Name: 실험, Metagenomic, 및 계산 기법 밝히는 어떤 균 타협 꿀벌 건강 메커니즘 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 학습하세요 살충제 잔류물이 꿀벌 집단 감소를 유발하는 메커니즘을 밝히는 실험 및 메타게놈 분석 방법을. 이 연구는 Bombus spp.의 미생물 공생 관계와 건강을 평가합니다.

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저자는 위스콘신 대학교의 생명 공학 센터 DNA 시퀀싱 시설을 기술 지원 확대 및 시퀀싱 시설 및 서비스, 케이 틀린 칼 슨, 제니퍼 요령, 제이크 오토, 및 최대 세 제공을 위한 감사 합니다. 분자 분석입니다. 이 작품은 미국 농 무부 농업 연구 서비스 충당 기금 (현재 연구 정보 시스템 #3655-21220-001)에 의해 지원 되었다. 추가 지원 (보조금 번호 아래 국립 과학 재단에 의해 제공 되었다 DEB-1442148), 미상 그레이트 호수 Bioenergy 연구 센터 (과학 BER 드-FC02-07ER64494의 암컷 사무실), 미국 농 무부 식품과 농업 (해치 프로젝트 1003258). C.T.H. 생물 의학에는 Alfred Toepfer 교수 동료, 퓨 자선 트러스트와 알렉산더 폰 훔볼트 재단에 의해 지원 되는 각각 퓨 학자 이다.

1. 윙윙 거리 다 꿀벌 식민지 성공을 사용 하 여 필드 케이지 실험에서 살 균 제 노출의 효과 검사 필드에서 <ol><li>세트 10 최대 메쉬 케이지 귀리 심어 져. 각 케이지 주위에 참호를 파고 하 고 꿀벌도 주 할 수 있도록 지상으로 메쉬 케이지의 모든 4 개의 가장자리를 파고. 재고, 꽃 화분 (예: 메 밀, borage, 냉이, 코스모스와 해바라기) 꿀벌을 매력적인 것으로 알려진와 케이지 ( 그림 2).</li>
	<li>보충에 꽃 클로버의 단일 트레이 (36 cm x 42 cm)와 감 금 소. 감 금 소, 귀리에 의해 약 2.5 m x 1 m. 단조로운 나머지 케이지 영역 공간을 점령의 한 구석에 꽃 리소스 클러스터.</li>
	<li>무작위로 할당 범블 비 식민지, 각 포함 된 노동자와 단일 여왕, 치료 (균 현재/결 석, N = 치료 당 5 식민지, 총 10 식민지), 필드 케이지 내에서 그들을 장소 (N = 1/케이지) 29 일 (6 월 23 일 -2014 년 7 월 21 일).</li>
	<li>동양 식민지 상자는 식민지 &#39; 남쪽 꿀벌 최적의 탐색 조건 제공으로 가리키도록 s 구멍. 설탕 물 방광, 과즙 가용성을 보완 하기 위해 하이브 상자 내부에 배치와 함께 식민지 보조금.</li>
	<li>적용 균 chlorothalonil 기반 5 균 치료 장에 꽃 식물 분야 관련 수준 (20 g/L), 연구 (0, 13 일) 기간 동안 두 번 농약 분무기를 개최 손을 사용 하 여. 아니 더 액체 꽃 표면 ( 그림 3)에 고착 되도록 균일 하 게 꽃을 코트.</li>
	<li>필드 케이지 연구의 결론에는 연습장에서 B. 봉 식민지를 손으로 제거, 20 분-20 ° C 냉장고에 배치 하 여 두 드러 기를 냉각</li>
	<li>소독 집게를 사용 하 여 꿀벌을 제거 하 고 애벌레, 번데기, 성인 여성 수를 기록 (나. e. 채집), 그리고 성인 남성. 어머니 여왕, 애벌레, pupae, 성인 여성 (즉 채집), 그리고 성인 남성의 건조 중량을 기록 분석 균형을 사용 하 여.</li>
</ol> 2. 엉망으로 꿀벌 둥지를 사용 하 여 실험실 기반 Vivo에서 시험의 꽃가루 규정에 미생물 지역 사회에 살 균 제 노출의 효과 검사 <ol><li>Pulverize 상업적으로 구입한 꽃가루는 표준을 사용 하 여 정밀한 분말에 실험실 볼-밀입니다. UV 빛 아래에서 하룻밤 증발을 70% 에탄올에 몸을 담글 하 여 가루 꽃가루를 소독. ~0.5 mg 범용 한 천 매체에 도금 하 여 꽃가루의 무 균을 확인 합니다.
	<ol><li>건조, 소독된 꽃가루, 소독된 펫을 사용 하 여 추가 균의 필드 관련 된 복용량: 14.3%;에서 propiconazole 치료에 대 한 22.9%에서 azoxystrobin (0.74 µ L 및 0.65 µ L 각각 / 일 / 하이브). 잘 소독된 나무 막대기를 사용 하 여 혼합.</li>
	</ol></li> <li>장소 6 실험 하이브 (n = 3 각 제어 및 치료에 대 한) 깨끗 하 고 위생 실험실 벤치탑 실내 온도에 유지에서. 매일 무게 꽃가루 34 , 35 (치료)에 대 한 살 균 제 또는 표준 무 균 기술을 사용 하 여 후드 안쪽 (컨트롤)에 대 한 살 균 물과 혼합의 4.27 g.
	<ol><li>트랩 문 바깥쪽 두 드러 기, 골 판지 상자의 측에 의해 제공를 사용 하 여 두 드러 기 안에 꽃가루 소개. 매주 소독된 설탕 솔루션으로 두 드러 기를 보충 한다. 4 주 동안 정권 먹이 계속.</li>
	</ol></li> <li>20 분 긁어 소독된 집게 주걱을 사용 하 여 브루 드 챔버 내에 포함 된 꽃가루 규정 밖으로-20 ° C 냉장고에 놓고 멸 균 저장 관에서 두 드러 기 연구소 기반 연구의 결론에 냉각. 스토어-80 ° C. 수 및 기록 노동자와 시작 및 실험 (단계 1.7)의 끝에 여왕 어머니의 무게.</li>
	<li>상용 DNA 격리를 사용 하 여 꽃가루 제공 샘플에서 DNA 분리 키트 (자세한 자료 표 참조).
	<ol><li>조항의 꽃가루-추출 0.25 g 튜브, 짧게 소용돌이를 섞어 추가.</li>
		<li>는 Lysozyme 솔루션 50 µ L/샘플에 대 한 충분 한 이온을 제거 된 증류수에 200 mg/mL 확인합니다. 완전히 양식 솔루션을 적극적으로 악수.</li>
		<li>, 샘플 추출 관을 lysozyme 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 여러 번을 반전 하 여 잘 혼합. 물 욕조에 37 ° C에서 10 분 동안 튜브를 품 어. 침전을 형성 하는 경우 열 솔루션을 사용 하기 전에 해산 될 때까지 60 ° C.</li>
		<li>추출 관에 수성 세포 솔루션의 추가 70 µ L 테이프, 평판 소용돌이 패드에 가로로 보안 및 30에 대 한 10000 x g에서 10 분 원심 분리기에 대 한 소용돌이 관 실 온에서 s.</li>
		<li>깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브는 상쾌한 전송. 250 µ L 단백질 강 수 솔루션, 그리고 소용돌이의 얼음 욕조에 5 분 동안 4 ° C에서 5 미 품 추가. 
		참고: 상쾌한의 500 µ L 400 µ L 사이 기대 합니다. 상쾌한 여전히 몇 가지 입자를 포함할 수 있습니다.</li>
		<li>10000 x g에서 1 분 동안 실내 온도에 튜브 원심 하 고 깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브에 상쾌한의 최대 600 µ L를 전송. 수성 억제제 제거 솔루션, 짧게, 소용돌이의 200 µ L을 추가 하 고 5 분 원심 분리기 10000 x g.에 1 분 동안 실내 온도에 튜브는 깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브로 상쾌한의 750 µ L까지 전송 4 ° C에서 품 어.</li>
		<li>상쾌한, 그리고 5와 동을 수성 바인딩 솔루션의 추가 1200 µ L s. 스핀 필터, 실내 온도에 1 분 동안 10000 x g에서 원심 분리기에 상쾌한의 약 675 µ L 로드. 삭제를 통해 흐름.</li>
		<li>반복 2.4.7. 두 번. 
		참고: 각 샘플 처리에 대 한 3 중의 총은 필요.</li>
		<li>추가 500 µ L 에탄올, 및 30에 대 한 상 온에서 원심 분리기 10000 x g.에서 s, 흐름을 무시 하 고 g. 장소 스핀 필터 청소 2 mL 컬렉션 튜브에서 x 10, 000에서 1 분 동안 실내 온도에 다시 원심.</li>
		<li>차입의 추가 100 µ L 버퍼 필터 멤브레인의 중심입니다. 30에 대 한 상 온에서 원심 분리기 s 10000 x g. 스핀 필터 삭제. 스토어-20 ° C-80 ° C 사이의 DNA 수집</li></ol></li> <li>사용 절연 DNA 시퀀싱.
	<li>계량, <ol>그리고 fluorometric 분석에 의해 고립 된 DNA 2 ng / µ L를 정상화.
		각 추출 샘플 28S의 상대적 양을 비교 3 중에 <ol><li>준비 반응 (공장), 그 (곰 팡이), 분석 및 각 화분 제공 샘플 36의 16S (세균성) 구성 요소. 10 각 반응에 포함 되어 있는지 확인 전체 DNA, 비대칭 cyanine 염료 기반 마스터, 믹스의 2 배 및 2.5 µ L 각 정방향 및 역방향 뇌관 쌍 28KJ/28B 37 식물 및 균 dna ITS1/ITS5.8R ng 38 .</li>
		</ol></li> <li>다음 매개 변수를 사용 하 여 증폭 DNA: 50 ℃, 95 ℃에서 2 분 초기 변성에서 2 분 전 변성의 40 주기 (15 98 ° C, 15에서 s s 58 ° C, 60에서 72 ° C에), 용융 곡선 뒤.</li>
		<li>준비 16S rRNA를 대상으로 차세대 시퀀싱 라이브러리를 사용 하 여 2 단계, 중첩 된 PCR 프로토콜 v 3/V4 변수 지역 및 ITS / 5.8s rRNA 공백 지역.
		<ol><li>5 DNA의 추가 12.5 µ L pmol 각 뇌관 및 마스터 믹스 x 2의. 각 지역 (16S 또는 ITS; 표 1 참조)에 대 한 별도 반응을 확인 합니다. 시퀀서 특정 어댑터 오버행 뉴클레오티드 순서 유전자 특정 시퀀스에 추가 하려면 앞에서 설명한 39 , 40 지역 특정 뇌관 수정.</li>
			<li>다음 매개 변수를 사용 하 여 초기 증폭을 수행: 95 ° C에서 3 분 초기 변성, 25의 주기 (30 s 95 ° C, 30에서 55 ° C, 30에서 s s 72 ° C에서), 72에서 5 분 최종 확장 ° c.</li>
			<li>다음 초기 증폭, 전기 이동 기동성에 의해 라이브러리 크기 및 수량을 확인 하 고 볼륨 단단한 단계의 가역 imm x 1를 사용 하 여 청소obilization 구슬 잔여 뇌관 및 반응 시 약을 제거. 수영장 16 및 양적 각 샘플에 대 한 단일 amplicon 풀을 만들려고 그 amplicons.</li>
			<li>는 시퀀서 특정 어댑터를 추가 하 고 다음 뇌관 (표 1 참조)를 사용 하 여 특정 듀얼 인덱스 샘플. 각 뇌관 및 마스터 믹스 x 2의 5 pmol에 증폭 된 DNA의 2.5 µ L를 추가 합니다. 다음 매개 변수를 사용 하 여 라이브러리 증폭을 수행: 95 ° C에서 3 분 초기 변성, 8의 사이클 (30 s 95 ° C, 30에서 55 ° C, 30에서 s s 72 ° C에), 72에서 5 분 최종 확장 ° c.</li>
		</ol></li> <li>다음 PCR, 단단한 단계의 가역 immobilization 구슬의 1 x 볼륨을 사용 하 여 깨끗 한 완성 된 라이브러리. 전기 이동 기동성, 그리고 fluorometry, 각각 사용 하 여 완성 된 라이브러리의 양과 품질을 평가 합니다. 2 µ M 및 시퀀싱 전에 풀 라이브러리 표준화.</li>
		<li>전체 amplicon 41을 충당 하기 위해 적절 한 길이와 2 차 PCR에 추가 어댑터를 유사 플랫폼에서 다음-세대 시퀀싱을 수행.</li>
	</ol></li> <li>주석 및 미생물 구성 분석 시퀀스.
	<li>모든 시퀀스 된 라이브러리에 대 한 단일 contigs 결합 쌍-엔드 시퀀싱 데이터 (R1 및 R2) <ol>. R1 및 r 2 파일을 병합, 후 각 라이브러리에 대 한 단일 fasta 파일 생성. 
		참고:이 단계 고 (하지 않는 한 달리 명시) 아래에 설명 된 프로세스에서에서 수행 Mothur 버전 1.38.0 38.</li>
		<li>모호한 기지, 예기치 않은 긴 시퀀스, 그리고 긴 homopolymers를 제거 하려면 각 fasta 파일 화면. 
		참고: 심사, 그리고 시퀀스 제거에 대 한 매개 변수는 maxambig = 0, maxlength = 600, 및 maxhomop = 8 두 유전자에 대 한. 동일한 시퀀스를 제거 하지만 모든 라이브러리 (일명 수 표에 Mothur)에 대해 별도로 contingence 테이블.</li>
		<li>123, 실바 데이터베이스 버전에 대 한 유전자 16S 도서관과 42 단결의 데이터베이스 대 한 유전자는 라이브러리의 고유한 시퀀스 정렬. 
		참고: 시퀀스 수 주석 첨부 합니다 왕국 수준에서 속 수준.
		<ol><li>클러스터 시퀀스를 정렬 하는 그 후, 비교를 사용 하 여 함수 pre.cluster = 5, 그리고 키메라 제거.</li>
		</ol></li> <li>왕 43 (16 진)에 대 한 실바와 단결의 (유전자 ITS)에 대 한 분류 파일 (컷오프 값의 80%)에 따라 메서드를 사용 하 여 시퀀스를 분류.</li>
		<li>로드 R 44 Mothur에 분류 과정에서 생성 된 contingence 테이블 (유전자 하나씩). 미생물 커뮤니티 변경의 추가 분석을 위한 라이브러리 당 관계 되는 풍부를 얻을 각 분류학 수준. 
		참고: 각 분류학 수준에서 병합 함께 분류학 그룹 관계 되는 풍부는 모든 실험 반복에 대 한 2% 미만 때.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

꿀벌 건강에 균의 효과에 대 한 조사는 해충 관리 전략의 understudied 측면 남아 있다. 우리의 연구 명시적으로 꿀벌 감소 운전 잠재적인 요소를 분리 하는 보완 기술의 제품군을 사용 하 여이 지식 격차를 해소 하는 것을 목표로. 계획, 근거, 그리고이 실험의 렌더링 아래 자세히 나와 있습니다.
없는 꿀벌이 인구 통계학 분석을 손상 할 것입니다 이후 케이지 실험의 메쉬를 탈출 수 있도록 중요 하다. 그것은 또한 인공 둥지 비와 직접적인 햇빛에서 보호 하기 위해 충분 한 절연 있어야입니다. 살 균 제는 둥지에 직접 살포 하지 있도록 주의 한다. 식민지 설탕 물 방광 꿀 수집을 보충 하 고 탈수를 방지를 제공 한다.
실험실 먹이 실험을 기반으로, 대 한 꽃가루 식사를 준비할 때 오염을 방지 하기 위해 엄격한 무 균 조건 유지 되어야 한다. 상업적으로 구입한 화분 가루 해야 그리고 UV 사용 전에 소독. 하이브 위생 식료품 저장...

관리 하 고 야생 꿀벌 종 모두 자연 및 농업 시스템1에 대 한 주요 영향으로 광범위 한 하락 발생 하는. 이 문제의 원인을 이해 하 공동된 노력에도 불구 하 고 꿀 꿀벌 감소를 촉진 하는 요인 없습니다 아직도 잘 이해2,,34. 야생, 네이티브 꿀벌의 특정 종족에 대 한 상황이 긴박 한5,6되고있다. 꿀벌 인구 산업 농업과 교차, 그들의 인구가을 계속 하 고 가루 (전세계 생산7의 35%)을 요구 하는 작물을 감당할 것 이다 때 지속 될 수 없는 수확을 감소.
살충제 노출, 질병, 그리고 서식 지 손실1,4,8,,910 등 많은 잠재적인 요인 꿀 꿀벌 쇠퇴에 연루 되었습니다 동안 상대적으로 작은 네이티브 꿀벌 건강, 또는 농업 시스템 근처에 이러한 스트레스의 대화형 효과 대 한 알려져 있다. 많은 현재 연구 노력은 지난 연구는 균도 역할을 할 수 꿀벌 감소에 메모리 형성을 방해 하 여 나타냅니다 있지만 살충제, (예를 들어, neonicotinoids11,,12)에 초점을 계속합니다 후 각 리셉션13, 둥지 인식14, 효소 활동 및 신진 대사 기능15,,1617. 세계적으로, 균 꽃 중 꽃 작물에 적용 될 계속. 최근 연구는 꿀벌 일반적으로 살 균 제 잔류물 다시가지고 하이브18, 참으로, 연구 시험된 두 드러 기 포함 된 살 균 제 잔류물19,20의 큰 비율을 문서화 했다. 추가 작업은 그 살 균 제 잔류물은 꿀 꿀벌 애벌레 사망률21,,2223 의 높은 속도 식민지, 이내 "꽃가루 안치"의 존재와 관련 계시 했다는 비록 비-독성, 미생물 활동 없는 이며 영양 손상된24입니다. 살 균 제 "비 안전"에 고려 오래는 사실에도 불구 하 고 지금 증거는 혼자 살 균 제에 노출 네이티브 범블 비 종, Bombus 봉25심각한 식민지 손실을 발생할 수 있습니다.
살 균 제 노출 및 식민지 사이의 인과 관계를 설정 하려면 사망률, 이러한 화학 물질의 식 은 결정 될 필요가 있다. 균 류를 대상으로 토양26, 퇴적 물27, 및 수 중 환경28, 입증, fungicides 가장 가능성이 변경 곰 팡이 풍부 하 고 꽃가루-규정, 주요 지역 사회를 호출 함으로써 다양성을 이동 강력 하 게 박테리아를 선호 하는 수 있습니다. 곰 팡이 경쟁 또는 길 항 근, 없이 특정 병원 성 박테리아 상대적으로 되지 않은, 꽃가루 규정의 부패를 촉진 확산 수 있습니다. 과거의 연구 보여주었다 미생물, 효 모 및 filamentous 곰 팡이, 특히 꿀벌29,,3031영양 symbionts 역할 기생충 및 병원 균32 ,33, 꽃가루 점포의 장기 보존을 제공. 살 균 제, 따라서 수 있습니다 직접 해 하지 미 숙 꿀벌 및 기회 주의 병원 체와 기생충12민감성을 증가 하 여 이러한 서비스를 제공 하는 데 필요한 미생물 지역 사회를 방해 하 여. 식량 생산에 대 한 요구 증가 함께 전세계 작물은 되 고 살포 매년 균 같은 균 유발 효과의 정도 이해 하는 필요를 강조 하는 꽃 중.
날짜, 생태 다음과 같은 질문으로 나타낼 수 있습니다 네이티브 벌 미생물에 관한 기본 지식 간격: 어느 정도 살 균 제 변경지 않습니다 꿀벌 꽃가루-규정 내에서 미생물 커뮤니티? 뿌리깊은 변경 된 미생물 지역 사회와 함께 꽃가루를 소모의 다운스트림 영향 입니까? 이러한 생태학적으로 밀접 한 질문에, 실험 1을 공개 하는의 기본 목표와 함께 개발 되었다) 그 살 균 제 잔류물 혼자 네이티브 꿀벌 종; 가혹한 식민지 감소를 일으킬 수 있습니다 2) 꽃가루 조항에 미생물 지역 사회 살 균 제, 및 3 변경 되는 있는 정도) 어떻게 꿀벌 건강 심각 하 게 변경 된 미생물 지역 사회에 의해 영향을 받습니다. 실험 목표는 실험실 및 필드 기반 실험의 조합을 사용 하 여 위의 질문을 해결 하기 위해 정의 되었다. 의 상태--예술 metagenomic 및 현장 관찰의 전통적인 방법과 함께 분자 기술을 사용 하 여,이 연구는 꿀벌 건강에 균의 잠재적인 영향을 목표로 한다.
이 연구의 첫 번째 목적은 혼자 살 균 제 노출 네이티브 꿀벌 종 가운데 중요 한 식민지 손실을 발생할 수 있습니다 설명 하는 것입니다. 큰 필드 연습장을 포함 한 연구 Bombus 봉, (그림 1, 그림 2, 그림 3) 미국에서 유비 쿼터 스, 풍부한 네이티브 꿀벌의 식민지 성장에 살 균 제 노출의 효과 조사 하기 위해 사용 되었다. 그것은 낮은 체력과 비정형 인구 비 노출 두 드러 기에 비해 균 치료 하이브 제시는 가설 했다. 이 실험에서 얻은 데이터 꽃가루 내에서 살 균 제 잔류물 네이티브 범블 비 종25에 깊은 식민지 손실의 유일한 원인이 될 수 있습니다을 보여주는이 가설을 지원. 이 연구의 두 번째 목적은 꽃가루 미생물 살 균 제 노출에 대 한 응답을 조사 하는 것입니다. 균에 노출 되어 꽃가루 규정 내에서 미생물의 커뮤니티 구성 치료 꽃가루의 다른 것을 가정 했다. 곰 팡이 풍요로 움과 다양성은 크게 하락 예상, 박테리아 및/또는 하나의 지배적인 균 종 다른 경쟁 곰 팡이의 부재에서 선택 하지 않은 성장할 가능성이 것입니다. Vivo에서 시험의 시리즈를 통해 미생물 지역 사회 구성에 이러한 교대 metagenomics를 사용 하 여 분석 됩니다.

<table><tbody><tr><td>Natupol Beehive</td><td>Koppert</td><td>USRESM1</td><td>16 벌통</td></tr><tr><td>Propiconazole 14.3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propiconazole 14.3 %</td></tr> <tr><td>Abound</td><td>Syngenta</td><td>4033540</td><td>Azoxystrobin 22.9 %</td></tr> <tr><td>Chlorothalonil</td><td>Syngenta</td><td>3452</td><td>시험에 사용되는 살균제</td></tr><tr><td>꽃가루 과립</td><td>구출 꿀벌</td><td>B004D5650C</td><td>3X 16oz 시험용 병, 꽃가루</td></tr><tr><td>접종용 박테리아 균주</td><td>Currie Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>접종용 효모 균주</td><td>Hittinger lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer 쌍</td><td>UW Biotech Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 분리 키트</td><td>Mo Bio</td><td>12830-50</td><td>상업용 DNA 분리 키트</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 분석 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td>DNA 정량 분석 도구</td></tr>: <tr>CFX <td>Thermo Fisher</td><td>용 마스터 믹스 선택</td><td>4472952</td><td>SYBR GreenER 염료를 사용하여 Real-Time PCR을 수행하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Real-Time PCR 검출 시스템</td><td>Bio Rad</td><td>1855196</td><td>PCR 증폭에 사용되는</td></tr><tr><td>기기 PCR Clean-Up Kit,</td> <td>Axygen</td><td>10159-696</td><td>통합되지 않은 dNTP, 염 및 효소의 효율적인 제거에 사용</td></tr><tr><td>DNA 1000 Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>DNA 단편의 크기 조정 및 분석에 사용</td></tr><tr><td>MiSeq Sequencer</td><td>Illumina</td><td></td><td>차세대에 사용 염기서열분석</td></tr><tr><td>모듬 유리 제품(비커, 플라스크, 피펫, 시험관, 리피터)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

실험, metagenomic, 및 계산 기법 밝히는 어떤 균 타협 꿀벌 건강 메커니즘

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

재배 자 종종 질병, 살 균 제 잔류물에 꿀벌 노출에 대 한 작물을 보호 하기 위해 꽃 동안 균 스프레이 사용 합니다. 비록 "비-안전한" 것으로 간주, 살 균 제 잔류물 꽃가루에 꿀벌 (꿀, 범블 비 종)에 대 한 감소와 관련 된 장착 증거가 있다. 메커니즘 상대적으로 알 수 없는 동안, 연구원은 비 미생물 공생 관련 된 추측 있다. 미생물 보존 또는 꽃가루는 꿀벌 애벌레에 대 한 영양 역할의 처리에서 중추적인 역할을 한다. 미생물 커뮤니티를 바꿔서 fungicides 이러한 미생물 중재 서비스를 중단 함으로써 꿀벌 건강을 손상 가능성이 높습니다. 이 원고는 간접 따라 장치를 마더보드에 있는 fungicides 식민지 감소 일으킬 수를 조사 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 케이지 실험 균 치료 꽃에 꿀벌 노출 이미 fungicides 네이티브 범블 비 (Bombus 봉)에 깊은 식민지 손실 원인 첫 번째 증거 제공. 균의 필드 관련 된 복용량을 사용 하는 일련의 실험 균 노출 꽃가루의 미생물 지역 사회 역학의 미세한 설명 개발 되었습니다. 곰 팡이 및 세균 assemblages 꽃가루 미생물 내에서 구조 구성의 변화는 다음 세대 시퀀싱 및 metagenomic 분석 조사. 실험 본 개발 fungicides 꽃가루 규정의 미생물에 미치는 영향에 대 한 기계적 이해를 제공 하기 위해 설계 되었습니다. 궁극적으로, 이러한 결과 해야 통해 fungicides 식민지 하락 일으킬 수 간접 통로에 빛을 발산 하 고 있다.

필드 케이지 연구:
케이지 실험에서 얻은 데이터 범블 꿀벌 식민지 살 균 제 노출에 대 한 중요 한 응답 했다는 것을 보여주었다. 균 치료 두 드러 기 생산 제어 두 드러 기 보다 훨씬 적은 수의 노동자 (12.2 ± 3.8, 평균 ± SE) (43.2 ± 11.2, F1, 9= 6.8, p = 0.03) (그림 4). 또한, 균 치료 하이브 (0.91 g ± 0.15)의 비 바이오 매스는 제어 두 드러 기 (2.36 g ± 0.55; 보다 훨씬 낮은 F 1, 9 = 8.3, p = 0.02). 균 치료 두 드러 기에서 낮춘된 바이오 매스의이 패턴 또한 어머니 퀸 즈 사이에서 관찰 되었다. 균 치료...

범블 비 하이브 내 미생물 컨소시엄 풍부 하 고 꽃가루 꿀벌 애벌레에 대 한 유지. 살 균 제 잔류물 꽃가루 미생물, 및 궁극적으로 식민지로 이어지는 식민지 인구 통계를 변경 하는 가설을 테스트 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다이 원고 실험실 및 필드 기반 실험 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 손실입니다.

실험, Metagenomic, 및 계산 기법 밝히는 어떤 균 타협 꿀벌 건강 메커니즘

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

이 다학제적 프로젝트의 전반적인 목표는 꽃가루의 살균제 잔류물이 호박벌의 군집 감소를 유발할 수 있는 특정 메커니즘을 분리하는 것입니다. 이 방법은 꿀벌 미생물 공생의 살균제 매개 파괴에 의해 영향을 받는 애벌레 호박벌의 높은 폐사율과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 꿀벌 꽃가루 내 미생물 군집의 변화와 함께 꿀벌 인구 통계를 추적하여 꿀벌에 대한 살균제의 간접적인 영향을 조사한다는 것입니다.이러한 방법은 토종 꿀벌의 건강에 대한 통찰력을 제공하지만, 전 세계적으로 작물 수분에 중요한 역할을 하는 꿀벌과 같은 다른 수분 매개자에도 적용할 수 있으므로 꽃이 피는 작물에 살균제를 현명하게 적용하는 것을 강조할 수 있습니다. 이 공동 연구에서 절차를 시연하는 사람은 Prarthana Dharampal, Luis Diaz-Garcia 및 Caitlin Carlson입니다. 시작하려면 귀리가 심어진 밭에 메쉬 케이지를 설치하십시오.반복실험당 하나씩 준비합니다. 단일 처리 실험을 위해 최소 10개를 만들 계획을 세우십시오. 먼저 각 케이지 주위에 도랑을 파고 메쉬 케이지의 네 모서리를 모두 땅으로 파서 꿀벌이 탈출할 수 없도록 합니다.그런 다음 메밀, 보리지, 알리섬, 코스모스 및 해바라기와 같이 꿀벌에게 매력적인 것으로 알려진 화분에 심은 꽃 식물을 케이지에 비축합니다. 또한 각 케이지에 꽃이 핀 클로버 한 트레이를 보충하십시오. 약 2.5제곱미터를 차지하는 케이지의 한쪽 구석에 모든 꽃 자원을 클러스터링합니다.나머지 케이지 표면적을 귀리로 식물화하십시오. 군체를 필드 케이지에 넣기 전에 각 군체에 일개미와 한 마리의 여왕벌이 포함되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 29일 동안 케이지당 하나의 콜로니를 로드합니다.케이지에서 꿀벌에게 최적의 항해 조건을 제공하기 위해 군체의 개구부가 남쪽을 가리키도록 군체 상자의 방향을 지정합니다. 다음으로 케이지의 절반에 실험적 처리를 적용합니다. 이 경우 휴대용 살충제 분무기를 사용하여 꽃이 피는 식물에 적합한 수준의 클로로탈로닐 기반 살균제를 도포합니다.이 트리트먼트는 0일째에 적용하고 13일째에 다시 적용합니다. 꽃 표면에 추가 액체가 달라붙지 않도록 꽃을 균일하게 코팅합니다. 연구 기간이 끝나면 우리에서 군체를 제거하고 군체를 섭씨 영하 20도의 냉동고에 20분 동안 넣어 꿀벌을 마취합니다.마취가 끝나면 멸균 집게를 사용하여 꿀벌을 제거하고 유충, 번데기, 성인 암컷 및 성인 수컷, 어미 여왕의 수를 기록합니다. 그런 다음 분석 저울을 사용하여 어미 여왕과 다른 종류의 꿀벌의 건조 중량을 기록합니다. 먼저 시중에서 구입한 꽃가루를 표준 실험실 볼 밀을 사용하여 미세한 분말로 분쇄합니다.그런 다음 가루 꽃가루를 살균하려면 70% 에탄올에 담그십시오. 에탄올이 생물 안전 캐비닛에서 자외선 아래에서 밤새 증발하도록 합니다. 다음날, 멸균 이쑤시개를 사용하여 범용 한천 배지에 소량을 도금하여 꽃가루의 무균 여부를 확인합니다.플레이트를 섭씨 28도에서 48시간 동안 배양하고 성장이 없는 경우에만 사용하십시오. 다음으로, 멸균 피펫을 사용하여 멸균된 꽃가루에 현장에 적합한 용량의 살균제를 첨가하고 멸균 나무 막대기를 사용하여 두 가지를 완전히 혼합합니다. 제어를 위해 멸균수를 사용하십시오.이제 실험을 위해 벌통을 최소 3개의 표본 크기로 준비합니다. 매일 각 벌통에 대해 꽃가루 분취액을 무균으로 준비합니다. 그런 다음 각 벌통을 둘러싸고 있는 상자의 트랩 도어를 통해 꽃가루를 넣습니다.꽃가루 외에도 매주 각 벌통에 살균된 설탕 용액을 제공하십시오. 4주 동안 이 수유 요법을 수행한다. 이전과 마찬가지로 테스트 기간이 끝나면 두드러기를 마취합니다.그런 다음 꽃가루나 애벌레 벌이 둥지 깊숙이 떨어지지 않도록 굴 내용물을 아주 부드럽게 들어 올려 열고 발굴합니다. 벌통에 대해 이전과 동일한 계수 및 무게 측정 기준을 수행하되 멸균된 집게를 사용하여 부화실 내에 포함된 꽃가루 공급도 긁어냅니다. 멸균 튜브에 꽃가루를 모은 다음 나중에 분석할 수 있도록 섭씨 영하 80도에 보관하십시오.케이지 실험에서 얻은 데이터는 호박벌 군체가 살균제 노출에 대해 상당한 반응을 보였다는 것을 보여주었습니다. 살균제를 처리한 벌통은 대조군 벌통보다 훨씬 적은 수의 일꾼을 생산했습니다. 전체 바이오매스는 또한 Mother Queen's mass를 포함하여 살균제 처리된 벌통에서 감소했습니다.그런 다음 유충, 번데기 및 성인 수컷의 수와 질량은 영향을받지 않았습니다. 실험실 기반 실험은 현장 기반 결과를 반영했습니다. 종합하면, 이러한 결과는 이전에 발표된 결과와 일치하며 살균제 노출이 군체 적합성에 영향을 미친다는 것을 나타냅니다.우리의 데이터는 살균제 처리된 벌통에서 미생물 다양성과 균일성이 감소했음을 보여줍니다. 꽃가루 공급에 대한 균유전체 분석은 살균제 처리된 벌통의 미생물 군집의 변화를 분석하는 데 사용되었습니다. 살균제로 처리된 벌통에서는 일반적으로 분리된 연쇄상균류(Streptomycetales)와 엔테로박테리아(Enterobacteriales)의 풍부함이 크게 감소한 반면, 절지동물의 일반적인 병원체를 포함하는 리케치알레스(Rickettsiales)목의 박테리아 구성원은 살균제로 처리된 벌통에서 훨씬 더 많았습니다.살균제 처리된 벌통은 또한 Eurotiales, Sordariales 및 Saccharomycetales 주문에 속하는 곰팡이의 풍부도가 낮았으며 실제로 Capnodiales 및 Ascosphaerales 주문에서 곰팡이의 풍부도를 증가시켰습니다. 이러한 결과는 살균제가 꽃가루 공급의 마이크로바이옴을 변경하여 꿀벌 미생물 공생을 효과적으로 방해하고 꿀벌의 건강을 손상시킬 수 있음을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 들판에서 호박벌을 배양하고, 꿀벌 둥지를 해부하고, 꿀벌 꽃가루 공급의 미생물 군집을 식별하여 꿀벌 군집 건강에 대한 살균제의 역할을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.일단 숙달되면 이러한 기술을 사용하여 꽃가루 마이크로바이옴의 살균제 매개 파괴와 호박벌 군집의 전반적인 건강에 대한 간접적인 영향을 입증할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 감염 및 감염을 피하기 위해 꽃가루 식사를 준비하는 동안 무균 상태를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 미생물 군집 구조에 대한 설명은 염기서열 간의 전체 차이의 비율을 완화하고 상대적 풍부도가 낮은 분류군을 병합하여 분류군의 수를 줄임으로써 더욱 개선될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

이 원고는 자유 비행 꿀벌에 대한 간단한 비 침습적 방법뿐만 아니라 억제 꿀벌의 정확한 지역화 된 처리 수 있도록 더 많은 침략 변종을 포함, 꿀벌에 약리 에이전트를 관리하기위한 여러 프로토콜을 설명합니다.

절제된 자유 비행 꿀 꿀벌의 Neuropharmacological 조작,<em&gt; API를 mellifera이</em

여기에서 우리는 제시   방법은 개별 꿀벌과 벌집 콜로니 모두 농약 오염 된 식품을 공급한다. 절차는 기본 유생 다이어트 생체 공급함으로써, 또한 벌집 콜로니의 자연 상태에서 개별 꿀벌의 살충제 효과를 평가한다.

식민지 수준에 개인에서 꿀 꿀벌 개발에 대한 환경 화학 물질의 효과를 평가

꿀벌 식민지의 손실은 작물 수분 서비스에 대한 도전입니다. 현재의 pollinator 보호 관행은 혐기성 화학 물질을 사용하여 유해한 농약에 대한 꿀벌의 접촉을 최소화하기위한 대체적인 접근법을 보증합니다. 여기서 우리는 벌에 대한 억지력을 스크린하기위한 시각적 추적 프로토콜에 대한 상세한 방법을 제공합니다.

꿀벌을위한 억제 성 화학 물질을 차단하는 비디오 추적 프로토콜

농약의 sublethal 복용량만 주기적 또는 시각적 방법을 사용 하 여 검출 하기 어려운 방법으로 식민지 영향을 미칠 수 있습니다. 총 성인 꿀벌 질량을 측정 하는 방법 가만히, 그리고 식량 자원 하이브와 하이브 부품 무게, 프레임, 촬영 및 센서를 설치 하 여 제공 됩니다. 데이터 분석은 또한 해결 되었습니다.

꿀 꿀벌에 Sublethal 농약 노출의 식민지 수준 효과 모니터링

꽃 식물에 균 스프레이 고독한 꿀벌 꽃가루 부담 균 잔류물의 높은 농도에 노출 될 수 있습니다. 실험실 기반 실험 체 외에관련 된을 사용 하 여-reared 꿀벌 애벌레,이 연구 균 처리 꽃가루 호스트와 호스트 비 식물에서 파생 된 소모의 대화형 효과 조사.

생체 외에서 고독한 꿀벌의 양육: 애벌레 위험 요소를 평가 하기 위한 도구

이 프로토콜은 농약이 꿀벌(아피스 멜라이프라)재생에 미치는 이해를 향상시키기 위해 개발되었으며, 꿀벌 여왕과 그 노동자 관리인을 통제 된 실험실 환경에서 농약에 노출시키는 방법을 확립하고 관련 반응을 주의 깊게 모니터링합니다.

꿀벌 여왕을 짝짓기하는 농약적 위험 평가

본 프로토콜은 고독한 꿀벌 인 Osmia excavata의 유충에게 살충제로 오염 된 조항을 먹이는 방법을 설명합니다. 이 절차는 독방 꿀벌의 유충에 대한 살충제의 생태 독성을 검사합니다.

살충제가 독방 꿀벌의 유충에 미치는 영향 평가

글리포세이트 기반 제품(GBP)은 전 세계적으로 가장 일반적인 광범위한 스펙트럼 제초제입니다. 이 기사에서는 현장 실험에서 생물 정보학 분석에 이르기까지 GBP가 미생물에 미치는 영향을 정량화하기위한 일반적인 지침을 소개합니다.

글리포세이트 기반 제품이 마이크로바이옴에 미치는 잠재적 영향의 정량화

우리는 현장에서 채취한 꿀벌을 안전하게 취급하기 위한 검증된 방법을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 샘플링 중에 수집된 꽃가루를 통해 식물-곤충 상호 작용의 신속한 조작, 식별, 유전자 샘플링 및 확인을 수행할 수 있습니다. 쉽게 적응할 수 있는 이 접근 방식은 희귀 곤충 그룹을 연구하는 데 비용 효율적이고 치명적이지 않은 수단을 제공합니다.

현장에서 꿀벌을 가두고 안전하게 다루는 신속한 방법

여기에서는 증폭 준비 세포 용해, 재조합효소 중합효소 증폭 및 CRISPR/Cas12a 분석을 사용하여 Lotmaria passim 및 Nosema ceranae 와 같은 꿀벌 병원체에서 DNA를 검출하는 간단하고 빠른 절차를 설명합니다.

RPA/CRISPR/Cas12a 시스템과 결합된 알칼리 용해를 통한 트리파노소마티드 기생충 및 노세마 세라네 의 현장 DNA 검출

학습하세요 살충제 잔류물이 꿀벌 집단 감소를 유발하는 메커니즘을 밝히는 실험 및 메타게놈 분석 방법을. 이 연구는 Bombus spp.의 미생물 공생 관계와 건강을 평가합니다.

실험, Metagenomic, 및 계산 기법 밝히는 어떤 균 타협 꿀벌 건강 메커니즘

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