작은 별 말미의 반구 Physa에서 전체 폴립 재생을 유도 Nematostella의 vectensis

이 절차의 전반적인 목표는 nematostella vectensis의 복부 끝에서 제거된 조직의 작은 부분에서 완전한 용종을 재생하는 동안 발생한 예측 가능한 일련의 형태학적 변화를 설명하는 것입니다.이 방법은 상처 부위의 세포가 누락된 구조를 다시 만들기 위해 어떻게 재조직되고 배치되는지와 같은 재생 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어가 처음 떠오른 이유는 상대적으로 복잡한 폴립이 최소한의 형태학적 정보부터 시작하여 어떻게 다시 결합될 수 있는지 보고 싶었기 때문입니다. 이 방법의 시각적 시연은 초기 상처 후 단계 진행이 때때로 점막에 의해 가려지기 때문에 중요합니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 용종의 부드럽고 끈적끈적한 젤라틴 같은 특성 때문에 상처 부위에서 조직을 완전히 분리하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 nematostella vectensis의 조건화로 이 절차를 시작합니다. 이 기술을 사용할 때 선택한 동물이 동일한 크기이고 동일한 먹이 및 기타 조건 매개변수와 같은 동일한 배양 이력을 갖는 것이 특히 중요합니다.

절단 최소 1시간 전에 선택한 동물의 접시를 인큐베이터에서 실내 조명으로 옮깁니다. 넓은 구멍의 플라스틱 피펫을 사용하여 절단할 수영장에서 5마리의 동물을 100ppm의 염도로 인공 해수가 들어 있는 직경 12mm의 멸균 유리 절단 접시의 바닥으로 옮깁니다. 접시를 s에 놓습니다.tage 10에서 40x 사이의 가변 배율로 스테레오 현미경의 e.

거의 같은 길이의 크기가 일치하는 폴립을 선택하고 절단 전 3일 동안 집락에서 떨어진 그릇에 넣습니다. 멸균 메스를 사용하여 각 폴립에서 복부 physa를 절단하여 길이가 넓고 장간막이 없는 physa 부분을 대략적으로 얻습니다. 이를 위해 메스 날을 원하는 절단 부위에 동물과 접촉시키십시오.

도움 없이 하거나 숫자 5 집게로 동물의 몸을 부드럽게 움켜쥐십시오. 메스의 구부러진 칼날을 지렛대 삼아 몸을 가로질러 흔드는 동작으로 조직을 자릅니다. 접시에서 절단된 각 기증자 용종을 제거하고 pooled amputees라고 표시된 별도의 그릇에 다시 넣습니다.

그릇의 연대를 측정한 후에는 스톡 배양에 되돌려 놓으십시오. 절단 접시에 남아 있는 절제된 physa를 인공 바닷물에 12/1, 000의 염분으로 헹굽니다. 그런 다음 각 physa를 각 웰에 1, 000ppm의 염도로 10ml의 인공 해수가 있는 다중 웰 세포 배양 플레이트의 별도의 멸균 웰로 옮깁니다.

이 단계를 반복하여 각 실험 처리를 위해 예약할 각 웰에서 최소 5개의 physa를 수집합니다. physa를 포함하는 플레이트를 원하는 재생 속도에 따라 결정되는 고정된 온도의 온도 조절 인큐베이터에 넣습니다. 다양한 배율의 실체 복합 현미경을 사용하여 physa를 점수

갓 절단한 nematostella physa를 0단계로 점수화하고 NRSS를 사용하여 절단 후 또는 DPA를 매일 같은 시간에 계속 점수 매기기합니다. 갓 자른 physa가 상처 부위가 보일 수 있는 열린 상처 부위가 있는 연약한 풍선을 닮은 컵 모양의 덩어리로 나타나면 physa를 0단계로 점수를 매깁니다. 절단 상처가 닫힌 것처럼 보이는 경우 1단계로 물리 검사를 실시합니다.

귀 기둥의 표면이 부풀어 오르면 방사형 대칭 패턴으로 배열되고 홈으로 분리된 8개의 돌출된 아치가 드러나는 경우 2단계로 physa를 점수 매기십시오. 2단계에서는 아치의 정점에서 너비만큼 높고, 일시적일 가능성이 높으며, 초기에는 단일 외배엽 세포층으로 구성된 작은 반구형 bleb를 관찰합니다. physa가 노화됨에 따라 점액으로 둘러싸여 있을 수 있으므로 집게로 조심스럽게 제거해야 합니다.

내배엽 및 외배엽 조직층을 포함하는 촉수의 새싹이 적어도 일부 방사형 아치의 귀 끝에서 안정적으로 형성되는 경우 physa를 3단계로 점수 매기십시오. physa가 체벽의 삽입부에서 coelenteron으로 확장되는 8개의 뚜렷한 가시적 장간막을 포함하는 경우 physa를 4단계로 평가하며, 복부 끝 또는 장내 인두와 연결되는 것으로 보이는 위치에서 측정된 요골 너비의 두 배 이상인 귀 복부 길이를 측정합니다. 마지막으로, physa에 주름이 있는 장간막이 4개 이상 있고 주름이 4단계보다 더 꽉 차고 구불구불한 경우 physa를 5단계로 점수를 매깁니다.

5단계에서 동물은 거의 정상적인 성체 외모를 갖지만 생식선 세포는 보이지 않습니다. 0.1% DMSO로 처리된 이 대조군 선마성피지사 그룹은 5기까지 완전히 재생되었습니다. 그러나 클로로퀸으로 치료한 피지사는 완전한 장간막을 형성하지 못했습니다.

클로즈업은 클로로퀸에서 배양된 physa에서 장간막에 주름이 있는 것과 주름이 없는 것을 모두 보여줍니다. 이 그래프는 클로로퀸 치료의 집계 결과를 보여줍니다. 10에서 50 마이크로몰 사이의 모든 처리는 유사한 결함을 일으켰는데, 대부분 장간막에 주름이 없다는 점에서 장간막의 완전한 재형성이 부족했습니다.

일단 마스터하면 이 기술은 30개의 절단 physa를 포함하는 각 6웰 플레이트에 대해 한 시간 이내에 완료할 수 있습니다. 채점은 빠르며 각 복제 플레이트에 대해 30분이 필요할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 복부 조직의 작은 부분에서 완전한 용종을 재생하는 동안 발생하는 형태학적 변화를 시각화하기 위해 physa를 절단하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술의 주요 장점은 시각적으로 균일한 조직 컵에서 완전한 폴립의 재생의 기초가 되는 분자 이벤트를 고정하는 형태학적 단계를 제공한다는 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 영양 이력과 관련하여 동물을 사전 조건화하고, 성체 장간막을 배제하기 위해 이등분하고, 치료 내 변동을 줄이기 위해 재생 physa의 크기를 표준화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 예를 들어 작은 분자에 대한 유전적 돌연변이 또는 신호 경로 교란의 영향을 평가할 수 있습니다.

또는 형태 유전 학적 변화는 자가 증식, 계통 추적 또는 부위 2 유전자 발현의 현미경 분석과 상관 관계가 있을 수 있습니다. 이 기술은 재생 생물학 분야의 연구자들이 이 모델 유기체의 놀라운 재생 능력의 기초가 되는 세포 생물학, 신호 경로 및 형태 유전학적 과정을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.