인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

우리는 옵신으로 재구성된 큰 단층 리포좀에서 인지질 스크램블을 측정하기 위한 형광 기반 분석을 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 일반적인 G 단백질 결합 수용체를 큰 단층 소포로 재구성하고 형광 기반 분석을 사용하여 지질 이중층을 가로질러 인지질의 80p 독립적인 전좌를 수행하는 능력을 측정하는 것입니다. 이 방법은 지질을 제거할 수 있는 단백질의 분자 정체성이 무엇인지, 그리고 그 메커니즘이 무엇인지와 같은 세포 간 지질 수송 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 안정적이고 견고하다는 것입니다.

일단 주어진 지질 조성물과 선호하는 세제에 대한 재구성 절차가 확립됩니다. 이 절차를 시작하려면 유리 주사기를 사용하여 둥근 바닥 플라스크에 POPC와 클로로포름의 밀리리터당 25밀리그램 용액 1435마이크로리터를 추가합니다. POPG와 클로로포름의 밀리리터당 25밀리그램 용액 160마이크로리터를 첨가하여 POPC와 POPG의 9:1 몰비에서 52.5 마이크로말리지질을 얻습니다.

다음으로, 145 RPM으로 설정된 회전 증발기를 사용하여 30분 동안 지질을 건조시킵니다. 건조가 완료되면 플라스크를 진공 데시케이터로 옮겨 실온에서 3시간 동안 사용합니다. 그런 다음 10ml의 완충액 A를 첨가하여 죽은 지질 막을 수화합니다.

균일한 탁한 현탁액이 형성될 때까지 플라스크를 부드럽게 휘젓습니다. 실온 수조에서 40 분 동안 10 킬로헤르츠의 주파수로 서스펜션을 초음파 처리합니다. 그런 다음 압출기를 사용하여 400나노미터 공극 크기의 멤브레인에 샘플을 10회 통과시킵니다.

그런 다음 200나노미터 공극 크기의 멤브레인을 통해 샘플을 4회 통과시키는 두 번째 압출 사이클을 수행합니다. 직경이 약 175나노미터인 인지방질의 큰 단층 소포를 포함하는 눈에 띄게 더 선명한 현탁액을 제쳐둡니다. 압출이 완료된 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 13 x 100mm 유리관에서 표준물질을 준비합니다.

그런 다음 각 LUV 및 프로테오리포좀 샘플 10마이크로리터를 고유한 유리관에 추가하고 40마이크로리터의 탈이온수 증류수로 희석합니다. 각 튜브에 300마이크로리터의 과염소산을 넣고 가열 블록에서 섭씨 145도에서 1시간 동안 가열합니다. 증발을 방지하기 위해 각 튜브에 대리석을 놓습니다.

그런 다음 튜브를 실온으로 식히고 각각에 1ml의 탈이온수 증류수를 추가합니다. 400 리터 당 12 그램의 몰리브덴산 암모늄과 아스코르브산 나트륨 리터당 50 그램을 포함하는 갓 준비된 용액 50 마이크로 리터를 각각 추가하고 혼합하기 위해 와류를 첨가합니다. 증발을 방지하기 위해 대리석을 사용하여 섭씨 100도에서 10분 동안 튜브를 가열합니다.

그런 다음 가열 블록에서 튜브를 제거하고 실온으로 식히십시오. 797나노미터로 설정된 분광계를 사용하여 표준을 사용하여 검량선을 얻습니다. 그런 다음 블랭크에 대한 샘플의 흡수도를 측정하고 인산염 함량을 측정합니다.

먼저 800마이크로리터의 각 압출 LUV 현탁액을 고유한 2밀리리터 마이크로퓨즈 튜브에 피펫팅합니다. 버퍼 A에 용해된 5.3마이크로리터의 버퍼 A와 34.7마이크로리터의 10%질량/부피 DDM을 각 튜브에 추가합니다. 다음으로, 엔드 오버 엔드 mixing을 통해 실온에서 3시간 동안 샘플을 배양합니다.

샘플이 배양되는 동안 유리 비커에 담긴 구슬 샘플당 400mg의 무게를 잰다. 메탄올 샘플당 5ml로 비드를 세척하고 10분 동안 천천히 저어줍니다. 메탄올에 대해 한 번, 물로 세 번, 완충액 A로 한 번 이 세척을 반복합니다.샘플 배양의 마지막 30분 동안 질소 스트림 아래에서 나사 캡 유리관에서 NBD 표지 인지질의 샘플당 9.5마이크로리터를 건조시킵니다.

그런 다음 완충액 A에 0.1% 질량 당 DDM의 샘플당 45마이크로리터를 첨가하여 건조된 인지질을 용해시킵니다. 배양이 완료된 후 용해된 MBD 표지된 인지질 용액을 각 샘플에 추가합니다. 그런 다음 0.1% DDM, 완충액 A 및 DDM 가용화 옵신을 원하는 양으로 이 순서대로 첨가하여 7밀리몰 DDM의 농도를 가진 1밀리리터의 최종 부피를 얻습니다.

막 단백질의 재구성은 부풀어 오르는 것이 녹지 않도록 충분한 세제로 소포를 처리함으로써 이루어집니다. 그리고 모든 지질 조성 및 세제에 대해 경험적으로 발견되어야 하는 이러한 조건은 단백질이 리포솜에 통합될 것입니다. 실온에서 1시간 동안 샘플을 혼합합니다.

그런 다음 준비된 폴리스티렌 비드 80mg을 각 튜브에 추가하고 엔드 투 엔드 혼합으로 실온에서 1시간 동안 다시 배양합니다. 각 샘플에 폴리스티렌 비드 160mg을 추가로 첨가하고 엔드 투 엔드 믹싱으로 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 구슬을 남겨두고 샘플을 각각 160mg의 새 구슬이 들어 있는 깨끗한 유리관으로 옮깁니다.

빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 밤새 끝마다 혼합합니다. 다음으로, 비드가 없는 샘플을 고유한 microfuse 튜브로 옮깁니다. 스크램블라제 활성 분석을 준비하기 위해 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

먼저 1950마이크로리터의 버퍼 A를 플라스틱 교반 막대가 들어 있는 플라스틱 큐벳에 추가합니다. 그런 다음 준비된 프로테아리포좀 샘플 50마이크로리터를 추가합니다. 샘플이 형광 분광계에서 5초 동안 계속 교반하면서 평형을 이루도록 합니다.

샘플이 평형을 이루는 동안 0.5 몰 완충되지 않은 트리스에 1몰 디티오나이트 용액을 준비합니다. 470나노미터의 여기(excitation), 530나노미터의 방출, 0.5나노미터의 슬릿 폭으로 형광 모니터링을 시작합니다. 안정적인 신호를 얻기 위해 50초 동안 녹음합니다.

그런 다음 40마이크로리터의 1몰 디티오나이트 용액을 큐벳에 추가합니다. 최소 500초 동안 형광을 기록합니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 분석합니다.

형광 데이터의 완전한 분석을 위해 재구성할 수 없는 소포의 분율을 결정하기 위한 경우입니다. 재구성된 소포에서 단백질과 지질의 회복 및 소포의 크기 분포. 이 연구에서는 opsin을 대형 단층 소포로 재구성하여 형광 기반 분석을 사용하여 스크램블라제 활성을 특성화합니다.

소포는 NBD-PC로 재구성되며, 이는 외부 소엽과 내부 소엽 사이에 균등하게 분포합니다. 디티오나이트는 소포 외부에 있는 NBD의 니트로 그룹을 비형광 아미노 그룹으로 환원시켜 단백질이 없는 리포좀에서 형광을 50% 감소시킵니다. 그러나 옵신이 내부 소엽과 외부 소엽 사이의 NBD 이동을 촉진하면 형광이 완전히 손실됩니다.

다양한 단백질 대 인지질 비율에서 이 접근법의 대표적인 결과는 여기에서 볼 수 있습니다. 형광 감소의 확장은 소포로 재구성된 옵신의 양에 따라 증가하며, 그 범위는 0에서 4.95마이크로그램입니다. 지시된 시간에 디티오나이트를 첨가하고, NBD 형광을 400초 동안 모니터링하였다.

형광 감소는 단백질 대 인지질 비율이 높을수록 더 중요하며, 가장 큰 감소는 85%입니다.그런 다음 종말점 형광 감소를 사용하여 스크램블라제 활성의 확률, Polson 통계를 사용하여 소포가 하나 이상의 스크램블라제를 가질 가능성을 결정합니다. 빨간색 곡선은 옵신에 대한 단일 지수 적합치를 나타냅니다. 회색 점선은 옵신을 단량체, 미리 형성된 이량체 또는 미리 형성된 사량체로 소포로 재구성하기 위한 단일 지수 적합을 나타냅니다.

우리가 설명하는 방법은 다양한 요구에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 절차는 다재다능하며 향후 다른 막 단백질의 인지질 스크램블라제 활성을 식별하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 재구성 절차는 모든 막 단백질에 적용할 수 있습니다.

이 기술을 통해 생화학적으로 검증된 최초의 인지질 스크램블라제인 옵신을 식별할 수 있었고 단백질의 다양한 확인 상태의 활성과 다양한 지질을 운반하는 능력을 특성화할 수 있었습니다.