의 강성 측정 전의 VIVO 마우스 대동맥

이 프로토콜의 전반적인 목표는 원자력 현미경을 사용하여 마우스 대동맥의 Ex Vivo 탄성 계수를 측정하는 절차를 설명하는 것입니다. 이 방법은 심혈관 질환 및 노화와 같은 혈관 생체 역학 및 질병 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 AFM이 동맥 및 세포와 같은 부드러운 생물학적 샘플의 생체 역학적 특성을 Danoscale 수준에서 매우 정확하게 특성화한다는 것입니다.

저는 AFM 절차를 발표할 예정이며, 우리 연구실의 연구원인 Shu-lin Liu 박사는 쥐의 대동맥을 분리하는 방법을 보여줄 것입니다. 먼저 마우스를 안락사시키고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 대동맥까지 해부합니다. 작은 집게를 사용하여 대동맥 주변의 지방을 잡고 작은 가위를 사용하여 대동맥 주변의 지방을 조심스럽게 잘라냅니다.

다음으로, 집게로 대동맥을 부드럽게 잡고 하나는 상행 대동맥의 시작 부분에 있는 혈관을 절단하고 다른 하나는 복부 대동맥 바로 위에 있는 하행 대동맥의 끝 부분을 절단합니다. 절개된 대동맥을 칼슘이나 마그네슘이 없는 PBS가 들어 있는 60mm 접시로 옮깁니다. 접시에서 대동맥에 남아 있는 지방 조직을 계속 절개한 다음 대동맥을 세로로 엽니다.

다음으로, 하행 대동맥에서 2mm x 4mm 조각을 자르고 대동맥궁에서 같은 크기의 조각을 잘라 원자력 현미경을 사용하여 분석합니다. 이 티슈 조각을 60mm의 새 플라스틱 접시에 넣고 PBS 한 방울로 촉촉하게 유지하십시오. 대동맥을 건드리지 말고 실험실 물티슈를 사용하여 조직 주위의 PBS를 조심스럽게 제거합니다.

조직의 내강 면이 위를 향하고 있는지 확인하고 5-10마이크로리터의 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 열린 대동맥의 양쪽 끝을 플레이트에 부드럽게 붙입니다. 이 과정에서 대동맥이 늘어나지 않는 것이 중요합니다. 완료되면 접착된 대동맥이 접히거나 떠 있지 않은지 확인합니다.

대동맥의 접착제를 30-60초 동안 공기 건조시킨 후 PBS를 부드럽게 첨가하고 샘플을 담그십시오. 핀셋을 사용하여 구형 팁이 있는 질산실리콘 AFM 프로브를 프로브 홀더에 밀어 넣습니다. 그런 다음 프로브 홀더를 AFM 헤드의 ZScanner 마운트에 단단히 고정합니다.

그런 다음 AFM 소프트웨어를 엽니다. 실험 범주로 이동하여 접촉 모드를 선택하여 실험 유형을 선택합니다. 그런 다음 실험 그룹으로 이동하여 유체의 접촉 모드를 선택하고 마지막으로 실험으로 이동하여 유체의 접촉 모드를 선택합니다.

이 옵션을 선택했으면 Load Experiment를 클릭합니다. 그러면 레이저가 켜집니다. 다음으로, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 레이저를 정렬하는 데 사용되는 샘플을 준비합니다.

샘플을 AFM에 놓습니다. 레이저 포지셔닝 손잡이를 조정하여 AFM 프로브 끝에 레이저 스폿을 배치합니다. 그런 다음 검출기 포지셔닝 노브를 사용하여 수직 편향 값이 0과 음의 1볼트 사이가 되고 수평 편향이 0볼트에 가까워질 때까지 포토 다이오드의 위치를 조정합니다.

다음으로 레이저 Sum Signal이 최대화되었는지 확인합니다. 필요한 경우 AFM 팁에서 레이저 빔의 위치와 포토 다이오드의 위치를 다시 조정하여 최대 합계 신호를 얻습니다. 보정을 시작하려면 check parameters(매개 변수 확인)를 선택하고 Scan Size(스캔 크기)에 대한 매개 변수를 0으로 설정합니다.

스캔 속도를 1헤르츠로 설정합니다. 샘플/라인을 256으로 설정하고 편향 설정점을 20나노미터로 설정합니다. 그런 다음 참여를 선택합니다.

프로브가 플레이트 표면과 접촉하면 Ramp를 클릭합니다. 그런 다음 스캔 도구 모음 메뉴에서 확장 모드를 선택하고 여기에 표시된 대로 매개변수를 설정합니다. 램프 도구 모음에서 램프 연속체를 선택하고 플레이트의 힘 곡선을 가져옵니다.

이 힘 곡선에서 채널 1을 편향 오류로 설정하여 소프트웨어가 결과를 Z 위치에 대한 수직 처짐으로 그래프로 표시할 수 있도록 합니다. 힘 곡선의 왼쪽 또는 오른쪽 끝을 클릭하고 커서를 끌어 직선에 맞는 힘 곡선의 선형 영역을 둘러쌉니다. 그런 다음 도구 모음에서 Ramp를 선택하고 Update Sensitivity를 클릭합니다.

현재 값을 기록합니다. 그런 다음 Calibrate(보정)를 선택하고 Detector(검출기)를 클릭합니다. Deflection Sensitivity 상자에 있는 5개 측정의 입력 및 평균 값.

Withdraw(철회)를 두세 번 클릭하면 AFM 헤드가 올라가고 열 조정 프로세스 중에 AFM 팁과 플레이트 간의 상호 작용을 방지할 수 있습니다. 그런 다음 도구 모음에서 Thermal Tune을 클릭합니다. Thermal Tune 범위를 1에서 100kHz 사이로 설정하고, V자형 캔틸레버의 경우 편향 감도 보정을 1.144로, 직사각형 캔틸레버의 경우 1.166으로 설정합니다.

Thermal Tune 메뉴에서 Acquire Data를 클릭하여 Thermal Tune 곡선을 얻습니다. 다음으로, 곡선의 양쪽에 있는 선에 빨간색 대시를 배치하고 데이터에 더 적합한 로렌츠안 또는 단순 조화 발진기 모델을 선택합니다. 그런 다음 데이터 맞춤을 클릭하고 스프링 K 계산을 선택하여 이 값을 저장합니다.

대동맥 조직이 들어있는 60mm 배양 접시를 현미경 스테이지에 놓고 마그네틱 플레이트 홀더로 플레이트를 고정합니다. 대동맥이 캔틸레버와 맞물리면 피에조 센터가 안정적인지 확인하고 Ramp를 클릭합니다. 램프 크기를 3마이크로미터로, 트리거 모드를 상대적으로, 트리거 임계값을 100나노미터로 설정합니다.

그런 다음 연속 램프를 선택합니다. 프로브와 샘플 사이의 접촉 지점이 Z 램프 주기의 중심에서 아래쪽 3/4 지점까지 대략 발생하는지 관찰합니다. 이것이 관찰되지 않으면 샘플에서 분리하고 필요에 따라 램프 크기를 조정한 다음 샘플을 다시 결합시킵니다.

그런 다음 메뉴 표시줄에서 Microscope를 클릭하고 Engage Settings를 선택합니다. SPM 인출을 30마이크로미터로 변경한 다음 확인을 클릭합니다. 힘 곡선을 관찰한 후 메뉴 표시줄에서 Capture를 클릭하고 Capture Filename을 선택합니다. OOO로 끝나는 원하는 파일 이름을 입력하고 지정된 폴더를 선택한 다음 데이터를 저장합니다.

해석을 시작하려면 하중 곡선 해석 소프트웨어를 열고, 분석할 파일을 로드하고, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 수정하고 매끄럽게 합니다. 그런 다음 메뉴 표시줄에서 Baseline Correction을 선택하고 여기에 표시된 대로 입력을 설정합니다. 그런 다음 그래프의 파란색 수직 점선을 조정하여 힘 곡선의 평평한 부분을 둘러싸도록 하고 Execute를 클릭합니다.

그런 다음 도구 모음 메뉴에서 들여쓰기를 클릭하고 여기에 표시된 대로 입력을 설정합니다. 이 값을 저장하고, 서로 작은 거리 내에서 취해진 영역당 5개의 힘 곡선을 측정하여 각 관심 영역의 Young's modulus를 분석합니다. 조직 샘플의 전반적인 강성을 측정하려면 조직 내 샘플 영역의 5개 영역에서 최대 25회 측정을 수행해야 합니다.

이 영역은 대동맥궁 및 하행 대동맥과 같은 다른 위치의 조직을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 이 그래프에서는 하행 대동맥과 대동맥궁의 대표적인 힘 곡선이 동일한 마우스 대동맥 샘플에서 표시됩니다. 이 데이터를 기반으로 각 그룹에 대해 탄성 계수를 계산할 수 있으며 서로 다른 지역 또는 조건을 비교하는 데 사용할 수 있습니다.

이 비디오를 시청하면 쥐의 대동맥을 적절하게 분리하고 원자력 현미경으로 탄성 계수를 측정하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다. 이 절차를 시도한 후에는 조직 분리 직후 AFM 측정을 수행해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 일단 마스터하면 마우스당 약 45분 이내에 대동맥 분리를 완료할 수 있으며, 적절하게 수행되면 AFM 측정 및 분석을 1시간 30분 내에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 혈관 리모델링 또는 혈관 평활근 세포 증식과 관련된 추가 질문에 답하기 위해 면역형광 또는 증식 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.