Name: 인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 배우세요 형광 기반 분석법을 사용하여 대형 단층 리포솜에 재구성된 opsin의 인지질 스크램블레이스 활성을 측정하는 방법입니다. 이 기술은 세포 간 지질 수송 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) 및 Austrian Science Fund (FWF) 프로젝트 J3686 (B.P.)의 지원을 받았습니다.

리포좀과 테오 1. 준비 <ol><li> 리포좀 형성 <ol><li> 유리 주사기를 사용하여, POPC 몰비 52.5 μmol 지질을 수득하는 둥근 바닥 플라스크에 (클로로포름, 25 ㎎ / ㎖) 160 μL의 POPG (클로로포름, 25 ㎎ / ㎖) 1435 μL의 POPC를 추가 POPG = 9 : 1. </li><li> (물 욕 용제이 볼륨이 필요 없음) 145 rpm의 회전 속도로 회전 증발기를 사용하여 30 분 동안 지질을 건조한 후, 실온에서 밤새 적어도 3 시간 또는 위해 진공 데시 케이 터로 플라스크를 전송할 (RT). </li><li> 의 50 mM HEPES pH 7.4의 100 mM의 NaCl을 10 mL의 건조 된 지질 막을 수화 부드럽게 균질 현탁액 혼탁 결과까지 플라스크를 소용돌이 그래피 (이하, 완충액 A라고 칭함); 주 :이 단계에서 지질 농도가 더 손실이 지금까지 발생하지 정상적으로 5.25 mm로 할 것으로 예상된다. </li><li> 주파수 O 실온에서 10 분 동안 수욕에서 초음파 처리 현탁액F 40 kHz에서. 이 솔루션은 다소 명확하게 볼 것이다. </li><li> 압출기를 사용하여 200 nm의 기공 크기를 갖는 멤브레인을 4 패스로 돌출하는 제 2 사이클에 이어 400 nm의 기공 크기를 가진 막을 통해 현탁액을 10 회 통과한다. 참고 얻어진 LUVs의 평균 직경은 ~ 175 ㎚이다. 필요한 경우, LUVs의 크기 및 동질성은 제조업체의 지시에 따라 동적 광산란에 의해 확인 될 수있다. </li><li> 섹션 1.2의 설명 참조) LUV 현탁액의 인지질 농도를 정량화. 참고 : 압출 동안 손실의, 농도는 일반적으로 약 3.6 밀리미터 때문입니다. </li><li> 즉시 사용하지 않을 경우 약 2 주 동안 4 ° C에서 LUVs를 저장합니다. </li></ol></li><li> 인지질 정량 주 : 인지질 재구성에 사용 LUV 현탁액의 농도뿐만 아니라, 최종적으로 생성되는 테오의 등을 결정하기 위해, 샘플의 분취 액이다 subje과염소산에 의해 산화 cted. 이 절차는 기준 (23)과 비교하여 비색 분석에 의해 정량화 무기 포스페이트 방출 인지질을 분해. <ol><li> 탈 이온화 증류수 인산 나트륨 40 mM의 스톡 용액 (NA 2 HPO 4)을 준비한다. </li><li> 4 mM의 교정 기준이 될 수있는 솔루션을 0.4mm의 작동을 얻기 탈 증류수 원액을 희석. </li><li> 작업 용액을 사용하여, 0 내지 50 μL의 최종 부피 80 nmol의 인산 나트륨 범위 13 × 100 ㎜ × 2 유리관의 표준 제조. </li><li> LUV 및 proteoliposome 샘플을 각각 정량 10 μl를 타고 13 × 100 ㎜ × 2 유리 튜브에 DDH 2 O 40 μl를 희석. 주 : LUVs와 테오의 지질 농도 범위이므로 2.5-5 μM, 시료 10 μL을 25-50 nmol의 지질 인을 함유한다.</li><li> 가열 블록에서 145 ° C에서 1 시간 동안 기준 샘플과 열 각각에 300 μL 과염소산 추가. 증발을 방지하기 위해 튜브에 구슬을 넣어. </li><li> 튜브는 실온으로 냉각하자 DDH 2 O 1 ㎖를 추가 </li><li> 갓 준비 12g / L의 몰리브덴 산 암모늄 및 50g / L의 아스 코르 빈산 나트륨과 소용돌이 각각 혼합하는 400 μl를 추가합니다. </li><li> 튜브 위에 구슬 100 ° C에서 10 분 동안 가열한다. 가열 블록의 튜브를 제거하고 실온으로 냉각하자. </li><li> 797 nm의 파장에서 분광 광도계로 블랭크 (0 nmol의 인산 나트륨을 함유하는 표준 시료)에 대하여 샘플의 흡광도를 측정한다. </li><li> 교정 표준 곡선에 대한 샘플의 인산 함량을 결정합니다. </li></ol></li><li> 옵신의 재구성 주 : 이들의 세제의 특성에 의존 할뿐만 아니라, 재구성을위한 최적의 팽윤 상태를 결정할 필요가있다LUVs의 지질 조성 및 농도. LUVs이 과정을 붓기에 자신의 광 산란 특성을 변경하면 리고와 레비 (24)와 Geertsma 등. (25)에 의해 검토로 흡광도 (그림 2)을 측정하여 모니터링 할 수 있습니다. <ol><li> 피펫 LUVs 800 μL (섹션 1.1에서, 압출 후의 지질 회수가 70 %이기 때문에, LUVs 예상 농도 3.6 mM의 인지질 인) 2 ㎖의 미세 원심 분리 튜브에. </li><li> A. DDM 버퍼에 용해 (/ V는 W)의 완충액 A 5.3 ㎕의 10 % 34.7 μl를 추가 </li><li> 엔드 오버 엔드 혼합하면서 실온에서 3 시간 동안 인큐베이션. </li><li> 한편, 폴리스티렌 비즈를 준비 : <ol><li> 샘플 당 구슬의 400 밀리그램을 사용하여 유리 비커에 그들을 밖으로 무게. </li><li> 물과 메탄올로 두 번 세 번 씻어 한 번 버퍼 A. 각 세척 단계의 사용을 위해 액 5 mL를 10 분 동안 천천히 저어. 참고 :이 폴리스티렌을 준비하는 것이 좋습니다예를 들어, 한 번에 여러 샘플을위한 비즈, 구슬 6g의 무게와 액체의 75 ㎖로 세척한다. 과량의 비드 며칠 동안 냉장고에 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 당 샘플 0.4 몰 %를 수득 NBD-PC 9.5 μL (1 밀리그램 / 클로로포름 용액 : 소포 불안정화의 마지막 30 분 동안 스크류 캡 유리관에서 NBD 표지 인지질 ( &#39;재구성 유리관&#39;)를 건조 총 인지질) 유리관에서 질소 기류하에 건조하고이어서 0.1 %의 45 μL (완충액 A의 w / v)의 용해에 DDM </li><li> 소포 불안정화 3 시간 1 ml의 최종 용적이 0.36 %를 함유하는 예를 용해-NBD 표지 된 인지질은 DDM - 가용화 된 단백질을 추가 버퍼 후 (W / V), 즉, 7 mm의 DDM. <ol><li> 이와 같이, (0.1 % DDM에 용해) NBD-PC 45 μL, 0.1 % DDM 60 μL 및 완충액 A 55 μL를 추가 (a 대조 시료로서 사용) 무 단백질 리포좀을 생성하는 단계; 테오에 대한 시험을 추가,PLE, 0.1 % DDM에서 (~ 110 NG / μL의 전형적인 스톡 용액으로부터) 단백질을 40 μL가 NBD-PC의 45 ㎕를 0.1 %의 DDM 20 μL 및 완충액 A 중 55 μl를 (0.1 % DDM에 용해) . 참고 : 또한의 순서로 나열되어야합니다. </li></ol></li><li> 실온에서 끝을 통해 추가 시간 종료에 대한 샘플을 섞는다. </li><li> 제조 된 폴리스티렌 비드 80 mg의 추가 엔드 오버 엔드 RT에서 1 시간 동안 혼합하여 시료를 배양한다. </li><li> 다음 폴리스티렌 비드의 추가 160 mg의 추가 엔드 오버 엔드 RT에서 추가로 2 시간 동안 혼합하면서 배양한다. </li><li> 신선한 폴리스티렌 비드 160 ㎎을 함유하는 유리 스크류 캡 튜브에 시료 (뒤에서 폐 폴리스티렌 비드를 떠나)을 전송하고 4 ℃에서 밤새 혼​​합한다. 주의 : 샘플을 옮기고 비드를 흡입을 방지하는 가장 쉬운 방법은 약간의 포지티브 압력 유리관의 바닥에 밀어 파스퇴르 피펫을 사용하는 것이다. 피펫의 팁은 단단히되면상기 튜브의 하단은, 다음 샘플 비드의 간섭없이 쉽게 배출 될 수있다. </li><li> 다음날 아침은 scramblase 활동 분석을위한 준비에 얼음에 구슬과 장소를 통해 전달하지 않고 미세 원심 분리 튜브에 샘플을 전송합니다. </li></ol></li></ol> 2. Scramblase 활동 분석 주 : 완충액 A로 희석 리포좀 또는 테오의 형광 강도는 형광 분광계 온산의 첨가시 시간에 따른 모니터링된다. 안정한 출발 강도를 얻기 위해서는, 형광은 끊임없이 교반 샘플 온산 추가하기 전에 적어도 50 초 (또는 안정된 신호가 얻어 질 때까지)에 대해 기록하고 온산를 추가 한 후 적어도 500 초 동안 이어진다. <ol><li> 미니 볶음 막대를 포함하는 플라스틱 큐벳에 버퍼 A의 1,950 μl를 추가합니다. </li><li> (리포좀) 제조 proteo의 50 μl를 추가하고 샘플이 형광 분광에 평형하자몇 초 동안 일정하게 교반 미터. </li><li> 한편 0.5 M 버퍼링 트리스 (두 샘플은 미세 원심 분리 관에 온산 20 mg의 달아 114에 용해 예에 대해 1 M 디티 오 나이트 용액을 제조 μL 빙냉 직접 사용하기 전에, 다음 얼음에 보관 0.5 M 트리스 견본). 참고 : 온산 솔루션을 새로 준비해야하고 준비 후 20 분을 사용할 수 없습니다; 다수의 측정이 이루어져야하는 경우 온산의 분취 량을 미리 칭량 바로 사용하기 전에 용해시킬 수있다. </li><li> 형광 모니터링을 시작합니다 (여기 470 nm의, 방출 53​​0 nm의, 폭 0.5 nm의 슬릿). </li><li> 기록 형광 (가능한 경우 큐벳 챔버의 뚜껑에 격막을 사용)를 시작한 후 큐벳 50 초에 1 M 디티 오 나이트 솔루션의 40 μl를 추가하고 추가로 400 ~ 600 초 동안 형광을 기록하는 것을 계속한다. </li><li> 제 3 항에 기재된 데이터를 분석한다. </li></ol> 삼.데이터 분석 <ol><li> 스크램블링의 속도론 <ol><li> 초기 형광을 정의하여 scramblase 활성 분석에 의해 얻어진 각 샘플의 형광을 추적 특성화 F I, 디티 추가 및 종점 형광 F가 도달하기 전에&gt; 400 초 후. F에서 I 전에 온산 첨가로 30 초 동안 형광의 평균값을 각 샘플에 대해 결정된다. </li><li> 형광 감소의 정도, R = 100에 해당하는 엔드 포인트 데이터를 결정 • F / F 난. 우리는 옵신 함유 테오에 대한 무 단백질 리포좀과 R의 P의 용어 R의 L를 사용합니다. </li></ol></li><li> 기능적 재구성 Scramblase의 분자량 결정 <ol><li> 하기 식에 따라 형광 감소 데이터를 변환 : P (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R 최대 - R의 L) (식 1) 노트: R 최대 충분한 단백질 시료 내의 모든 소포는 적어도 하나의 기능 scramblase을 보유하도록 재구성 될 때 얻어지는 최대 감소이고, p는 재구성 된 샘플의 특정 소포가 &#39;scramblase 활성&#39;될 확률이고, 즉, 적어도 하나의 기능을 가지고 scramblase. R 최대 대신 예상 100 % (실험&gt; 1 밀리그램 / 밀리몰의 PPR와 옵신 테오 대해 결정될 수 R 최대)의 일반적으로 82.5 % 3 반면 R의 L 값은 통상 45 % (3)이다. R 최대 같이 &lt;100 %는 소체의 서브 모집단 재구성 난치성 인 것으로한다. R의 최대 = 82.5 %를, 단백질을 수용 할 수없는 소포의 비율은 0.35이다. </li><li> 다음과 같이 포아송 통계에 의해 P (≥1 scramblase) 및 PPR (mg의 단백질 / 밀리몰의 인지질) 사이의 관계를 설명 : 전자 - P (≥1 scramblase는 1) = <s&gt; -m = 1까지 - 특급 (-PPR / α) (식 2) 참고 : 어디 mg의 단백질 / 밀리몰의 인지질 단위로 소포 및 α = 모노 지수 맞는 일정에 따라 scramblases의 m = 수입니다. </li><li> 소포의 분획 (논의 참조)에도 높은 PPR에 스크램블링에 기여하지 않기 때문에, 방정식을 수정 P (≥1 scramblase) = 1 - 특급 (-PPR * / α) (식 3) 주 : 여기서, f는,이 경우, PPR * = PPR / 0.65 (식 4)에서 소포 내화성 인구 또는 PPR * = PPR / (1-F). 참고 : 맞는 상수 α는 모노 지수 함수와 PPR * 대 P (≥1 scramblase)의 그래프를 피팅에 의해 결정된다. 옵신 (분자량 41.7 kDa의)는 기능적으로 175 나노 미터 직경의 소포로 재구성하면 단량체, α = 0.187 mg의 밀리몰 -1 (각 소포는 28 인지질 (26)이있다). 이 옵신 dimerizes 경우 종래 α는, scramblase 활성 소체를 수득 3을 재구성 할= 0.37 mg을 밀리몰 -1. PPR보다는 PPR *는 분석을 위해 사용되는 것 인 경우, 대응하는 α 값은 0.122 및 0.244 mg을 밀리몰 -1이 될 것이다. α에 대한 이러한 예측 값은 모든 옵신 분자가 기능적 능력이 있다고 가정합니다. 분자의 일부만 지질 스크램블 능력이면 α의 대응 값보다 큰 것이다. </li></ol></li></ol>

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scramblase 활동 분석은 옵신는 인지질의 scramblase 활동이이 결정하기 위해 원래 우리를 활성화. 분석은 또한 우리 특이성을 테스트하여 옵신의 scramblase 활성을 특성화하도록 허용 (우리는도 1a에 NBD-PC에 대해 표시 나에로 아실 체인 NBD 표지 NBD - 포스파티딜 에탄올 아민 등의 NBD 표지 된 리포터 지질의 다양한 사용 헤드 그룹, NBD-핑고 마이 엘린 또는 NBD-의 포스파티딜 2) 지질 소포 조성물 (효과 등, 소체의 구성 성분으로서 상이한 양의 콜레스테롤) 및 옵신 모든 전시 scramblase 활성 로돕신의 상이한 구조적 상태 여부. 이러한 분석은 인지질 비 구체적이고 로돕신의 구조적 상태와 무관하거나 2,3의 발색단이 망막 포함 여부 (&gt; 초당 10,000 인지질), 로돕신의 scramblase 활동이 매우 빠른 것으로 나타났습니다. 이리,우리는 옵신를 포함 테오를 생성하...

감광체 로돕신 (문헌 1 예 검토)는 원형 G 단백질 - 결합 수용체가 발견되는 인지질 제 scramblase이고 생화학 2,3- 검증. Scramblases는 transbilayer 인지질 운동의 본질적으로 느린 속도를 증가 인지질 수송있는 양방향의 생리 학적으로 적절한 수준으로, ATP 독립적 인 방식 4-6. 그 동작의 예는 소포체와 항시 스크램블링은 물론 당화 경로 (5)의 다양한 멤브레인 항상성 및 성장에 필요한 박테리아 세포질 막에서 발견 될 수있다. 이 역할 여기서 규제 인지질 사멸 세포의 표면에 포스파티딜 세린 (PS)을 노출시키기 위해 필요한 스크램블링 식세포 7 - 신호 &quot;나 먹을&quot;단백질 인자의 생산을 촉진하는 활성화 된 혈소판에 응고 된 표면을 제공한다혈액 응고에 필요한 s의. 감광체 디스크 세포막, 로돕신의 스크램블링 활성을 ATP 의존적 단방향 지질에 의해 생성 된 이중층 두 막 전단지 간 인지질 불균형을 상쇄 제안 ABCA4 4,8,9 10-12 flippase되었다. 로돕신은 세포막에서의 PS 노출에 필요한 2+ 의존적 scramblases가 (기준 검토 (2), TMEM16 단백질 가족의 구성원이 CA로 확인되었다 광 수용체 디스크에 scramblase로보고 될 때까지 scramblases의 생리적 중요성에도 불구하고, 자신의 정체성이 애매 남아 13) 및 지질 II는 펩티도 글리 칸 합성 (14)에 필요한 scramblase으로 박테리아 단백질 FtsW 제안 하였다. 이 발견은 방법론 describ를 사용하여 결과 테오의 리포좀의 정제 된 단백질의 재구성 및 scramblase 활동의 데모를 기반으로 한여기 에드. 다른 잠재적 scramblases 15-21 - 펩티도 글리 생합성에 연루 MurJ와 AMJ 단백질, WzxE 및 관련 단백질이 O 항원 전구체를 스크램블링에 연루, MprF 단백질은 세균 세포질 막에 걸쳐 아미 노아 실화 포스파티딜를 이동시키다하는 데 필요한, 그리고 Xkr8 가족 구성원이 제안되었다 그 사멸 세포의 표면에 노출되도록 PS는 - 생화학 시험 될 남아있다. 이 식별 scramblase 활동을 특징 강력한 분석의 중요성을 강조한다. 여기서는 형광 계 분석을 이용하여 얻어진 테오에 큰 단일 층 소포 (LUVs)로 정제 옵신의 재구성, 감광체 로돕신의 아포 단백질, 및 scramblase 활동 이후의 분석을 설명한다. 이종 표현과 옵신 정화용 문학에서 사용할 수있는 몇 가지 잘 설명 프로토콜은 따라서 우리는하지 않습니다있다이 프로토콜에 대해 설명; 우리는 약 100 NG에 FLAG 태그가, 내열성 옵신 수득 고렌 외. (3)에 설명 된 프로토콜을 사용 / 0.1 %에 μL (w / v)의 dodecylmaltoside (DDM). 재구성은 팽창하지만, 용해되지 않도록 충분한 세제 LUVs 처리함으로써 달성된다. 이러한 조건 하에서, 막 단백질 - 단백질 세제 미셀의 형태로 공급이 - 리포좀에 통합되며 테오 결과 세제 분리 한 리포솜 멤브레인으로 재구성된다. (0.1 % (w / v)의 DDM으로 정제 된 단백질로서 수득) 옵신을 재구성하기 LUVs은 POPC (1- 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린) 및 POPG의 혼합물 (1- 제조 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- [포스 라 세미 (1 글리세롤)]) 및 옵신 및 NBD-PC를 첨가하기 전에 포화 DDM. 세제는 폴리스티렌 비드와 함께 샘플을 처리하여 제거한다. 아가씨 = &quot;jove_content는&quot;&gt; 형광 계 분석의 기초가되는 원리는도 1b에 도시된다. LUVs 대칭 NBD-PC 또는 다른 NBD 형광 표지 된 인지질 기자 (도 1a)의 미량으로 재구성된다. 온산 추가에, NBD의 니트로 기와 같은 막 impermeant가 음이온은 LUVs의 외측 소엽에서 NBD-PC 분자 렌더링 비 형광 비 형광 아미노기로 환원된다. 도 NBD-PC 분자 나 온산 실험 (&lt;10 분)의 시간 - 스케일 막을 통과 할 수있는 바와 같이, 이는 형광 신호의 50 % 감소를 초래한다. 리포좀은 scramblase로 재구성되는 경우, 내부 전단에 NBD-PC 분자들이 감소 외부로 신속 스크램블링 할 수있다. 이것은 이상적인 경우 (도 1C)에서 형광의 총 손실을 초래한다. 에스 / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . 그림 1 : scramblase 활동 분석의 도식 표현은 분석은 형광 NBD 표지 기자 지질을 사용; NBD-PC가 표시된다 (A). 대형 단일 층 소포는 NBD-PC의 미량으로 재구성된다. 재구성은 외부 및 내부 전단지에 균등하게 분산 NBD-PC와 함께, 대칭 소포를 생성합니다. 온산 (S 2 O 4 2-) 화학적으로 비 형광 아미노 그룹에 NBD의 니트로 그룹을 줄일 수 있습니다. 온산 (B, 위쪽) 무 단백질 리포좀의 치료는 감소 외측 전단만을 NBD-PC 분자 보낸 형광의 50 % 감소를 일으키는 : 디티 마이너스로 하전되고, NBD-PC 분자와 반응 할 수있는 멤브레인을 통과 할 수없는 내부 전단지입니다. 옵신 함유 테오 (B, 아래)의 온산 치료 즉, scramblase 활동 테오, F의 100 % 손실 결과같은 옵신 luorescence는 내부와 외부 사이에 전단 NBD-PC의 이동을 용이하게한다. (C)는 온산과 무 단백질 리포좀 옵신 - 함유 테오 처리하여 얻어진 형광 이상화 트레이스를 나타낸다. 형광 손실률은 온산 의해 NBD의 화학적 환원 스크램블링은 화학 반응의 속도 이상인 속도로 발생하고, 그 속도 - 제한임을 나타내는 두 경우 모두 동일하다. 실제 실험에서 얻은 흔적을 그림 3에 나타내었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 우리가 설명 된 방법은 다른 단백질 정제뿐만 아니라 세제 마이크로 솜 (22)을 추출하여, 예를 들어, 얻어진 막 단백질의 혼합물을 재구성하고 분석하는데 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린</td><td>Avanti 극성 지질</td>: <td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>, 1-팔미토일-2-올레오일-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (나트륨 염)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td>, POPG</td></tr><tr><td>, 1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810130C</td><td>NBD-PC</td></tr><tr><td>4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산</td><td>VWR Scientific</td><td>EM-5330</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecyl-&beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 5 GM</td><td>DDM</td></tr><tr><td>형광계 큐벳</td><td>sigma</td><td>C0918-100EA</td><td>큐벳</td></tr><tr><td>분광 형광계</td><td>Photon Technology International, Inc.</td><td>플루오리미터</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 하이드로설파이트 기술 등급, 85%</td><td>Sigma</td><td>157953-5G</td><td>디티오나이트</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>Prism</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>VWR</td><td>JTX171-3</td><td>Tris</td></tr><tr><td>LIPEX 10 ml 압출기&nbsp;</td><td>노던 리피드, Inc.</td><td></td><td>압출기</td></tr><tr><td>Whatman, 드레인 디스크, PE, 25mm</td><td>시그마</td><td>28156-243</td><td>디스크 지원</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore 트랙 에칭 멤브레인, 0.4 &마이크로; m, 직경 25mm</td><td>Sigma</td><td>WHA110607</td><td>400nm 멤브레인</td></tr><tr><td>Whatman Nucleopore 트랙 에칭 멤브레인, 0.2 &마이크로; m, 직경 25mm</td><td>시그마</td><td>WHA110606</td><td>200nm 멤브레인</td></tr><tr><td>인산나트륨</td><td>Sigma</td><td>S3264-500G</td><td></td></tr><tr><td>VWR 배양 튜브, 일회용, 붕규산 유리, 13 x 100mm</td><td>VWR Scientific</td><td>47729-572</td><td>유리관</td></tr><tr><td>과염소산</td><td>시그마</td><td>30755-500ML</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 몰리브덴산염 테트라하이드레이트</td><td>시그마</td><td>A-7302</td><td>암모늄 몰리브덴셜</td></tr><tr><td>(+)-나트륨 L-아스코르브산</td>염 <td>시그마</td><td>A7631-25G</td><td>나트륨 아스코르브산염</td></tr><tr><td>바이오 비즈 SM2 흡착제</td><td>바이오 라드</td><td>1523920</td><td>폴리스티렌 비즈</td></tr><tr><td>&nbsp; 2.0 ml 마이크로튜브 클리어</td><td>VWR Scientific</td><td>10011-742</td><td>재구성</td></tr><tr><td>튜브</td><td>VWR Scientific</td><td>53283-800</td><td>재구성 유리관</td></tr><tr><td>Zetasizer&nbsp;</td><td>맬번&nbsp;</td><td></td><td>증권 시세</td></tr></tbody></table> 표시기

인지질 scramblase 활동의 형광 기반의 분석

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases는 양방향 ATP 독립적 인 방식으로 막 이중층에 걸쳐 인지질을 이동시키다. 첫 번째 scramblase 식별 및 생화학, 감광체 로돕신의 아포 단백질을 옵신했다 확인합니다. 로돕신은 빛의 인식을 담당하는 망막의로드 시각 디스크 막에 지역화 G 단백질 결합 수용체이다. 로돕신의 scramblase 활동이 리간드 11- 시스 레티 날, 즉에 의존하지 않는다는 아포 단백질의 옵신도 scramblase으로 활성화됩니다. 스크램블링 구조적 및 규제 인지질 세포 생리에있어 중요한 역할을하지만, 몇 인지질 scramblases 지금까지 옵신 또한 확인되었다. 여기에서 우리는 옵신의 scramblase 활동의 형광 기반의 분석을 설명합니다. 옵신은 포스파티딜콜린, 포스파티딜 형광 NBD 표지 PC (1-P의 추적 량으로 구성된 대규모 단일 층 리포좀에 재구성almitoyl -2- {6- [7- 니트로 2-1,3-benzoxadiazole -4- 일) - 아미노] - 헥사 노일} - SN -glycero -3- 포스 포 콜린). Scramblase 활성 소포의 내부 전단에 위치 NBD-PC 분자들이 형광 화학적 막을 교차 할 수있는 환원제에 의해 제거되어 외주 전단에 액세스 할 수있는 정도를 측정함으로써 결정된다. 우리는 설명 방법은 일반적인 적용을 다른 막 단백질의 scramblase 활동을 확인하고 특성화하기 위해 사용될 수있다.

우리는 형광 기반의 분석을 사용하여 scramblase 활동의 특성을 LUVs에 옵신의 재구성에 대해 설명합니다. 우리는 스크램블링 옵신 - 중재 포스 포리 피드 속도에 하한치를 배치하고 옵신 기능적 소포로 재구성되는 올리고머 상태를 결정하는 결과를 분석한다. 최적의 재구성 조건을 식별하기 위해, 경험적으로 그들이 단백질의 삽입을 받아이되도록 LUVs을 팽윤 사용해야 세제의 양을 결정하는 것이 필요하다. 이러한 실험은도 2a에 도시되어있다. POPC의 분취 : POPG의 LUVs은 3 시간 동안 DDM 상이한 양으로 처리되는 시료의 흡광도는 540 nm의 때문에 소포 크기의 탁도 측정 및 측정된다. 540 nm의 (OD 540) 그래프에서 측정 된 광학 밀도는 소포가 DDM의 CONCENTR로 팽창 보여줍니다A...

우리는 옵신으로 재구성된 큰 단층 리포좀에서 인지질 스크램블을 측정하기 위한 형광 기반 분석을 설명합니다.

인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

이 실험 과정의 전반적인 목표는 전형적인 G 단백질 결합 수용체를 거대 단층 소포로 재구성하고, 형광 기반 분석법을 사용하여 지질 이중층을 가로지르는 인지질의 독립적인 전위 수행 능력을 측정하는 것입니다. 이 방법은 인지질을 스크램블할 수 있는 단백질의 분자적 정체는 무엇이며 그 메커니즘은 무엇인지와 같은 세포 간 지질 수송 분야의 핵심 질문에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 신뢰할 수 있고 견고하다는 점입니다.특정 지질 조성과 선호하는 계면활성제에 대한 재구성 절차가 수립되면, 이 절차를 시작하기 위해 유리 주사기를 사용하여 POPC와 클로로포름의 25 mg/mL 용액 1435 µL를 둥근 바닥 플라스크에 첨가합니다. 여기에 POPG와 클로로포름의 25 mg/mL 용액 160 µL를 첨가하여 POPC와 POPG가 9:1 몰비로 혼합된 52.5 µmol의 지질을 얻습니다.다음으로, 145 RPM으로 설정한 회전 증발기를 사용하여 지질을 30분 동안 건조합니다. 건조가 완료되면 플라스크를 진공 데시케이터로 옮겨 실온에서 3시간 동안 보관합니다. 그 후, 건조된 지질 막을 수화시키기 위해 버퍼 A 10 milliliters를 첨가합니다.균일하고 탁한 현탁액이 형성될 때까지 플라스크를 부드럽게 돌려 섞어줍니다. 실온의 워터배스에서 40 kilohertz 주파수로 현탁액을 10분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음, 익스트루더를 사용하여 샘플을 400 nanometer 공극 크기의 멤브레인에 10회 통과시킵니다.이어서 두 번째 압출 사이클을 수행하여, 공극 크기가 200 nanometer인 멤브레인에 샘플을 4회 통과시킵니다. 지름이 약 175 nanometer인 인지질 대형 단일층 소포(large unilamellar vesicles)를 포함하며, 육안으로 보기에 더 투명해진 현탁액을 따로 보관합니다. 압출이 완료되면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 13 by 100 millimeter 유리 튜브에 표준 물질을 준비합니다.그 다음, 각 LUV 및 프로테오리포좀 샘플 10 µL를 각각의 유리 튜브에 넣고 탈이온 증류수 40 µL로 희석합니다. 각 튜브에 과염소산 300 µL를 넣고, 히팅 블록에서 145 °C로 1시간 동안 가열합니다. 증발을 막기 위해 각 튜브 위에 구슬을 올려둡니다.그 후 튜브를 실온까지 식히고 각각에 탈이온 증류수 1 mL를 첨가합니다. 12 g/L의 몰리브덴산 암모늄과 50 g/L의 아스코르브산 나트륨을 포함하여 갓 조제한 용액 400 µL를 각각 첨가하고, 볼텍스로 혼합합니다. 증발을 방지하기 위해 마블(marbles)을 넣고 100 °C에서 10분 동안 튜브를 가열합니다.그 다음 튜브를 가열 블록에서 꺼내어 상온까지 식힙니다. 797 nanometers로 설정된 분광광도계를 사용하여 표준 물질로 검량선을 작성합니다. 그런 다음, 공시료(blank)를 기준으로 시료의 흡광도를 측정하여 인산염 함량을 결정합니다.먼저, 압출된 각 LUV 현탁액 800 µL를 각각의 2 mL 마이크로퓨즈 튜브에 피펫팅하여 넣습니다. 각 튜브에 버퍼 A 5.3 µL와 버퍼 A에 용해된 10% mass-per-volume DDM 34.7 µL를 추가합니다. 다음으로, 샘플을 실온에서 3시간 동안 end-over-end 혼합 방식으로 배양합니다.샘플을 배양하는 동안, 유리 비커에 샘플당 400 milligrams의 비드를 계량하여 넣습니다. 샘플당 5 milliliters의 메탄올로 비드를 세척하며 10분 동안 천천히 교반합니다. 메탄올로 한 번, 물로 세 번, 그리고 버퍼 A로 한 번 더 이 세척 과정을 반복합니다. 샘플 배양의 마지막 30분 동안, 스크류 캡 유리 튜브에 담긴 샘플당 9.5 microliters의 NBD 표지 인지질을 질소 기류 하에서 건조시킵니다.그다음, 건조된 인지질을 용해시키기 위해 샘플당 45 µL의 0.1% w/v DDM buffer A를 첨가합니다. 배양이 완료되면, 용해된 MBD 표지 인지질 용액을 각 샘플에 첨가합니다. 이어서 0.1% DDM, buffer A, 그리고 원하는 양의 DDM 가용화 opsin을 순서대로 첨가하여, 최종 부피 1 mL 및 7 mM DDM 농도를 맞춥니다.막 단백질의 재구성(reconstitution)은 소포(vesicles)가 용해되지 않을 정도의 충분한 계면활성제로 처리함으로써 수행됩니다. 모든 지질 조성과 계면활성제에 대해 경험적으로 찾아내야 하는 이러한 조건 하에서 단백질이 리포좀으로 통합됩니다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 혼합하십시오.그런 다음, 준비된 폴리스티렌 비드 80 milligrams를 각 튜브에 넣고, 상온에서 end-over-end mixing 방식으로 1시간 동안 다시 배양합니다. 각 시료에 폴리스티렌 비드 160 milligrams를 추가로 넣고, 상온에서 end-over-end mixing 방식으로 2시간 동안 배양합니다. 배양이 완료되면, 비드는 남겨둔 채 시료를 신선한 비드 160 milligrams가 들어 있는 깨끗한 유리 튜브로 옮깁니다.빛을 차단한 상태에서 4°C로 하룻밤 동안 end-over-end 믹싱합니다. 그 다음, 비즈를 제외한 샘플을 각각의 microfuse 튜브로 옮깁니다. 스크램블라제(scramblase) 활성 분석 준비를 위해 튜브를 얼음 위에 놓습니다.플라스틱 교반 막대가 들어 있는 플라스틱 큐벳에 buffer A 1950 µL를 넣는 것으로 시작합니다. 그다음, 준비된 protealiposome 샘플 50 µL를 추가합니다. 형광 분광 광도계 내에서 지속적으로 교반하며 샘플을 5초 동안 평형화합니다.시료가 평형 상태에 도달하는 동안, 0.5 M 비완충 tris에 1 M dithionite 용액을 준비하십시오. 들뜸 파장 470 nm, 방출 파장 530 nm, 슬릿 폭 0.5 nm로 형광 모니터링을 시작하십시오. 안정적인 신호를 얻기 위해 50초 동안 기록하십시오.그 다음, 1 M dithionite 용액 40 µL를 큐벳에 넣습니다. 최소 500초 동안 형광을 기록합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 분석합니다.형광 데이터의 완전한 분석을 위해, 재구성될 수 없는 소포의 분율을 결정하고, 재구성된 소포 내 단백질과 지질의 회수율 및 소포의 크기 분포를 확인합니다. 본 연구에서는 형광 기반 분석법을 사용하여 옵신의 스크램블라제 활성을 특성화하기 위해 옵신을 거대 단일막 소포로 재구성합니다.소포는 외부 및 내부 리플렛에 균일하게 분포하는 NBD-PC로 재구성됩니다. 디티오나이트는 소포 외부에 있는 NBD의 니트로기를 비형광성 아미노기로 환원시키며, 그 결과 단백질이 없는 리포좀에서는 형광이 50% 감소합니다. 그러나 옵신이 내부 및 외부 리플렛 사이의 NBD 이동을 촉진하면, 형광이 완전히 소실됩니다.서로 다른 단백질 대 인지질 비율에서 이 접근법의 대표적인 결과는 여기에서 확인할 수 있습니다. 형광 감소 정도는 소포로 재구성된 opsin의 양이 0에서 4.95 micrograms까지 증가함에 따라 함께 증가합니다. 표시된 시간에 dithionite를 첨가하였으며, NBD 형광을 400 seconds 동안 모니터링하였습니다.단백질 대 인지질 비율이 높을수록 형광 감소가 더 뚜렷하게 나타나며, 최대 감소폭은 85%입니다. 이후 최종점 형광 감소 수치를 사용하여 Polson 통계법을 통해 스크램블라제(scramblase) 활성의 확률, 즉 소포에 적어도 하나의 스크램블라제가 존재할 가능성을 결정합니다. 빨간색 곡선은 옵신(opsin)에 대한 단일 지수 피팅(mono-exponential fit)을 나타냅니다. 회색 점선은 옵신이 단량체, 미리 형성된 이량체 또는 미리 형성된 사량체 형태로 소포 내에 재구성되었을 때의 단일 지수 피팅을 나타냅니다.본 연구에서 설명하는 방법은 다양한 필요에 따라 쉽게 조정될 수 있습니다. 이 절차들은 범용성이 뛰어나며, 향후 다른 막 단백질의 인지질 스크램블라제 활성을 식별하고 특성화하는 데 사용될 수 있습니다. 재구성 절차는 모든 막 단백질에 적용 가능합니다.이 기술을 통해 우리는 옵신(opsin)이 생화학적으로 검증된 최초의 인지질 스크램블라제(phospholipid scramblase)임을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 단백질의 서로 다른 구조적 상태에 따른 활성과 다양한 지질을 운송하는 능력을 특성화할 수 있었습니다.

a-fluorescence-based-assay-of-phospholipid-scramblase-activity

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 그램이시딘 채널 활동의 조치로 형광 담금질의 속도를 모니터링 빠른 형광 기반의 분석을 소개합니다. 그램이시딘 채널 지질 이중층 속성의 변화로 이중층 스패닝 단백질에 의해 감지를 모니터링하는 분자 힘 변환기로 사용됩니다.

그램이시딘 기반의 형광 분석, 지질 이중층의 속성을 수정하는 작은 분자 잠재 결정

우리가 맥스와 Annexin V - 복합 자석 구슬과 대상 지질 및 Annexin V - 구속력 phosphatidylserine의 합성 지질 vesicles를 사용하여 자사의 목표 지질과 단백질의 상호 작용을 테스트하려면. 대상 지질에 바인딩 단백질은 공동 정화 및 비즈에서 용출 후 분석하고 있습니다.

자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

이 동영상은 형광 염료와 담금질제로 캡슐화된 대형 단층 소포(LUV)인 세포막 모방체를 사용하여 세포 투과 펩타이드와 세포막의 상호 작용을 연구하기 위한 형광 누출 분석에 대해 설명합니다.

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액적 병합 후 형광 복구 인지질 단분자막 이차원 확산을 측정하도록

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소설 형광 프로브와 플라즈마 막에서 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트의 단일 분자 슈퍼 해상도 이미징

여기서 우리는 pH 조절에 기반한 라벨없는 방법을 사용하여 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용을 연구하기위한 마이크로 유체 플랫폼의 맥락에서지지 된 지질 이중층을 제시합니다.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

이 프로토콜은 리포솜의 제조를 설명하고 이들이 어떻게 표면에 고정되고 형광 현미경 검사법을 사용하여 거대한 병렬 방식으로 개별적으로 심상될 수 있는지 설명합니다. 이는 집단의 단일 리포좀 들 사이의 크기 및 조성 불균질의 정량화를 허용한다.

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

형광 누설 분석법은 펩타이드/멤브레인 상호작용의 조사를 가능하게 하는 간단한 방법으로, 여러 생물학적 과정에 대한 그들의 관여, 특히 세포 관통 펩타이드의 능력을 이해하기 위해 직접 세포 전좌 과정 동안 인지질을 방해한다.

세포 관통 펩타이드에 의한 막 불안정화를 조사하기 위한 형광 누설 분석

여기서, 우리는 단백질 추출물과 트랜스포파디딜리노시톨 4-인산염이 체외에서인산염을 배출하는지 여부를 결정하기 위해 형광 지질 센서와 리포좀을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

우리는 기존 기술보다 우수한 감도와 분해능으로 리포솜 막 투과성을 평가하는 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 새로운 캡슐화된 리간드 치환 반응을 사용하여 이 기술은 모델 막에서 포스포리파제 A2 유도 변화를 검출합니다. 표준 분석과 쉽게 통합되는 이 접근 가능한 접근 방식은 막 생물물리학 및 독소 상호 작용 연구를 위한 해상도를 향상시킵니다.

포스파티딜이노시톨 인산염 그룹이 독 PLA2의 멤브란트로픽 작용에 미치는 영향을 조사하기 위한 리포솜 막 투과성 분석

배우세요 형광 기반 분석법을 사용하여 대형 단층 리포솜에 재구성된 opsin의 인지질 스크램블레이스 활성을 측정하는 방법입니다. 이 기술은 세포 간 지질 수송 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

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