Name: 의 강성 측정 전의 VIVO 마우스 대동맥 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 배우세요 마우스 대동맥을 분리하고 원자력 현미경(AFM)을 사용하여 탄성 계수를 측정하는 방법을. 이 기술은 혈관 생체역학 및 심혈관 질환 연구에 정확한 생체역학적 특성 분석을 제공합니다.

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AFM 분석은 펜실베이니아 근육 연구소(Pennsylvania Muscle Institute)와 펜실베이니아 대학교 페렐만 의과대학(Perelman School of Medicine)의 중개 의학 및 치료 연구소(Institute for Translational Medicine and Therapeutics)에서 지원하는 기기에서 수행되었습니다. 이 작업은 NIH 보조금 HL62250 및 AG047373의 지원을 받았습니다. YHB는 미국심장협회(American Heart Association)의 박사 후 펠로우십의 지원을 받았습니다.

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<li>Liu, S. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-12+is+an+essential+mediator+of+acute+and+chronic+arterial+stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-12 is an essential mediator of acute and chronic arterial stiffening.</a> Sci Rep. 5, 17189(2015).</li>
<li>Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+arterial+aging+and+the+epidemic+of+systolic+hypertension+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Central arterial aging and the epidemic of systolic hypertension and atherosclerosis.</a> J Am Soc Hypertens. 1, 302-340 (2007).</li>
<li>Stehouwer, C. D. A., Henry, R. M. A., Ferreira, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+in+diabetes+and+the+metabolic+syndrome%3A+a+pathway+to+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness in diabetes and the metabolic syndrome: a pathway to cardiovascular disease.</a> Diabetologia. 51, 527-539 (2008).</li>
<li>Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Stiffness+and+Increased+Pulse+Pressure+in+the+Aging+Cardiovascular+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System.</a> Cardiol Res Pract. 2011, 263585(2011).</li>
<li>Duprez, D. A., Cohn, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+as+a+risk+factor+for+coronary+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis.</a> Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).</li>
<li>Mitchell, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+Stiffness+and+Cardiovascular+Events%3A+The+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Arterial Stiffness and Cardiovascular Events: The Framingham Heart Study.</a> Circulation. 121, 505-511 (2010).</li>
<li>Sutton-Tyrrell, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Aortic+Pulse+Wave+Velocity%2C+a+Marker+of+Arterial+Stiffness%2C+Predicts+Cardiovascular+Events+in+Well-Functioning+Older+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Elevated Aortic Pulse Wave Velocity, a Marker of Arterial Stiffness, Predicts Cardiovascular Events in Well-Functioning Older Adults.</a> Circulation. 111, 3384-3390 (2005).</li>
<li>Klein, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Cycle+Control+by+Physiological+Matrix+Elasticity+and+In+Vivo+Tissue+Stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-Cycle Control by Physiological Matrix Elasticity and In Vivo Tissue Stiffening.</a> Curr Biol. 19, 1511-1518 (2009).</li>
<li>Bae, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FAK-Cas-Rac-lamellipodin+signaling+module+transduces+extracellular+matrix+stiffness+into+mechanosensitive+cell+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+signal%22%5BJournal%5D)">A FAK-Cas-Rac-lamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling.</a> Sci signal. 7, ra57(2014).</li>
<li>Thyberg, J., Hedin, U., Sjölund, M., Palmberg, L., Bottger, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+differentiated+properties+and+proliferation+of+arterial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 10, 966-990 (1990).</li>
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<li>Huynh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Intimal+Stiffening+Enhances+Endothelial+Permeability+and+Leukocyte+Transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Age-Related Intimal Stiffening Enhances Endothelial Permeability and Leukocyte Transmigration.</a> Sci Transl Med. 3, 112ra122(2011).</li>
<li>Safar, M. E., Levy, B. I., Struijker-Boudier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Perspectives+on+Arterial+Stiffness+and+Pulse+Pressure+in+Hypertension+and+Cardiovascular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Current Perspectives on Arterial Stiffness and Pulse Pressure in Hypertension and Cardiovascular Diseases.</a> Circulation. 107, 2864-2869 (2003).</li>
<li>Raffetto, J. D., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+vascular+remodeling+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease.</a> Biochem Pharmacol. 75, 346-359 (2008).</li>
<li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nat Nanotechnol. 3, 261-269 (2008).</li>
<li>Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -L., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E3+Inhibits+Rho+to+Regulate+the+Mechanosensitive+Expression+of+Cox2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2.</a> PLoS ONE. 10, e0128974(2015).</li>
<li>Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Energy+and+the+Contact+of+Elastic+Solids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+A%22%5BJournal%5D)">Surface Energy and the Contact of Elastic Solids.</a> Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).</li>
<li>Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+contact+deformations+on+the+adhesion+of+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of contact deformations on the adhesion of particles.</a> J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).</li>
<li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+atomic-force+microscope+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Rev Sci Instrum. 64, 1868-1873 (1993).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+surface+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch+EJP%22%5BJournal%5D)">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Arch EJP. 440, 653-666 (2000).</li>
<li>Pogoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth-sensing+analysis+of+cytoskeleton+organization+based+on+AFM+data%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data.</a> Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).</li>
<li>Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+Enhances+Cell+Elastic+Behavior+and+Protects+against+Compressive+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress.</a> Biophys J. 107, 314-323 (2014).</li>
<li>Moreno-Flores, S., Benitez, R., Md Vivanco,, Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+relaxation+and+creep+on+living+cells+with+the+atomic+force+microscope%3A+a+means+to+calculate+elastic+moduli+and+viscosities+of+cell+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components.</a> Nanotechnology. 21, 445101(2010).</li>
<li>Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+human+mesenchymally-derived+stem+cells+and+primary+osteoblasts%2C+chondrocytes%2C+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.</a> J Biomech. 41, 454-464 (2008).</li>
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<li>Amin, M., Le, V. P., Wagenseil, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Testing+of+Mouse+Carotid+Arteries%3A+from+Newborn+to+Adult%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult.</a> J Vis Exp. , e3733(2012).</li>
<li>Laurent, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+document+on+arterial+stiffness%3A+methodological+issues+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications.</a> Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).</li>
<li>Plodinec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nanomechanical+signature+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">The nanomechanical signature of breast cancer.</a> Nat Nano. 7, 757-765 (2012).</li>
<li>Raman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nanomechanical+properties+of+live+cells+using+multi-harmonic+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy.</a> Nat Nano. 6, 809-814 (2011).</li>
</ol>

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AFM 압입은 세포 및 조직의 강성 (탄성 계수)을 특성화하는데 사용될 수있다. 본 논문에서는 마우스의 하행 대동맥과 대동맥 궁을 분리하고이 동맥 영역 생체의 탄성 계수를 결정하는 자세한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 우리는 지금 요약하고이 문서에 설명 된 방법의 기술적 인 문제 및 제한 사항에 대해 설명합니다. 몇 가지 기술적 인 문제는 고립과 자신의 작고 얇은 자연 주어진 마우스 대동맥의 분석에 발생할 수 있습니다. 세정 동맥 길이 방향으로 개방되는 경우, 치료는 탄성률 데이터 수집 내막 (내강 표면)을 방해하지 않도록주의해야한다. 최종 샘플 접시 과잉 PBS는 접시에 동맥의 적절한 접착을 방지하고,이 접착 전에 동맥을 건드리지 않고 종이 티슈를 이용하여 조심스럽게 제거해야한다. 단리 동맥 종이 티슈 WHI 스틱 수 있다는 점에 유의제작 과도한 PBS를 제거하려고하고,이 샘플이 손상 될 수 있습니다. 배양 접시에 접착 동맥 동안, 동맥 연신되지 않는 것이 ...

동맥의 생체역학적 특성은 심혈관 질환(CVD)과 노화에 중요한 결정 요인입니다. 콜레스테롤과 무관한 주요 위험 요소이자 CVD의 진행 지표인 동맥 경직은 혈관 손상, 죽상 경화증, 연령 및 당뇨병1-8에서 증가합니다. 동맥벽 경직은 혈관 평활근 세포의 역분화(dedifferentiation), 이동(migration) 및 증식(prosecration) 증가와 관련이 있다9-12. 또한, 동맥 경직도 증가는 대식세포 접착력 향상1, 내피 투과성 및 백혈구 전이(leukocyte transmigration) 13, 혈관벽 리모델링(vessel wall remodeling) 14,15과 관련이 있다. 따라서, CVD의 동맥 경직 또는 노화를 예방할 수 있는 치료법은 높은 혈중 콜레스테롤을 감소시켜 CVD를 치료하는 현재 이용 가능한 약리학적 중재를 보완할 수 있습니다. 
AFM은 다양한 물리 및 생물학적 응용 분야에 사용되는 강력한 분석 도구입니다. AFM은 고해상도 이미지를 얻고 조직및 세포 1,2,10,16,17과 같은 부드러운 생물학적 샘플의 생체 역학적 특성을 나노 단위 수준에서 높은 정확도로 특성화하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. AFM의 가장 큰 장점은 살아있는 세포와 함께 사용할 수 있다는 사실입니다.
이 논문은 AFM을 사용하여 생체 외 마우스 동맥의 탄성 계수를 측정하는 방법을 설명합니다. 설명된 방법은 1) 마우스 동맥(하행 대동맥 및 대동맥궁)을 적절하게 분리하고 2) AFM으로 이러한 조직의 탄성 계수를 측정하는 방법을 보여줍니다. 동맥에서 하중이 가해지지 않은 탄성 계수를 측정하면 혈관 손상, CVD 및 노화에 대한 반응으로 발생하는 세포외 기질(ECM)의 변화를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>BioScope Catalyst AFM 시스템</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE 200 도립 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>질화 규소 AFM 프로브</td><td>Novascan Technologies</td><td>PT. 시02. SN.1</td><td>0.06 N/m 캔틸레버; 1 &마이크로; m SiO2 입자</td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>섹션 1.4</td></tr><tr><td>참조 Dumont #5SF 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>섹션 참조 1.8</td></tr><tr><td>Fine Scissors-ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>섹션 1.4 (중간 크기)</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml 참조; bingen 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15008-08</td><td>섹션 참조 1.6 (소형)</td></tr> <tr><td>60mm TC 처리 세포 배양 접시</td><td>Corning</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수, 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>칼슘 및 마그네슘 없음</td></tr><tr><td>Krazy Glue 인스턴트 다목적 액체</td><td>Krazy Glue</td><td>KG58548R</td><td>섹션 2.2 참조</td></tr><tr><td>젤 로딩 팁, 1 - 200 &마이크로; l</td><td>Fisher</td><td>02-707-139</td><td>섹션 2.2</td></tr><tr><td>참조 Tip Tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>78092-CP</td><td>섹션 3.2 참조</td></tr><tr><td>50mm, 투명 벽 유리 바닥 접시</td><td>TED PELLA</td><td>14027-20</td><td>섹션 4.4 참조</td></tr></tbody></table>

의 강성 측정<em&gt; 전의 vivo</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

동맥 경직은 중요한 위험 인자 및 심혈관 질환 바이오 마커 및 노화의 특징이다. 원자력 현미경 (AFM)은 하드 (플라스틱, 유리, 금속 등)의 임의의 기판 위에 세포 표면에 이르기까지 다양한 재료에 대한 점탄성 기계적 성질을 특성화하기위한 다용도 분석 도구이다. 널리 세포의 강성을 측정하는 데 사용되지만 자주 대동맥의 강성을 측정하는 데 사용되었다. 본 논문에서는 무부하 마우스 동맥의 생체 탄성 계수를 측정하기 위해 접촉 모드 AFM을 사용하기위한 절차를 설명합니다. 우리는 마우스 대동맥의 분리를 위해 우리의 절차를 설명하고 AFM 분석에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 이것은 레이저 빔의 배향, 스프링 상수 및 AFM 프로브의 편향 감도를 교정 한 힘 곡선 취득 단계가 설명되어있다. 우리는 또한 데이터 analy에 대한 자세한 프로토콜을 제공힘 곡선의 동생.

<html> 도 5a는 6 개월, 남성 C57BL / 6 마우스에서 하강 (흉부) 대동맥의 위상 콘트라스트 이미지를 보여줍니다. AFM 캔틸레버 직접 조직 위의 자리에 들여 쓰기를위한 준비.도 5b 및도 5c는 접촉 모드 AFM 들여 쓰기에 의해 얻어진 대표 힘 곡선을 보여줍니다. 도 5b 및도 5c에 도시 된 그린 선 구체 대한 헤르츠 모델을 이용하여 얻어지는 최적 곡선을 나타낸다. 본문에 설명 된도 5d에서, 하행 대동맥 대동맥 아치의 평균 강성 세 개별 쥐에서 측정 하였다. 하행 대동맥과 대동맥 궁은 ​​각각 층류 및 방해 흐름의 영역을 표현합니다. 그럼에도 불구하고, 자신의 (기계적으로 언로드) 탄성 계수는 ​​AFM의 결정에 따라 유사하다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

우리는 원자력 현미경을 사용하여 마우스에서 대동맥을 분리하고 탄성 계수를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 원자 힘 현미경(Atomic Force Microscopy)을 사용하여 마우스 대동맥의 Ex Vivo 탄성 계수를 측정하는 절차를 설명하는 것입니다. 이 방법은 심혈관 질환 및 노화와 같은 혈관 생체 역학 및 질병 분야의 핵심 질문들에 대한 해답을 얻는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 동맥 및 세포와 같은 연성 생물학적 시료의 생체 역학적 특성을 나노 규모 수준에서 매우 높은 정확도로 분석할 수 있다는 점입니다.저는 AFM 절차를 설명할 예정이며, 저희 실험실의 연구원인 Shu-lin Liu 박사가 마우스 대동맥을 분리하는 방법을 보여줄 것입니다. 먼저, 동반된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 마우스를 안락사시키고 대동맥이 드러나도록 해부하십시오. 작은 핀셋을 사용하여 대동맥 주변의 지방을 잡고, 작은 가위를 이용해 대동맥 주위의 지방을 조심스럽게 잘라내십시오.다음으로, 포셉을 사용하여 대동맥을 조심스럽게 잡고 상행 대동맥의 시작 부분과 복부 대동맥 바로 위쪽의 하행 대동맥 끝부분을 각각 한 번씩 절단합니다. 절제한 대동맥을 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS가 담긴 60 millimeter 디쉬로 옮깁니다. 디쉬 내에서 대동맥에 남아 있는 지방 조직을 계속해서 제거한 후 대동맥을 세로 방향으로 절개하여 엽니다.다음으로, 원자 힘 현미경(Atomic Force Microscope) 분석을 위해 하행 대동맥에서 2 millimeter x 4 millimeter 크기의 조각을 절취하고, 대동맥궁에서도 동일한 크기의 조각을 절취합니다. 이 조직 조각들을 새로운 60 millimeter 플라스틱 접시에 넣고, PBS 한 방울을 떨어뜨려 습기를 유지합니다. 대동맥에 닿지 않도록 주의하며 실험용 와이프로 조직 주변의 PBS를 조심스럽게 제거합니다.조직의 내강(luminal side)이 위를 향하고 있는지 확인하고, 5~10 µL의 cyanoacrylate 접착제를 사용하여 개방된 대동맥의 각 끝부분을 플레이트에 조심스럽게 접착하십시오. 이 과정 동안 대동맥이 늘어나지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 접착이 끝나면 고정된 대동맥이 접히거나 떠 있지 않은지 확인하십시오.대동맥에 도포한 접착제를 30~60초 동안 공기 중에서 건조시킨 후, PBS를 조심스럽게 추가하여 시료를 침지시킵니다. 핀셋을 사용하여 구형 팁이 달린 silicone nitrate AFM 프로브를 프로브 홀더에 밀어 넣습니다. 그 다음, 프로브 홀더를 AFM 헤드의 ZScanner 마운트에 단단히 고정합니다.다음으로, AFM 소프트웨어를 엽니다. Experiment Category로 이동하여 Contact Mode를 선택함으로써 실험 유형을 결정합니다. 그런 다음 Experiment Group에서 Contact Mode in Fluid를 선택하고, 마지막으로 Experiment에서 Contact Mode in Fluid를 선택합니다.선택이 완료되면 Load Experiment를 클릭하십시오. 그러면 레이저가 켜집니다. 다음으로, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 레이저 정렬에 사용할 샘플을 준비하십시오.시료를 AFM 위에 놓습니다. 레이저 위치 조절 노브를 조정하여 레이저 스팟을 AFM 프로브의 팁 위에 위치시킵니다. 그런 다음, 검출기 위치 조절 노브를 사용하여 Vertical Deflection 값이 0V에서 -1V 사이가 되고 Horizontal Deflection 값이 0V에 가까워질 때까지 포토다이오드의 위치를 조정합니다.다음으로, 레이저 합산 신호(Sum Signal)가 최대화되었는지 확인하십시오. 필요한 경우, 최대 합산 신호를 얻기 위해 AFM 팁의 레이저 빔 위치와 포토다이오드의 위치를 다시 조정하십시오. 캘리브레이션을 시작하려면 매개변수 확인(check parameters)을 선택하고 스캔 크기(Scan Size) 매개변수를 0으로 설정하십시오.스캔 속도(Scan Rate)를 1 Hz로 설정하십시오. 샘플/라인(Sample/Line)을 256으로, 편향 설정값(Deflection Setpoint)을 20 nm로 설정하십시오. 그런 다음 Engage를 선택하십시오.프로브가 플레이트 표면에 접촉하면 Ramp를 클릭하십시오. 다음으로, 스캔 툴바 메뉴에서 확장 모드(expanded mode)를 선택하고 여기와 같이 파라미터를 설정하십시오. 램프 툴바에서 ramp continuus를 선택하여 플레이트 상의 힘 곡선(force curve)을 얻으십시오.이 힘-거리 곡선(force curve)에서, 소프트웨어가 Z 위치에 따른 수직 변위로 결과를 그래프화할 수 있도록 채널 1을 Deflection Error로 설정하십시오. 힘-거리 곡선의 왼쪽 또는 오른쪽 끝을 클릭한 다음, 직선으로 피팅할 힘-거리 곡선의 선형 영역을 포함하도록 커서를 드래그하십시오. 그런 다음 도구 모음에서 Ramp를 선택하고 Update Sensitivity를 클릭하십시오.현재 값을 기록하십시오. 다음으로 Calibrate를 선택하고 Detector를 클릭하십시오. Deflection Sensitivity 상자에 다섯 번의 측정값에서 얻은 평균값을 입력하십시오.AFM 헤드를 올려서 열 튜닝 과정 동안 AFM 팁과 플레이트 사이의 상호작용을 방지하기 위해, Withdraw를 두세 번 클릭하십시오. 그런 다음 툴바에서 Thermal Tune을 클릭하십시오. Thermal Tune 범위를 1에서 100 kHz 사이로 설정하고, Deflection Sensitivity Correction을 V자형 캔틸레버의 경우 1.144로, 직사각형 캔틸레버의 경우 1.166으로 설정하십시오.Thermal Tune 메뉴에서 Acquire Data를 클릭하여 열 튜닝 곡선을 얻습니다. 다음으로, 곡선의 양측에 빨간색 점선을 배치하고, 데이터에 더 잘 맞는 Lorentzian 모델 또는 단순 조화 진동자(simple harmonic oscillator) 모델 중 하나를 선택합니다. 그런 다음, Fit Data를 클릭하고 Calculate Spring K를 선택하여 이 값을 저장합니다.대동맥 조직이 담긴 60 millimeter 배양 접시를 현미경 스테이지 위에 놓고, 마그네틱 플레이트 홀더로 플레이트를 고정합니다. 대동맥이 캔틸레버에 접촉되면 피에조 센터가 안정적인지 확인한 후 Ramp를 클릭합니다. Ramp 크기를 3 micrometers로, Trigger 모드를 Relative로, Trigger 임계값을 100 nanometers로 설정합니다.그런 다음 ramp continuous를 선택하십시오. 프로브와 시료의 접촉 지점이 Z ramp 사이클의 중심에서 하단 4분의 3 지점 사이에 위치하는지 확인하십시오. 만약 그렇지 않다면, 시료에서 분리한 후 필요에 따라 ramp 크기를 조정하고 시료를 다시 접촉시키십시오.다음으로 메뉴 바에서 Microscope를 클릭하고 Engage Settings를 선택하십시오. SPM withdraw 설정을 30 micrometers로 변경한 후 OK를 클릭하십시오. 힘 곡선(force curve)을 관찰한 후 메뉴 바에서 Capture를 클릭하고 Capture Filename을 선택하십시오. OOO로 끝나는 원하는 파일 이름을 입력하고 지정된 폴더를 선택하여 데이터를 저장하십시오.분석을 시작하려면 force curve 분석 소프트웨어를 열고 분석할 파일을 불러온 후, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 수정 및 평활화합니다. 그다지 메뉴 바에서 Baseline Correction을 선택하고 여기에 표시된 대로 입력값을 설정하십시오. 그런 다음 그래프의 수직 파란색 점선을 조정하여 force curve의 평탄한 부분이 포함되도록 설정하고 Execute를 클릭합니다.다음으로, 툴바 메뉴에서 Indentation을 클릭하고 여기에 표시된 대로 입력값을 설정하십시오. 이 값들을 저장하고, 관심 영역당 서로 가까운 거리에서 측정된 5개의 힘-거리 곡선(force curve)을 측정하여 각 관심 영역의 영률(Young's modulus)을 분석하십시오. 조직 샘플의 전반적인 강성을 결정하기 위해, 조직 내 샘플 영역의 서로 다른 5개 부위에서 최대 25회의 측정을 수행해야 합니다.이 영역들은 대동맥궁 및 하행 대동맥과 같이 서로 다른 위치의 조직을 비교하는 데 사용될 수 있습니다. 이 그래프들에는 동일한 마우스 대동맥 샘플에서 얻은 하행 대동맥과 대동맥궁의 대표적인 힘 곡선이 나타나 있습니다. 이 데이터를 바탕으로 각 그룹의 탄성 계수를 계산할 수 있으며, 이를 통해 서로 다른 부위나 조건 간의 비교가 가능합니다.이 영상을 시청하고 나면 마우스 대동맥을 적절하게 분리하고 원자 힘 현미경(Atomic Force Microscopy)으로 탄성 계수를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도할 때 조직 분리 직후에 AFM 측정을 수행하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 숙련될 경우, 마우스 한 마리당 대동맥 분리는 약 45분 만에 완료할 수 있으며, 적절하게 수행한다면 AFM 측정 및 분석은 1시간 30분 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차 이후에, 혈관 리모델링 또는 혈관 평활근 세포 증식과 관련된 추가적인 질문에 답하기 위해 면역형광법이나 증식 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포외 기질의 강성은 강하게 점착 성의 세포의 여러 행동에 영향을 미칩니다. 매트릭스 강성은​​ 조직 전반에 걸쳐 공간 다양하고, 다양한 질병 상태에서 수정을 겪습. 여기 원자 힘 현미경 microindentation를 사용하여 정상 및 fibrotic 마우스 폐 조직의 경직의 공간적 변화를 특징하는 방법을 개발할 수 있습니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

우리는 생쥐에서 생체 내에서 압력-직경 관계에서 대동맥 강성을 측정하는 기술을 설명합니다. 대동맥 직경은 초음파로 기록되고 대동맥 압력은 고체 압력 카테터로 침습적으로 측정됩니다. 혈압은 점진적으로 변경되고 결과 직경이 측정됩니다.

오름차순 대동맥 강성 측정 생체 초음파를 사용하여 마우스의

우리는 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 사용하여 관절 연골의 세포 수준에서 초기 골관절염 변화를 조사하는 방법을 제시합니다.

조기 골관절염을 검출하기 위한 원자력 현미경 검사법 적용

우리는 원자력 현미경을 사용하여 정상 및 병든 간에서 콜라겐이 풍부한 영역의 탄성 계수를 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 편광 현미경의 동시 사용은 간 절편에서 콜라겐이 풍부한 부위를 국소화하기 위한 높은 공간 정밀도를 제공합니다.

편광 현미경과 결합된 원자력 현미경을 사용한 간 경화도 측정

우리는 최근에 당뇨병과 관련된 망막 기능 장애에 대한 새로운 패러다임으로 망막 모세 혈관 경직을 확인했습니다. 이 프로토콜은 망막 내피 배양에서 마우스 망막 모세혈관과 내피하 기질을 분리하는 단계를 자세히 설명한 다음 원자력 현미경을 사용한 강성 측정 기술에 대해 설명합니다.

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

이 프로토콜에서는 원자력 현미경(AFM)을 위해 아홀로틀 조직을 준비하고 온전하고 재생되는 사지 연골에서 압흔 측정을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Atomic Force Microscopy: Intact and Regenerating Axolotl Limbs의 연골 측정

우리는 세포 굽힘 강성을 측정 광학 트랩과 커버 - 미끄럼 방지 표면에 부착된 굽힘 filamentous 박테리아 세포에 대한 프로토콜을 제시한다.

광학 트랩을 사용하여 박테리아 세포의 굽힘 강성을 측정

본 논문은 문화에 살고있는 세포의 기계적 자극에 대한 통합 원자의 운영 독자 강제 광학 이미징 현미경을 지시하는 것을 목표로하고있다. 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 기계적 자극에 살고 세포 응답을 보여주는 대표적인 데이터 집합이 제공됩니다.

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

난소암의 Orthotopic 동물 모델은 더 나은 인간의 질병을 복제하기 때문에 암 진행 및 치료 종양 반응의 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 마우스 모델 루시페라제 - 표현 난소 종양 세포의 intrabursal 주사를 받게됩니다. 치료는 경구 gavage를 통해 관리합니다. 종양 성장에 의해...

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

배우세요 마우스 대동맥을 분리하고 원자력 현미경(AFM)을 사용하여 탄성 계수를 측정하는 방법을. 이 기술은 혈관 생체역학 및 심혈관 질환 연구에 정확한 생체역학적 특성 분석을 제공합니다.

의 강성 측정

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