서의. </li><li> 400 × g으로 10 분 동안 4 ° C에서 PBS와 원심 분리기와 세포를 씻으십시오. 트리 판 블루 배제하여 혈구를 사용하여 5 ml의 PBS에 재현 탁하고 계산 세포. 주 : 벡터는 GFP 태그가 있다면 유세포하여 GFP 양성 세포의 비율을 수치화. </li><li> 마우스에 주입을위한 100 ㎕의 PBS - 50 2 × 10 6 세포 - 5 × 10 5를 재현 탁. </li><li> 멸균 27 G X ½ &quot;바늘을 사용하여 마취 마우스로 역 궤도 사출을 통해 세포를 주입한다. 참고 : 다른 주입 기술은 꼬리 정맥, 비장, 또는 대퇴를 포함한다. <ol><li> 반응성을 평가하기 위해 핀치 이소 플루 란과 발을 사용하여 마우스를 마취. </li><li> 그 측면에 마우스를 위치시키고, 눈은 헤드로부터 약간 돌출되도록 엄지와 집게 손가락을 모두 사용하여 억제. </li><li> 베벨이 위를 향으로, N을 삽입45 ° 각도로 측방 내안 eedle. 주 :이 기술이 정확하게 수행되는 경우, 눈은 약간 수축한다 아무런 저항 바늘 삽입시 생각되어서는 안된다. </li><li> 이러한 부종이나 출혈 등의 부상의 흔적을 위해 마우스를 검사합니다. 참고 : 다음 이식 마우스는 주 번호에 대한 낮은 혈액 카운트를 가지고 있으므로 감염에 취약합니다. 항생제 또는 산성화 된 물을 사용하여 예방이 사용될 수있다. </li></ol></li><li> 이식 후 1 개월, 유동 세포 계측법에 의해 접목 공여 세포의 지표로서 말초 혈액에서의 GFP %를 측정한다. 참고 : 혼자 GFP가 세포의 생착의 성공을 확인할 수 없습니다. 바이러스 성 전달이 실패했을 수 있습니다 아직 생착가 발생했을 수 있습니다. 이 경우, GFP + 세포가 검출되지 않지만 이식 세포의 생착이 성공된다. <ol><li> 말초 혈액 (b)의 10 μl를 타고y를 21 G × 1 ½ &quot;주사기로 복재 다리 정맥을 천공 및 응고를 방지하기 위해 PBS 100 mM의 EDTA에 추가합니다. </li><li> 10 분 동안 얼음에 혈액과를 Lyse 1 ml의 ACK를 추가합니다. 10 분 동안 400 XG에 원심 분리하여 펠렛 세포. </li><li> 대기음 진공 플라스크에 상층 액 1 ml의 PBS를 추가는 용해을 정지 2 % FBS로 보충. 10 분 동안 400 XG에 원심 분리하여 펠렛 세포. </li><li> 100 μl의 PBS에서 진공 플라스크에 resuspend 펠렛의 대기음 뜨는는 2 % FBS와 보충. </li><li> 흐름 cytometer에 샘플을 실행하고 (SSC 대 FSC에 의해 결정) 라이브 세포 게이트에서 30 만 이벤트를 수집하고 GFP +와 GFP의 비율을 계산 - 셀 (9). </li></ol></li><li> 또한 1 개월 후 이식에서 질병의 진행을 모니터링하는 자동화 된 동물 혈액 분석기 (18)를 사용하여 완전한 혈액 카운트 (CBC)을 수행합니다. 참고 : %로 질병을 모니터링 계속월간 말초 혈액 및 CBC에서 GFP. </li><li> 실험을 종료하려면, 응답 성을 평가하기 위해 이소 플루 란과 핀치 발을 사용하여 마우스를 마취. 조직 병리학에 대한 자궁 경부 전위 및 수확 비장과 골수에 의해 마우스를 희생. 참고 실험의 길이는 주관적 및 종료일 예상 질환의 표현형에 기초하여 평가한다. </li></ol>

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이 프로토콜은 질병의 드라이버로 CALRdel52 변이 골수 섬유증으로 진행과 필수적인 혈소판 같은 질환 요점을 되풀이하는 생쥐 골수 이식을 수행하는 방법에 대한 상세한 설명을 제공한다. 혈소판 증가, 거핵 세포의 확장 및 골수 섬유증에 CALRdel52 결과를 발현하는 세포의 이식에 성공. 골수 이식은 다단계 과정이기 때문에 기술적 오류 관심 또는 마우스 사망의 유전자를 발현하는 세포의 생착 불량한 않도록 방지 할 수있는 단계를 인식하는 것이 중요하다. 종종 간과 성공적으로 전달 이식 모델에 중요한 요인은 바이러스의 품질입니다. 고 역가 바이러스 관심 유전자를 발현하는 세포를 적게 될 것이다 낮은 역가와 관련된 바이러스를 사용하는 반면, 양호한 전달 효율 및 질환 따라서 강한 근거를 용이하게한다. 전달 efficiency 바이러스 및 폴리 브렌과 retronectin 같은 세포 사이의 접촉을 증가 시약에 의해 향상 될 수있다. 간 성상 세포의 형질 도입이 바이러스에도 고농도...

전달-이식 생쥐에서 혈액 악성 종양을 모델링하는 유용한 방법이다. 이 기술은 다시 BCR-ABL1의 이소성 표현이 충실 마우스 (1) 만성 골수성 백혈병을 요점을 되풀이 수있는 최초의 시범 데이트 골수의 악성 종양을 공부에 특히 가치가있다. 이 기술은 이후에 골수 증식 성 신 생물 (MPN)에 돌연변이 JAK2 V617F 및 MPL W515K / L의 광범위한 연구를 촉진하고있다. MPN 성숙한 골수 세포 및 골수 섬유증의 과잉 특징 혈액 종양의 그룹이다. 이 질환은 일반적으로 릴화 Jak2, MPL, 또는 CALR 하나의 체세포 돌연변이를 획득 한 조혈 줄기 세포의 클론 확장에서 발생한다. 전달 이식 JAK2 V617F 및 MPL W515K / L 모델 전시 진성 다혈 구증 및 골수 섬유증 (2)의 임상 적 특징 - 5 &lt;/ SUP&gt;. 최근, 칼레 티 큘린 돌연변이 MPN의 마우스 모델은 또한 전달 이식 방법 (6)로 생성되었다. 이러한 마우스는 증가 된 혈소판, 거핵구 증가 수, 골수 섬유증 필수적인 혈소판과 같은 질환을 개발한다. 함께, 이러한 모델은 MPN의 분자 기전에 대한 통찰력을 얻을 수있는 기회뿐만 아니라, 개발 및 전임상 설정에서 치료제를 연구 할 수있는 능력을 제공하고 있습니다뿐만 아닙니다. 이 원고는 CALRdel52 돌연변이에 초점을 전달 이식 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 기술은 조사 된 동계 돌연변이받는 마우스로 구성 retrovirally 형질 발현하는 골수 세포의 이식을 포함한다.

<table><tbody><tr><td>Cell Lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>3T3 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoPak, 일컬어 pCL-Eco</td><td>Addgene</td><td>12371</td><td>EcoPack 2-293과 같은 레트로바이러스 패키징 세포주를 EcoPak 플라스미드 및 표준 293T 세포 대신 사용할 수 있습니다. 추가 &gamma;-레트로바이러스 엔벨로프 및 패키징 플라스미드는 Addgene 및 기타 회사에서 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>MSCV-IRES-GFP (MIG)</td><td>Addgene</td><td>20672</td><td>추가 &감마;-레트로바이러스 전달 플라스미드는 Addgene 등에서 구할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>소모품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2" 바늘</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Corning</td><td>MT-35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민</td><td>Corning</td><td>MT-30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>Corning</td><td>MT-25-052-CI</td><td>수제</td></tr><tr><td>PBS</td> 가능<td>코닝</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>10cm 접시</td><td>Fisher</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원추형 튜브</td><td>Fisher</td><td>12565268</td><td></td></tr><tr><td>60mm 접시</td><td>Fisher</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Fisher</td><td>NC9840454</td><td></td></tr><tr><td>5-FU</td><td>Fisher</td><td>A13456-06</td><td></td></tr><tr><td>100 &#181; m 세포 여과기</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원뿔형 튜브</td><td>Fisher</td><td>12565270</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Fisher</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브</td><td>Fisher</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m 주사기 필터</td><td>Fisher</td><td>0974061B</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>ACK 버퍼</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>집에서 만들 수 있습니다</td></tr><tr><td>재조합 쥐 IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 IL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365809001</td><td>Transfection 시약</td></tr><tr><td>1.5ml 원심분리기 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X선 조사기</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

골수 증식 종양의 전달-이식 마우스 모델

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

Transduction-transplantation은 마우스의 인간 혈액 악성 종양을 모델링하는 빠르고 효율적인 방법입니다. 이 기술은 조혈 세포에서 관심 유전자의 발현을 초래하며 정상 및/또는 악성 조혈에서 유전자의 역할을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 최근 골수증식성 신생물(MPN)에서 확인된 칼레티큘린(CALR) 돌연변이를 예로 사용하여 형질도입-이식을 수행하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 5-플루루라실(5-FU) 처리된 기증자 마우스의 전체 골수 세포에 돌연변이 CALR을 암호화하는 레트로바이러스로 transduction하고 치사적으로 방사선 조사된 syngeneic 숙주에 이식합니다. 돌연변이 CALR을 발현하는 공여자 세포는 녹색 형광 단백질(GFP)로 표시됩니다. 이식된 마우스는 말초 혈액의 혈소판 상승, 골수 내 거핵세포 증식, 골수 섬유증을 포함한 MPN 표현형을 발달시킵니다. 레트로바이러스를 생성하고, 바이러스 역가를 계산하고, 전체 골수 세포를 형질도입하고, 방사선 조사를 받은 수용 마우스에 이식하는 방법에 대한 단계별 설명을 제공합니다.

형질 도입 이식 기술은 세포가 관심있는 유전자를 발현과받는 마우스의 조혈 재구성을 초래한다. 그림 1은 MPN 돌연변이 칼레 티 큘린의 전달 이식 마우스 모델의 개요를 보여줍니다. 간단히, CALRwt 또는 CALRdel52을 표현 레트로 바이러스는 C57B / 6 기증자 마우스에서 BM 세포를 감염하는 데 사용됩니다. 형질 세포는 첫 번째 달 후 이식시 발생 조사 C57B / 6받는 사람 마우스와 공여 세포 생착에 이식된다. 10개월 이식 후 - 질병 표현형의 증거는 명백 3개월 6에서 골수 섬유증 다음 마우스 전시는 혈소판과 거핵 세포를 증가 후 이식을하게된다. 기증자의 세포가 생착하지 않을 경우, 마우스의 죽음은 이식 다음 첫 2 주 이내에 발생할 수 있습니다. 주입 동안 불량한 주사 또는 외상 외에 다른 기술적 오류가 변환되는 가난한 생착을 일으킬 수D 세포 또는 마우스 죽음. 이 대부분의 조혈 세포가받는 사람이 아닌 기증자의 기원...

이 원고는 형질도입-이식 마우스 모델을 확립하는 데 사용되는 방법론에 대한 설명을 제공합니다. 골수 이식을 수행할 때 피해야 할 기술적 오류에 대한 자세한 설명이 제공됩니다. 높은 바이러스 역가, transfection/transduction 및 방사선 조사의 중요성에 대한 명확한 이해를 얻어야 합니다.

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

본 절차의 전반적인 목표는 도입-이식법(transduction-transplantation method)을 사용하여 조혈 세포에서 관심 유전자를 발현하는 마우스를 생성하는 것입니다. 이 방법은 짧은 기간 내에 관심 유전자가 혈액암을 유발하는지 여부를 확인하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한, 가설 단계의 치료제를 테스트할 수 있는 마우스 모델을 신속하게 개발할 수 있으므로, 이 기술의 함의는 혈액암의 진단 및 치료 분야로까지 확장됩니다.이 방법은 혈액암에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 정상 조혈 작용에서 특정 관심 유전자의 역할을 연구하는 데에도 사용될 수 있습니다. 일반적으로 이 실험은 여러 단계가 필요하므로 처음 접하는 연구자는 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한, 고역가 바이러스를 생성하는 것이 이 실험의 성공에 매우 중요합니다.마우스 작업은 어려울 수 있으며 숙련도가 필요하므로, 이 절차에 대한 시각적 시연이 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 마취하고 마취 깊이를 확인한 후, 마우스를 옆으로 눕히고 엄지와 검지를 사용하여 눈이 머리 밖으로 약간 돌출되도록 동물을 고정합니다. 150 mg/kg의 5-flurouracil(5-FU)을 안와 후방 주사(retro-orbital injection)로 투여하려면, 27-gauge 0.5인치 바늘의 사면(bevel)이 위를 향하게 하여 내측 방향으로 45도 각도로 삽입하고, 바늘의 절반이 들어갔을 때 멈춥니다.용액을 천천히 주입한 다음, 바늘을 조심스럽게 제거합니다. 부종이나 출혈과 같은 부상 징후가 있는지 마우스를 관찰하고, 마우스가 회복하여 걷기 시작하는지 확인합니다. 5일 후, 텍스트 프로토콜에 따라 동물을 희생시키고, 70% ethanol을 털이 젖을 때까지 충분히 뿌려 마우스를 소독합니다.해부 가위로 피부를 절개한 후, 근막을 다리 근육에서 분리합니다. 그다음, 고관절에서 대퇴골을 절단하고 발목에서 경골을 절단하여 다리를 생쥐로부터 분리합니다. 다리를 L자 모양으로 구부린 후, 해부 가위를 사용하여 무릎 관절 부위를 절단함으로써 각 다리뼈를 분리합니다.그런 다음, 연골이 분리될 때까지 다리 뼈의 한쪽 끝을 향해 근육을 부드럽게 긁어냅니다. 이어서 2% FBS가 첨가된 PBS를 사용하여, 27-gauge 1/2인치 바늘이 장착된 주사기로 각 다리 뼈를 100 µm 나일론 막 위에서 50 mL 원심분리관으로 세척하며, 세포 회수량을 최대화하기 위해 뼈가 하얗게 변할 때까지 반복합니다. 주사기 플런저를 이용해 세포를 나일론 막을 통해 50 mL 원심분리관으로 밀어 넣어 단일 세포 현탁액을 얻습니다.다른 쪽 마우스 다리에도 동일한 과정을 반복합니다. 수확한 세포를 4°C에서 400 ×g로 10분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 그런 다음, 골수를 재현탁하기 위해 5 mL의 염화암모늄 칼륨(ammonium chloride potassium, ACK) 용액을 첨가합니다.적혈구를 용해시키기 위해 세포 현탁액을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 용해를 중단시키려면 PBS로 튜브를 채웁니다. 그 다음, 세포를 다시 원심 분리하고 상층액을 제거합니다.5 mL의 PBS로 세포를 재현탁하고, Trypan blue 배제법을 이용하여 혈구계수기로 세포 수를 측정합니다. 그다음, 2x pre-stem 칵테일을 첨가하여 세포 농도를 2 × 10⁶ cells/mL로 재현탁합니다. 이어서, 6-well 플레이트의 각 웰에 2 mL씩 분주합니다.세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후, 각 웰에 2 mL의 바이러스 상청액을 첨가하고, 이어서 8 µg/mL의 polybrene을 첨가합니다. 플레이트를 30 °C에서 1500 ×g로 90분 동안 원심분리합니다.그 후 플레이트를 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 세포 현탁액을 원추형 튜브에 옮기고, 4°C에서 400 ×g로 10분 동안 원심 분리합니다. 웰당 2x pre-stem cocktail을 사용하여 세포를 재현탁한 후, 원래의 웰에 다시 분주합니다.텍스트 프로토콜에 따라 이식용 수신 마우스를 준비한 후, 상층액을 원추형 튜브에 조심스럽게 피펫팅하여 6-웰 플레이트에서 형질전환된 공여 세포를 수확합니다. PBS 1 mL를 사용하여 각 웰을 세척하고, 튜브에 잔류 세포를 수집합니다. 웰에 0.05% trypsin 0.5 mL를 첨가하고 37 °C에서 5분 동안 배양합니다.다음으로, 웰에 D-10 1 mL를 첨가하고 조심스럽게 파이펫팅하여 남아 있는 세포를 모두 떼어냅니다. 그 후, 세포를 각각의 튜브에 넣고 4 °C에서 400 ×g로 10분간 원심분리하여 펠렛을 형성합니다. PBS로 세포를 다시 세척합니다.그런 다음, 원심분리를 마친 후 5 mL의 PBS를 사용하여 세포를 재현탁하고, 트립판 블루 배제법(Trypan blue exclusion)과 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 마우스에 주입하기 위해, 5 × 10⁵에서 2 × 10⁶개의 세포를 50~100 µL의 PBS에 재현탁합니다. 마우스를 옆으로 눕힌 후, 엄지와 검지를 사용하여 눈이 머리 밖으로 약간 돌출되도록 고정합니다.바늘의 사면이 위를 향하게 하여 내안각 외측에 45도 각도로 삽입한 후 주입합니다. 주입 후, 주입 부위에 부종이나 출혈과 같은 부상 징후가 있는지 마우스를 관찰하고, 추가적인 주입 후 관리 사항은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 혈액 내 GFP 발현을 분석합니다.이 그림은 live cell gate에서 수집된 이벤트로부터 GFP 백분율을 산출하여 상대적 바이러스 역가를 계산하는 방법을 보여줍니다. 여기에는 세포당 하나 이상의 바이러스 입자가 포함된 역가가 나타나 있으며, 이 샘플들은 세포당 단일 바이러스 입자가 포함된 역가를 나타냅니다. 이상적으로는 바이러스 상청액을 1:30으로 희석했을 때 GFP 양성 세포가 최소 50% 이상 검출되어야 합니다.본 실험에서는 CALRdel52 마우스가 혈소판 증가, 골수 내 거핵세포 증가 및 골수 섬유화와 같은 MPN 표현형을 나타내는 성공적인 이식 수혜 모델을 제시합니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 8일 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 프로토콜의 모든 단계를 준수하는 것이 중요합니다.이 기술은 개발 이후 연구자들이 조혈 작용에서 특정 유전자의 효과를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 조혈 세포에서 관심 유전자를 발현하는 마우스를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

transduction-transplantation-mouse-model-myeloproliferative

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 동종 조혈모세포와 GvHD 유도 비장 동종성 T 림프구를 사용하여 치사량에 방사선 조사를 받은 마우스에서 장 이식편대숙주병(GvHD)의 유도를 보여줍니다. 이 프로토콜은 중증 급성 장 GvHD 모델을 확립하여 질병의 메커니즘을 이해하고 혁신적인 치료 옵션을 개발하는 데 도움이 됩니다.

동종 골수 및 비장 세포 이식을 통한 마우스 모델에서 이식편 대 숙주 질환 유도

우리는 단일 T 세포 수용체(TCR) 레트로바이러스 기반 생체 내 발현 시스템을 위한 빠르고 유연한 프로토콜을 제시합니다.  레트로바이러스 벡터는 골수 전구 세포를 transduction하여 TCR 형질전환 마우스의 대안으로 in vivo에서 단일 TCR의 T 세포 발달 및 기능을 연구하는 데 사용됩니다.

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

여기 우리가 사용 발광, x 선, 그리고 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 이미징 공부 어떻게 억제 mTOR 활동 영향이 종이 식 모델에서 골 engrafted 발성 종양. 이로써 순수 관련, 비-침략 적, 및 복합 요법 골 engrafted 발성 종양에서 vivo에서대상의 안티 발성 효과의 분석.

다 발성 골 수 Xenografts 노 그 쥐에서의 복합 발광 및 양자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 영상

우리는 유전자 조작된 조 혈 모 세포의 악성 잠재력을 평가 하기 위해 조 혈 모 세포 이식 (HSCT)의 사용을 설명 합니다. HSCT 소설 치료를 평가 하 형성 증후군 (MDS) 또는 백혈병 생쥐의 대형 코 호트 생성 뿐만 아니라 다양 한 악성 조 혈 모 세포에 vivo에서 평가 대 한 유용 합니다.

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

이식편 대 숙주 질병은 동종 골수 이식 후에 중요한 합병증입니다. 수지상 세포는 이식편 대 숙주 질환의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. 현재 논문은 이식편 대 숙주 질환및 이식편 대 백혈병 효과의 발달에 있는 수지상 세포의 역할을 조사하기 위하여 새로운 골수 이식 플랫폼을 기술합니다.

이식대 숙주 질환에서 수지상 세포의 역할을 조사하는 골수 이식 플랫폼

우리는 마우스 뇌에서 루시페라아제-녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 이중 리포터 벡터로 형질도입된 인간 신경 전구 세포의 사다리꼴 이식을 기술한다. 이식 후, 루시퍼라아제 신호는 형광 현미경을 사용하여 뇌 절편에서 확인된 생체 내 생체 발광 및 GFP 발현 이식된 세포를 사용하여 반복적으로 측정된다.

Intracerebral 이식 및 마우스 뇌에서 인간 신경 전구 세포의 생체 내 생체 발광 추적

이 프로토콜은 추가 기능 분석을 위해 델타와 같은 4-발현 골수 기질 세포주 공동 배양 시스템(OP9-DL4)에서 레트로바이러스 형질도입 및 공동 배양에 이어 마우스 흉선에서 이중 음성 흉선 세포를 분리하는 것을 설명합니다.

T 세포 백혈병에서 종양 유전자를 연구하기 위해 델타와 같은 4-발현 간질 세포에서 쥐 흉선세포의 공동 배양 및 형질도입

여기서, 백혈병 세포의 복강 내 주사는 마우스에서 급성 골수성 백혈병(AML)을 확립하고 전파하는 데 활용됩니다. 이 새로운 방법은 AML 세포의 연속 이식에 효과적이며 생쥐에서 정맥 주사에 어려움과 불일치를 경험할 수 있는 사람들을 위한 대안이 될 수 있습니다.

생쥐에서 급성 골수성 백혈병을 발생시키기 위한 복강내 이식

본 프로토콜은 종양 세포를 추간 공간에 주입하여 척수 신경교종의 재현 가능한 쥐 모델을 개발하는 방법을 설명하며, 연구 및 치료 개발을 위한 보다 효과적이고 덜 침습적인 접근 방식을 제공합니다.

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이 프로토콜은 유도 화학 요법에 대한 반응의 역학을 기반으로 급성 림프구성 백혈병의 재발을 생성하기 위한 마우스 모델을 설명하는 것을 목표로 합니다.

급성 림프구성 백혈병에 대한 유도 화학 요법에 대한 백혈병 재발의 쥐 모델

배우세요 골수 증식 종양 연구를 위한 전달-이식 마우스 모델 기법을 사용하여 조혈 세포에서 특정 유전자를 발현시키는 방법을 익히세요. 이 기술은 혈액 악성 종양 및 정상 조혈 과정 연구에 필수적입니다.

골수 증식 종양의 전달-이식 마우스 모델

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