Name: 장기를위한 잠수 필터 종이 샌드위치 예 비켜 시간 경과 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 학습하세요 병아리 배아의 잠수 필터 종이 샌드위치 배양법으로 신경형성과 원장형성 같은 형태발생 사건을 실시간 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 기후 조절실 없이도 3차원 배아 성장을 가능하게 합니다.

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저자는 ZonMW-VICI 부여 918.11.635 (네덜란드)에서 재정 지원을 인정합니다. 저자는 자신의 실질적인 제안과 현미경에 도움이되는 조언을 설치 구성 요소와 칼 자이스 네덜란드의 르노 Voortman의 제조 브리 예 대학교 암스테르담의 도구 상점에게 감사의 말씀을 전합니다. Marjolein Blaauboer 비판적 원고의 몇 초안에 코멘트에 큰 지원이었다.

모든 실험 절차는 동물 법에 네덜란드 실험에 따라 실시 하였다. 주 : 잠긴 필터 종이 샌드위치 방법은 1에서 수정됩니다. 1. 침수 필터 종이 샌드위치 준비 <ol><li> Pannett - 콤프 턴 (PC) -saline 27, 28 <ol><li> 원액 A를 준비 (초순수 (H)의 1 L 2 O, 염화나트륨 121 g, KCl을 15.5 g, 염화칼슘 2 · H 2 O의 10.42 g, 12.7의 MgCl 2 g · 6H 2 O)와 B (1 L의 초순수 H 2 O, 2.365 g 나 2 HPO 4 · 2H 2 O와의 NaH 2 PO 4의 0.188 g · 2H 2 O) 깨끗한 1-L 병입니다. 4 ℃에서 저장합니다. </li><li> (침전을 피하기 위해이 순서대로) 스톡 용액 B 40 스톡 용액 A ㎖를 60 ㎖로 초순수 H 2 O 900 ml를 혼합하여 PC-염수 1 L를 준비한다. PC-식염수 갓 FR 준비엄마 재고 솔루션 A와 B 매주. 주 : 스톡 용액을 몇 달 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. 고압 증기 멸균 및 / 또는 추가 항생제 또는 항진균제는 필요하지 않습니다. </li></ol></li><li> 수정 된 닭고기 달걀의 부화 <ol><li> 가습 인큐베이터에서 그들의 편에 알을 낳기 그들이 원하는 연령에 도달 할 때까지 37.5 ° C에서 그들을 품어. 참고 : 저장 계란 더 이상 이주 이상 (바람직하게는 12 - 15 ° C)를 부화율이 크게 실험에 앞서 감소하지 않습니다로 </li></ol></li><li> 필터 종이 캐리어 (1에서 적응) <ol><li> 가능한 경우, 두꺼운 여과 용지 (28mm X 22mm)에서 모래 시계 모양의 필터 종이 캐리어를 절단하는 레이저 커팅 머신을 사용합니다. 22mm에서 10.4 mm로 중간에 폭을 테이퍼. 여과지 캐리어의 큰 측 (도 1-M의 타원 배향 평행 장축과 중앙 타원형 개구 (5.5 mm X 10.6 mm)을 잘라). <ol><li> 선택적으로, 정확한 치수와 판지 스텐실을 준비하고 연필을 사용하여 두꺼운 여과 종이에 중앙 개구의 개요 및 그 전송합니다. 미세 가위를 사용하여 필터 종이 캐리어를 잘라. </li></ol></li><li> 각 배아는 외식 될 때까지 두 개의 동일한 필터 종이 캐리어를 잘라. 배아가 explanting 동안 손실되는 경우 백업으로 여분의 필터 종이 캐리어를 준비합니다. </li></ol></li><li> 온도 제어 (실험 당일) 오일 욕 <ol><li> 직립 줌 현미경 동력 XY 스테이지의 중앙에 온도 조절 비커를 놓고, 온도 컨트롤러로 비커를 연결한다. </li><li> 가중치로서 작용하고, 온도 제어 비이커의 중간 접시를 배치 할 6cm 페트리 접시에 4 개의 큰 스테인리스 링 (30mm 외경, 높이 4 mm, 1.5 mm의 두께)를 넣는다. 참고 :이 페트리 접시는 오일 LEVE을 조정하는 자리 역할엘. </li><li> 빛 미네랄 오일 130 ml의와 온도 조절 비커를 입력합니다. 이 필요가 6cm 페트리 접시의 상부 에지 아래에 약 3mm를 종료하도록하면, 오일 레벨을 조정한다. </li><li> 온도 제어 비커에서 6cm 페트리 접시를 제거하고 40 ° C까지 온도를 설정합니다. </li></ol></li></ol> 2. 잠수 필터 종이 샌드위치 생산 <ol><li> (실험 당일) 배양액 <ol><li> 50 mL의 원심 분리 튜브에 (단계 1.1.2 1.1.1에서 제조 된) PC-식염수 30 ㎖를 붓는다. 매 2 배아는 외식 될 때까지 PC-식염수 30ml를 가득 한 50 ㎖ 원심 분리 튜브를 준비합니다. </li><li> 조심스럽게 10cm 페트리 접시에 비 배양 된 계란 균열. </li><li> 페트리 접시의 벽을 따라 플라스틱 전송 피펫을 이동하고 얇은 알부민의 흡입에 의해 얇은 알부민을 수확. 각각 두 개의 배아가 외식 할 때까지 50 ML의 원심 분리기 튜브에 30 ml의에게 얇은 알부민를 수집합니다. 만 t을 얻을 수 있는지 확인알부민 힌. 참고 : 일반적으로 3-4 계란 얇은 알부민의 약 30 ml를 수확 할 수 있습니다. </li><li> (단계 2.1.1에서 제조 된) 모든 PC-식염수로 얇은 알부민 20 ㎖를 붓고 50 ml의 원심 분리기 튜브를 가득 채웠다. </li><li> 부드럽게 튜브를 여러 번 반전 얇은 알부민와 PC-식염수를 섞는다. 그것은 몇 분 동안 정착 여기 이후에서 배지라는 혼합물, 명확한 있는지 확인하자. 배양 배지가없는 맑은 경우, 스톡 용액으로부터 신선한 PC-식염수를 제조하고 신선한 얇은 알부민 수확. </li></ol></li><li> 신선한 6cm 플라스틱 페트리 접시에서 멀리 떨어져 가능한 두 개의 작은 스테인레스 스틸 링 (20mm 외부 직경, 높이 4 mm, 1.5 mm 벽 두께, 링 6.5 mm 간격)를 놓고 문화의 22 ㎖로 그것을 채우기 배지 25 ml의 플라스틱 피펫 (도 1-H)를 사용하여 (단계 1.4.4 1.4.1에서 제조 한 바와 같이). 매체의 상단에 축적 된 파편은 원심 분리 관에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 이물질 O를 제거R은 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 배지로부터 거품. </li><li> PC-식염수 75 ㎖의 10cm의 페트리 접시를 기입한다 (단계 2.15에서 사용되는). </li><li> 인큐베이터에서 계란을 제거하고 배아는 노른자의 상단에 올 수 있도록 1 분 동안 옆에 벤치에 휴식을 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 페트리 접시에 계란 (그림 1-A)에 균열. 두꺼운 알부민 파인 티슈 종이 조각의 단부 침지하고, 필요한 경우, 당겨 배반 중앙. </li><li> (두꺼운 알부민의 흡수를 용이하게하기 위해 절단 팁과) 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 얇은 두께 알부민의 대부분을 제거합니다. </li><li> 부드럽게, 조직 종이와 두꺼운 알부민을 멀리 닦아 센터 (그림 1-B)에서 멀리 이동하여 배아 주위에 두꺼운 알부민의 창을 만듭니다. 난황 막에 부착에서 티슈 페이퍼를 방지합니다. </li><li> 핀셋을 사용하여 조심스럽게 VITE에 여과지 캐리어를 배치배아 (그림 1-C)의 전후방 축에 타원형 구멍 평행의 긴 축과 배아 주위 lline 막. </li><li> 필터 종이 캐리어에 근접하고 신속하게 전체 필터 종이 캐리어 (그림 1-D) 주위를 잘라 난황 막 통해 손톱 가위 중 하나 팁을 꼬집어. </li><li> 핀셋을 사용하여 배아 (도 1-E)의 전후방 축에 경사에 평행 한 방향으로 떨어져 난황에서 여과지 캐리어 리프트. </li><li> 상단에있는 태아의 복부 측면이 있고 PC-식염수에 잠수함 주위 필터 종이 캐리어를 켭니다. 경사 방향 배아의 전후방 축을 따라 여과지 캐리어 빠져. </li><li> 모든 노른자를 제거 여전히 난황 막 부드럽게 플라스틱 전송 피펫에서 PC-식염수로 세척하여 배반 엽을 연결합니다. (A)에서 침수 필터 종이 캐리어의 전체 유지LL 시간 (그림 1-F). </li><li> 경사 방향 배아의 전후방 축을 따라 PC-식염수에서 여과지 캐리어를 제거하고, 티슈 페이퍼의 여과지 캐리어의 가장자리를 뿌리며 마치하여 과량의 액체를 제거. </li><li> 핀셋 한 쌍의 제 2를 사용하여 위로 향하게 배아의 복부 측면과 수평 필터 종이를 잡고 제 하나 위에 다른 여과지 캐리어를 놓는다. 이들 개구하여 여과지의 두 층 (도 1-G)의 배아를 개재 정확히 일치한다. </li><li> 즉시 배아의 전후방 축을 따라 경사 방향으로 배양 배지로 여과지 캐리어 샌드위치 잠수함. 두 개의 스틸 링 (그림 1-H) 사이의 공간에 걸친 영역에 배치합니다. </li><li> 확인하고, 다른 두의 상단에 두 개 더 스틸 링을 배치하여 필터 종이 샌드위치를 ​​수정하는 전자와 조리개mbryo 완전히 (그림 1-I를) 발견 상태로 유지됩니다. </li><li> 중간 수준을 확인하고 상부 스페이서 그냥 중간에 빠져들되어 있는지 확인합니다. 필요한 경우, 추가하거나 매체의 소량을 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 온도 조절 유조의 중심 페트리 접시를 배치하고 오일 접시 옆에 3 대 스테인레스 스틸 링 (30mm 외경, 높이 4 mm, 1.5 mm의 두께)를 배치하여 접시 횡 방향 안정 . 스틸 링 접시 (그림 1-J)의 측면을 터치해야합니다. </li><li> 매질이 미네랄 오일의 연속 층 (도 1-K)으로 피복되도록 천천히 플라스틱 이전 피펫 매체 위에 라이트 미네랄 오일을 약 6 ml의 피펫. </li><li> 시간 경과 수집을 설정합니다. 참고 : 다섯 중복 서브 이미지 (타일)의 수평 파노라마로 배아 이미징은 일반적인 overvi으로, 상세한 영상 (5 배 목표를) 할 수 있습니다형태 29 ~ 30의 EW. 3과 10 분 사이 영상 간격 형태의 세부 추적 (31), 작은 Z - 스택의 인수를 변경 (30 ㎛의 거리가 5 ~ 7 가지 평면) 배아 (30)의 농축 및 회전의 많은 부분을 보상 할 수 . 최상의 명암비와 Z-비행기 (이미지 수집에 대한 자세한 내용은 대표 결과 섹션 참조) 시간 경과 영화로 단일 프레임의 추가 처리 (32) 전에 선택할 수 있습니다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg"> 그림 1 : 잠수 필터 종이 샌드위치를 설정. (A)는 달걀 페트리 접시에 금이있다. (B)이 두껍고 얇은 알부민 대부분 플라스틱 이전 피펫 페트리 접시에서 제거되고 (미도시). 이어서, 두꺼운 알부민의 창이 생성되는부드럽게 조직 종이로 두꺼운 알부민을 멀리 닦아 배아 라운드. (C) 여과지 캐리어는 노른자의 상단에 배반 주위에 배치된다. (D) 상기 필터 종이 캐리어 노른자의 상부로부터 제거 된 주변 난황 막 및 (E)에서 이른바 절단된다. (F) 남은 노른자는 여러분에게 PC-식염수 조에서 멀리 세척한다. (G) 배아는 제 동일한 여과지 캐리어 개재된다. (H) 여과지 샌드위치는 매체에 잠긴 (최대 배아 대향 지느러미 또는 복부 쪽) 두 개의 금속 스테인리스 고리에 위치한다. (i) 2 개의 고리 정상에서 샌드위치 안정화. (J)의 온도 제어 오일 욕에 전송 배아를 함유하는 페트리 접시. 스테인레스 스틸 링 횡 페트리 접시를 안정화. (K) 배양액의 미네랄 오일 층으로 덮여있다.잠수 필터 샌드위치 (L) 도식. (M)에 침지 여과지 샌드위치에 사용되는 여과지 캐리어의 치수. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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<li>Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Acquiring multidimensional images. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/5D9162DBD5AF85DDC1257E35005A68A6/$FILE/ZEN_2-Acquiring_multidimensional_images.pdf">http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/5D9162DBD5AF85DDC1257E35005A68A6/$FILE/ZEN_2-Acquiring_multidimensional_images.pdf</a> (2014).</li>
<li>Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Importing and exporting images. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/CF6F8A3FE82E5870C1257E35005AF3E9/$FILE/ZEN_2-Importing_and_exporting_images.pdf">http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/CF6F8A3FE82E5870C1257E35005AF3E9/$FILE/ZEN_2-Importing_and_exporting_images.pdf</a> (2014).</li>
<li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol.+Protoc.+Vol.+I%22%5BJournal%5D)">Culture of Avian Embryos.</a> Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

잘 설립 된 EC 문화 (1)의 새로운 변종으로, 침수 필터 종이 샌드위치는 주위 온도 - 습도 조절 인큐베이터함으로써 초기 병아리 배아 전의 장기적인 시야 및 암시 야 시간 경과 영화의 인수를 비켜 용이 비용 소비 현미경. 오히려 반고체 한천 알부민 바닥 배양보다 배아 완전히 PC-식염수 얇은 알부민 이루어진 간단한 배양액에 잠긴 상태로 유지된다. 증발 및 열 손실이 배지 위에 떠있는 미네랄 오일 층이 최소화된다. 배아는 품질에서 볼 수 차이없이 쉽게 지느러미 또는 복부 쪽이 위를 배양 할 수있다. 여기에 도시 된 바와 같이, 침수 필터 종이 샌드위치 배아는 morphogen 젖은 구슬의 응용 프로그램과 마찬가지로, 미세 수술 개입에 액세스 할 수 있습니다. 미래의 응용 프로그램은 엄마에 침묵 실시간 형광 이미징, microinjections 및 전기, 유전자를 포함nipulate 및 복부 (예를 들어, 초기의 마음과 somitogenesis)와 지느러미 (예를 들어, 후반 낭 배기, 신경관 폐쇄, 초기 뇌) 개발 과정에서 형태 발생 이벤트의 넓은 범위를 공부합니다. 여과지 샌드위치를 ​​포함하는 페트리 접시는 미네랄 오일 층 아래의 배양액의 교환을 허용하는 관류 챔버로 교체 할 경우 시간 의존적 약물 치료가 가능하다. 잠수 필터 종이 샌드위치와 침지 목표 (빛 시트 현미경 포함) 레이저 기반 이미징와 조합의 전체 이미지 잠재력을 개발할 것입니다. 잠수 필터 종이 샌드위치의 제조에 일부 어려움이 다음 단락에서 해결 될 것입니다. 이 여과지를 샌드위치로 난황에서 배아를 전송할 트레이닝의 적당한 양이 필요하지만, 여러 단계가 여전히 상당히 배양에서 배아의 품질에 영향을 미칠 수있다. 여과지 캐리어 전에노른자에 배치, 배아 주위에 난황 막는 두꺼운 알부민에서 해방되어야한다. 그런 다음에야 여과지와 난황 막 사이의 연결은 PC-식염수 세척을 견딜 수있을 정도로 견고합니다. 가능한 한 작은 액체 / 공기 계면을 교차한다 배아를 운반 여과지 멤브레인의 장력을 최소화한다. 세정 용 PC-식염수하게되면 전체 여과지 캐리어 완전히 잠긴 항상 유지한다. 난황 막 필터 종이에서 방출 시작되는 바와 같이, 60 초 - PC의 식염 욕에서 시간은 약 30으로 제한한다. 노른자 나머지는 나중에 배아의보기를 모호하므로 여전히 배아의 청소는 매우 철저하게 실행해야한다. 세척하는 동안, 반경 방향으로 멀리에서 항상 직접 배아에 전송 피펫에서 스트림을 지적, 그러나 결코. PC의-식염수에서 배아를 제거한 후, 최소화하기 위해 수평 필터 종이를 유지해야합니다배아 세포막에 긴장. 그리고, 제 2 필터 종이 캐리어 배아 안정화. 제 2 필터 종이 캐리어가 배치되면, 서로에 대해 여과지 캐리어를 이동시키고 배아 세포막을 파열시킬 수있는 횡 장력을 만들지 않도록. 여과지 샌드위치가 배지하게되면, 또한 막에 장력을 최소화 번만 공기 / 액체 계면을 교차한다. 상단에서 여과지 샌드위치를 ​​안정화하는 데 스테인리스 제 2 쌍의 링들에 아주 천천히 넣고 배아 막의 압축을 최소화하기 위해 임의의 압력없이한다. 배아의 면적 opaca 작은 파열은 보통 배양의 첫번째 시간 동안 치료하지만, 오일 층이 배지 위에 피펫 팅되기 전에 손상 배아 항상 새로운 샘플로 대체되어야 할 수있다. 이미지 전체 배아 또는 고해상도 시간 경과 영화에 대한 여러 샘플, 마이크roscope은 현미경 소프트웨어에 의해 제어되는 전동 XY 스테이지, 장착되어 있어야합니다. 이는 화질을 감소 배지 오일에서 배아 및 난류, 손상을 방지하기위한 최소한의 속도로 XY 스테이지의 움직임을 가지고 매우 중요하다. 여기에 제시된 시간 경과 영화의 인수를 들어, 전동 XY 스테이지는 약 1.75 mm / sec의 속도로 움직였다. 앞으로 영상은 더 먼저 원하는 위치로 무대를 이동하고 진동과 난류가 사라질 수 있도록 짧은 휴식 기간 후에 이미지를 획득함으로써 향상 될 수있다. 침지 목적없이 직립 현미경을 사용하는 경우의 제한으로, 잠재적 인 사용자는이 배양 방법에 필요로하는 비교적 긴 작동 거리 (약 1cm)을 알고 있어야한다. 배아의 상단에 매체의 층에서 미네랄 오일이 작동 거리 결과. 6cm 페트리 접시에, 오일 층은 thicknes있다약 1의 (S) - 1.5 mm, 및 배아는 배양 배지에 깊이 약 4mm 침수된다. 목표의 직경에 따라, 6cm 페트리 접시의 상단은 태아에 대한 액세스를 제한 할 수있다. 이것은 큰 접시를 사용함으로써 회피 될 수있다. 정상으로부터의 작동 거리가 약간 액체 층의 두께를 최소화함으로써 감소 될 수있다. 또한, 아래에서 작동 거리가 더 아래 페트리 접시의 바닥 배아를 가져오고, 가열 비커 유리창의 두께를 감소시킴으로써 최소화 될 수있다. 프로토콜이 직립 긴 작동 거리를 크게 현미경으로 작동하도록 최적화되어 있지만, 그것은도 거꾸로 현미경에 장착 될 수있다. 예비 실험이 제한 확산이 확률값 될 것 같지 않습니다 것을 제안하지만, 미래의 사용자는, 배양 배지에 너무 깊이 배아를 침지하는 O 2 -diffusion 문제를 초래할 수 있음을 유의하십시오LEM는 한 배아를 배양 배지와 끼워 여과지 충분히 대형 저장 둘러싸여로서 배양 접시의 바닥에 가압되지 않는다. 또 다른 한계는 온도 조절된다. 40 ° C로 가열 된 비이커에 대한 제어기의 온도를 조정함으로써, 배지 중의 온도는 매체 광유 덮여 배아 약 37.5 ° C로 평형화. 이는 어떤 에너지 발열체, 온도 센서가있는 비커의 바닥 및 태아의 위치 사이에서 손실되는 것을 나타낸다. 온도 제어 센서 색 및 가열 소자를 재분배함으로써 최적화 될 수있다.

배아는 역사의 시작부터 사람을 매료했다. 방법 배아의 구조 및 형태는 잘 정의 된 시간적 및 공간적으로 발전 하는가? 병아리 배아는 여러 가지 이유로 배아에 대한 고전적인 척추 동물 모델 중 하나가되고있다 : 그것은 어머니 외부 개발로이 실험 조작에 대해 쉽게, 저렴하고, 사용 가능한 초기 단계에서 투명하고 액세스 할 수 있습니다. 또한, 심장 및 뇌 형성, 낭 배기, neurulation 및 somitogenesis 15 초기 형태 형성 이벤트 기간 동안 거의 평면 형상을 가지고있다. 그들은 이러한 경과 된 이미지의 획득을 같이 동적으로 조사되는 경우 형태 형성 공정은 가장 잘 이해 될 수있다. 병아리 배아는 비켜 16 만 실험 조작 및 투과광 현미경 이미징을위한 제한된 가시성 가난한 접근성 시각화 할 수 있습니다. 따라서, 절단19 이식편 문화 1,20로 - - 23 알의 기술이 전 비켜, 중 전체 노른자 문화 시스템 13, 17 문화 병아리 배아에 제안되었다. 전체 난황 배양 시스템에서, 배아는 그대로 노른자의 상부에 유지하고, 난자의 전체 콘텐츠는 배양 위해 다른 용기로 전달된다. 이 컨테이너는 대리 달걀 껍질 (17), 페트리 접시 (19), 또는 플라스틱 집착 랩 13,18 만든 해먹 될 수 있습니다. 전체 노른자 문화 배아는 이상적으로 부화 될 때까지 배양하고 micromanipulations에 액세스 할 수 있습니다. 이러한 기술은 이하 배아 시각화 하드 유지하면서 (콘트라스트를 증가시킨다), 혈액 순환 개시 후 배아의 개발 연구에 유용하다. 그들은 노른자에서 절제 및 체외 외식으로 배양하는 경우 이러한 초기 배아는 최고의 이미징 할 수있다. 외식 실험에 대한 접근이 용이알 조작 및 배양 적은 공간을 필요로합니다. 몇 년 동안 1955 년과 그 변화에 데니스 새로운 개척하는 기술하여 시간 경과 현미경과 미세 수술 개입 (20, 21)의 배아 액세스 할 수 있도록, 병아리 배아에 대한 절편 배양 방법의 황금 표준이었다. 가장 큰 성공에도 불구하고, 새의 기술은 상대적으로 까다 롭고 시간이 소요됩니다. 배반 엽 담 난황 막은, 적당한 장력 하나를 달성하기 위해, 유리 링 주위 연신 때 종종 분리 배반. 또한, 배아의 복부 쪽이 위로 만 배양 할 수 있습니다. EC는 (초기 병아리) 문화 및 채프 COLLIGNON 하나에 의해 개발 된 최신 기술은 중앙 개구와 여과지 캐리어를 사용하여 난황 막 연신을 우회. 여과지함으로써 자연 장력을 유지 난황 막에 부착하고, 화상 프레임 (1)과 같은 배아를 둘러싼 다.배아는 보통 복부 쪽이 위로, 한천 - 알부민 바닥에 배양 있습니다. 지느러미 쪽을 배양하는 것은 HH8 15 세 이상에서 배아 만 가능한 것 같다. 대부분의 그룹은 외과 용 봉합 섬유 (24) 또는 박막 (25) 코팅 된 콜라겐으로 이루어지는 지지체와 한천 알부민 바닥을 대체하여 그들의 요구에 여과지 캐리어를 적응시켰다. 종종, 새의 기술과 또는 EC 문화 배양 배아는 산소 확산 1,20을 용이하게하기 위해 공기에 자신의 지느러미 또는 복부 표면으로 노출되어있다. 이 체외 이식편은 배양 배지의 증발을 방지하고 건조되는 배아를 방지하는 가습 분위기에서 보관해야한다. 이 젖은 휴지 하나를 함유하는 큰 페트리 접시 이식편 배양 접시와 배양함으로써 달성된다. 이 배아의 시간 경과 이미지의 인수는 전체 현미경 또는 성질 주변의 기후 제어 인큐베이터의 사용 중 하나가 필요합니다ature 제어식 광로 (14)의 응축을 방지하기 위해 가열 뚜껑 용기. 완전히 여과지 배양 물 (25) 배양액에 잠긴 뉴의 기술 2,21의 adaptions 무거운 광유 및 알부민의 층 사이에 개재하거나, &quot;콘월어 창백한 문화 절첩 배반 이식편으로 비켜하지만, 병아리 배아는 예를 개발할 수 &quot;23,26, 공기와 직접 접촉하지 않고. 잠수 여과지 샌드위치 여과지 캐리어 기술의 새로운 변종이다. 병아리 태아에게 전 비켜 배양에 앞서 지식을 결합함으로써, 기후 제어 인큐베이터 및 폐기 가능 가열 뚜껑을 수 있습니다. 포함 제어되는 온도 : 배아는 두 개의 동일한 (레이저 컷) 필터 종이 캐리어 (24)와 배양 완전히 (2 비율 3에 Pannett - 콤프 턴 식염수 27, 28 얇은 알부민) 간단한 배지에 잠긴 사이에 끼워어. 배지 위에 떠 라이트 미네랄 오일 층이 증착 2,21 방지 및 환경의 열 손실을 최소화한다. 용기의 바닥 유리 창을 갖고, 전체 셋업은 긴 작동 거리 직립 크게 현미경 수행된다. 햄버거 해밀턴이 설정은 28 체절 단계로 초기의 원시적 인 행진 단계에 이르기까지, 배아 발달의 약 30 시간의 고해상도 시야 및 암시 야 시간 경과 영화의 인수를 할 수 있습니다 (해당하는 16, HH5-16 5 스테이지 ) 15. 태아는 복부 또는 지느러미 쪽이 위로 동일하게 배양 할 수있다. (- 5, 초기 뇌 9-13 예를 들어, 후반 낭 배기 2, 신경관 폐쇄 3) 개발 따라서 배아는 관찰과 복부 (예를 들어, 초기 심장 7,8 및 somitogenesis 6)과 등쪽의 조작에 액세스 할 수 있습니다. 잠수 필터 종이 샌드위치 페이지미세 비드 주입, 미세 주입, 유전자 침묵 및 전기 연구를위한 단순하고 안정적인 환경을 rovides. 이미징 전위는 침지 목표 (밝은 장 현미경 포함) 레이저 기반 이미징을 사용하여 훨씬 더 가압 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>밀리-Q&nbsp; 참조 정수 시스템</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>듀란&nbsp; 실험실 병, 뚜껑 포함, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich/Duran</td><td>Z305200-10EA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solution A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1064041000</td> KCl Merck Millipore 1049361000 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#183; H2O</td><td>Merck Millipore</td><td>1023821000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&#183; 6H2O</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>13152-1KG-D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solution B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&#183; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&#183; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1063420250</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Whatman 품질 여과지, 595 등급</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10311611</td><td></td></tr><tr><td>레이저 절단기 MLS-90120-C130, CO2-laser, 130&nbsp; W, 파장 10.6&nbsp; &마이크로; m</td><td>Micro Lasersystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tork 엑스트라 소프트 페이셜 티슈</td><td>Tork</td><td>140280</td><td></td></tr><tr><td>라텍스 장갑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z645613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EMDAMED</td><td>EMDA 300.131</td><td></td></tr><tr><td>전사 피펫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z350613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>WITG5.480.003</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet pro 피펫 컨트롤러</td><td>BrandTech Scientific</td><td>26332</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 플라스틱 피펫, 25&nbsp; ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 문서 슬리브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>계란 인큐베이터 - 인큐베이터 mod. Cip Cip 40</td><td>Fiem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수정 닭 달걀 (Gallus gallus)</td><td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm 조직 배양 접시</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 페트리 접시</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원심 분리기 튜브, Greiner 원심 분리기 튜브 또는 Cellstar 튜브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td></td><td>greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Stainless steel rings, custom-made</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large rings, 30 mm outer diameter, 높이 4mm, 벽 두께</td><td></td><td></td><td></td>1.5mm</tr><tr><td>작은 링, 외경 20mm, 높이 4mm, 벽 두께 1.5mm, 링</td><td></td><td></td><td></td>틈새 6.5mm</tr><tr><td>네일 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>집게, Dumont # 5, Inox</td><td>Fine Science Tools, F.S.T.</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>여과지를 자르기 위한 세밀하고 정말 날카로운 가위</td><td>VWR</td><td>21-102</td><td></td></tr><tr><td>M3516&nbsp; 시그마-알드리치 미네랄 오일</td><td>시그마-알드리치</td><td>CAS 번호&nbsp; 8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Agares 하의 EC 문화</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9539&nbsp; 시그마</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7653&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Microbead implantation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Sampler Kit III (45 &micro; m 구슬이 사용되었습니다)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16905-1</td><td></td></tr><tr><td>Accupuncture 바늘: type J, No.02, 0.12x30&nbsp; mm</td><td>세이린</td><td>&nbsp; 유형 J, No.02, 0.12x30mm</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>온도 제어 비커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RTD M4 스레드 하우징이 있는 온도 센서 RTD-850M</td><td>Omega</td><td>RTD-850M</td><td></td></tr><tr><td>밀폐형 RTD 센서 HSRTD-3-100-A-3M</td><td>Omega</td><td>HSRTD-3-100-A-1M</td><td></td></tr><tr><td>서미스터 및 RTD 연장 와이어 EXTT-3CU-26S-50</td><td>Omega</td><td>EXTT-3CU-26S-50</td><td></td></tr><tr><td>열전대, 3선식 RTD 및 서미스터용 3핀 미니 커넥터 MTP-UM</td><td>Omega</td><td>MTP-UM</td><td></td></tr><tr><td>Kapton (폴리이미드 필름) 절연 플렉시블 히터 KHLV-103/(10)-P</td><td>오메가</td><td>KHLV-103/(10)-P</td><td></td></tr><tr><td>온도/공정 컨트롤러 CNi16D24-C4EIT-DC</td><td>Omega</td><td>CNi16D24-C4EIT-DC</td><td></td></tr><tr><td>폴리아세탈로 절연된 맞춤형 알루미늄 비커(도면 시트 2 참조)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscope setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>495010-0009-000</td><td></td></tr><tr><td>Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56&nbsp; mm</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435281-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>수동 로터리 컨트롤 MARC</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435604-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>투과 조명 상단 450 mot</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435500-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>전동 측정 단계 S 150x100 mot; CAN (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9020-000</td><td></td></tr><tr><td>인서트 플레이트 S, 유리 237x157x3&nbsp; mm (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9053-000</td><td></td></tr><tr><td>컨트롤러 EMS 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435610-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>시스템 제어판 SYCOP 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435611-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>현미경 하이엔드 워크스테이션 Xeon 쿼드 코어 다국어</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>490004-0025-000</td><td></td></tr><tr><td>언어 패키지 Windows 7 x64 Ultimate 영어 US</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410373-0200-000</td><td></td></tr><tr><td>LCD TFT 모니터 HP ZR2440w 24"</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410350-2403-000</td><td>더 이상 사용할 수 없음</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012 하드웨어 라이선스 키</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1002-120</td><td>더 이상 사용할 수 없음</td></tr><tr><td>ZEN 소프트웨어 드라이버 Hamamatsu 카메라 하드웨어 라이선스 키</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1045-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 모듈 Z 스택</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-0030-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 모듈 타일/ 위치</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1025-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 모듈 타임랩스</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1031-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 모듈 실험 디자이너</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1022-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Desk 2012 하드웨어 라이선스 키</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1004-120</td><td>더 이상 사용할 수 없습니다</td></tr></tbody></table>.

장기를위한 잠수 필터 종이 샌드위치 예 비켜 시간 경과 영상

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

심장은 7 굽힘, 5, somitogenesis 6 - 그것의 가용성, 낮은 비용, 평면 구조, 투명성은 병아리 배아 비켜 전은 낭 배기 (2)와 같은 형태 형성 이벤트, 연구의 주요 척추 동물 모델, neurulation 3되고있다 초기 배 발생 동안 13 - 8, 뇌 형성 9. 형태 형성 과정을 이해의 핵심은 시간 경과 영상에 의해 동적으로 수행하는 것입니다. 병아리 배아의 예를 비켜의 시간 경과 영화의 획득은 배아 (14)의 주위 온도와 습도를 제어하는 인큐베이터에 대해 짧은 시간 창 또는 필요에를 제한하고있다. 여기서 우리는 문화 병아리에 새로운 기술이 투과광 현미경을 사용하여 고해상도 시간 경과 이미징을위한 전 비켜 배아 제시한다. 잠수 필터 종이 샌드위치는 잘 확립 된 필터 종이 캐리어 TECHN의 변형입니다개새끼 (EC 배양) (1)과는 기후 챔버 없이도 병아리 배아의 배양을 허용한다. 배아는 두 개의 동일한 여과지 캐리어 끼워 완전히 빛의 미네랄 오일 층에 의해 덮여 간단한 온도 제어 매질에 침지 유지된다. 적어도 28 체절 단계 (HH16) 15까지 원시적 인 행진 단계 (햄버거 - 해밀턴 단계 5, HH5) 15에서 시작, 배아 중 하나를 자신의 복부 또는 지느러미면을 위로하여 배양 할 수있다. 이 배아 발달의 30 시간을 포함 시간 경과 영화의 인수를 할 수 있습니다. 대표 저속 프레임과 동영상이 표시됩니다. 배아는 표준 EC-문화를 배양 배아에 형태 학적으로 비교된다. 잠수 필터 종이 샌드위치 초기 지느러미와 복부 형태 형성 과정을 연구 할 수있는 안정적인 환경을 제공합니다. 또한 이러한 미세 비드 IMP 같은 실시간 형광 이미징 micromanipulations 허용μM 농도로 배양액, 미세 주입, 유전자 침묵과 전기 및 강한 전위를 갖는다는 (밝은 장 현미경 포함) 레이저 기반 이미징을위한 침지 목적과 결합한다.

<img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig2.jpg"> 그림 2 : EC 문화 1과 수중 필터 종이 샌드위치 문화 태아 사이의 형태 학적 비교. 선택한 시간 경과 프레임은 3 시간 간격으로 배아를 보여줍니다. 프레임은 전체 배아 형태의 개요를 제공하기 위해 크기가 조정됩니다. 배아는 7 체절 단계 (HH9) 15 세 일치 하였다. 0 시간은 각 실험의 시작을 나타낸다. 전방 왼쪽에 항상이다. 이미지는 암시 야 조명을 사용하여 획득 하였다. 1,33 바닥 한천 - 알부민에 EC 문화 1, 배양 복부 측면까지의 (A) 배아. 배아가 Z 방향으로 한정되어 고품질 화상을 획득 할 수있다. (B 및 C) 잠수 필터 종이 샌드위치에서 배양 두 배아 (B)를 복부 측면 및 (C) 등의 측면입니다.필터 종이 샌드위치 배아는 적어도 27 시간 동안 질적 차이없이 개발할 수 있습니다. 그들은 기능 혈액 순환과 두개골과 경추 굴곡을 개발하고 성공적으로 전원을 켭니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 시간 경과 인수를 사용할 수있는 현미경 시스템에 따라 달라집니다. 본 연구는 긴 작동 거리에서 수직 줌 현미경을 사용 하였다. 줌 배율이 5 배 하였다. 접안의 16X 배율 조합이 (현미경 소프트웨어에 명시된) 1.3 μm의 / 화소의 이론적 해상도 30, 80X 종합 배율 결과. 현장의 뷰를 증가시키기 위해, 배아 다섯 서브 이미지 (타일)의 수평 파노라마로 몇 군데 있었다. 따라서, 다섯 중첩 타일로 구성된 타일 영역은 29으로 정의 하였다. 이 타일 영역완전히 수평 확장 (- 0 시간도 2B)에 여과지 캐리어의 타원형 구멍을 덮도록 위치 하였다. 각 타일은 약 2.7 mm의 시야를 덮는, 2048 X 2048 픽셀의 크기를 가지며, 타일 결과 10 %의 중첩으로 취득한 시야 약 12 ​​mm X 2.7 mm의 총 파노라마. 전동 XY 스테이지는 별도의 타일 (29)의 취득 사이에 약 1.75 mm / sec의 속도로 대물 렌즈에 대해 이동. 라이브 이미지는 앞쪽에 presomitic 중배엽과 가장 최근에 형성된 somites (우리 그룹의 연구 포커스)에 집중되었다. z 방향에서 배아 육화 컬링을 보상하기 위해 작은 Z-스택 (30 ㎛의 거리 5-7 상이한 평면)마다 점 (30)에서 획득 하였다. 이들은 presomitic 중배엽의 앞쪽 끝의 초점면 주위에 선정되었다. 시간 경과 ACQ의 기간uisition 50 시간으로 설정하고, 3, 4, 또는 10 분의 촬상주기 (31)를 선택 하였다. 10 시간 새로운 최적의 초점면 주위의 Z-스택을 재정의 - 시간 경과 획득의 품질은 매 5를 재조명함으로써 개선 될 수있다. 실험의 끝에, 전체 시계열을 수동으로 편집하고, 최적의 초점과 Z 평면을 포함하는 이미지들의 서브 세트가 생성되어 별도의 폴더 (32)에 저장 하였다. 이미지의이 부분 집합 시간 스티치 최적의 초점과 이미지의 전체 시계열을 만들 수 있었다. 이 전체 시계열의 각 이미지의 타일 스티치 쉐이딩 보정없이 30 융합 및 저속 프레임은 100 %의 크기가 95 % 압축 (32)의 JPEG 이미지들로 반출 된 하였다. 시간 경과 프레임은 전문 비디오 편집 소프트웨어로 이미지 시퀀스로 가져 하였다. 상세한 100 % 줌을 안정화시키고, 전체적인 콘트라스트 우리대로 조절 하였다. 마지막 시간이 경과는 인코딩했다H.264 코덱과 D 및 MPEG-4 용기에 수출했다. 동영상은 15 프레임 / 초 (FPS)과 1920 X 1080 픽셀 해상도의 프레임 율로 디스플레이된다. 그림 2는 EC 문화 1 (그림 2A)에서 배아와 침수 필터 종이 샌드위치 문화에 두 개의 배아, 하나되는 배양 복부 측면까지 (그림 2B)와 다른 하나 지느러미 사이드 (그림 2C) 사이의 비교를 보여줍니다. 모든 배아는 연령과 일치하는 일곱 체절 단계 (HH9) 15과 4 분 (그림 2A와 B) 또는 10 분 (그림 2C)의 시간 해상도 몇 군데 있었다. 3 시간 간격의 선정 된 프레임이 그려져있다. EC의 문화 (그림 2A)는 인해 1,33 바닥 안정적인 한천 알부민에 휴식 배아에 매우 안정적인 영상을 허용했다. 전체 배아는 t에 걸쳐 하나의 초점면에 남아그는 전체 시간 경과. 이 실험은 짧은 (몇 시간) 초기 배아 유익 할 수도 있지만 아마도 장기적으로 성공적인 입체 개발을 방해 Z 방향에서 배아의 강한 구속 온다. 처음에, 한정 만의 복부 측면을 (0 시간에서도 2a 및도 2b를 비교)와 침수 여과지 샌드위치 배양 된 배아와 비교하여 태아의 머리를 약간 좌우 평탄화 결과. 나중에, 머리의 회전은 (그림 2A - 21 시간)을 손상시키고 심장 박동이 느려. 혈액 순환은 거의 중단했다. EC 문화 배아의 전체 시간 경과에 대한 보충 영화 1을 참조하십시오. 왼쪽 하단의 패널은 전체 해상도에서 심장 개발을 가시화하면서이 영화의 상단 패널은 배아의 전체 개요를 보여줍니다. somites에 presomitic 중배엽의 분할은 그 자체가 될 수오른쪽 아래에 상세하게 갖추고 있습니다. 잠수 여과지 샌드위치 배아 반면에, 단지이를 둘러싸는 멤브레인의 자연 장력하여 입체 팽창 한정 하였다. 그들은 그들의 복부 (그림 2B) 또는 지느러미 사이드 (그림 2C)와 하나 배양 될 수있다. 어느 쪽이든, 배아 연속 somitogenesis을 보였으며, 그들의 머리가 돌았 다. 이들은 뇌 자궁 굴곡 기능성 혈액 순환을 개발 하였다. 머리 부분이 서서히 중배엽의 분할 부분에 초점을 유지하는 동안 배아, 성장 농축하고 회전되면서 초점 이동되도록 여과지 샌드위치 두 태아는 세그 중배엽에 초점을 묘화했다 (21 시간 27 시간에 그림 2B와 2C 비교). 보충 동영상 (2)는 도시 된 배아의 전체 시간 경과 영화를 보여줍니다도 2b있다. 촬상 간격은 4 분이었다. 이 영화의 상단 패널은 배아의 전체 개요를 보여줍니다. 배아의 발달로 인해 전반적인 비후 및 배아 조직의 회동에 연속적으로 46 시간 이상을 묘화했지만 약 30 시간 후, 분단 중배엽에 초점을 잃었다. 왼쪽 하단 패널은 획득 시간 경과 프레임에서 전체 해상도에서 심장의 초기 개발을 보여줍니다. 정중선의 양측에 한 쌍의 심장 primordia의 융합을 통해 거의 직선 관형 구조체 나중에 치는 오른쪽으로 시작되는 절곡 형성된다. 오른쪽 패널은 가장 최근에 형성된 somites 및 전체 해상도에서 presomitic 중배엽의 앞쪽 끝을 보여주고 시간이 지남에 따라 새로운 somites의 형성을 추적합니다. 보충 영화 3 배양 다른 배아를 보여주고 침수 필터 종이 샌드위치에서 복부 측면을 몇 군데. 촬상 간격은 4 분이었다. 영화는 일을 다루고단계 HH5-6에서 약에 배아의 전자 개발, HH14 (15) 문화 시간에 걸쳐 약 27 시간 무대. 머리 모양을 접어 뒤쪽 진행한다. 그 양측 primordia에서 마음의 양식은, 치고, 오른쪽으로 굴절 시작합니다. 처음 세 네 somites 동시에 형성한다. 추가 somites는 presomitic 중배엽의 앞쪽 끝에서 순차적를 꽃 봉오리. 하판은 높은 세부 헤드 배 초기 심장 형성의 관찰을 허용 전체 해상도 배아의 헤드 영역을 나타낸다. 인해 배아의 투명성, 신경관 폐쇄 미래 헤드 영역에서 관찰 될 수있다. 하단 패널에서 전체 촬영 시간에 전체 해상도에서 동일한 배아의 보충 영화 네 표시 체절 형성. 보충 영화 5는 배아 배양 등의면을 위로 (그림 2C)의 전체 시간 경과를 보여줍니다. 촬상 간격은 10 분이었다. UPP 동안어 패널이 약 무대 HH16-17에 일곱 체절 단계 (HH9)에서 배아의 발달을 보여주고, 하단 패널은 전체 해상도에서 그 단계에 이른 뇌의 형태 학적 변화를 표시하는립니다. 신경 튜브의 지역 붓기는 나중에 13 단계에서 배아 뇌의 다섯 가지 하위 영역으로 분할됩니다 전뇌, 중뇌, 후뇌와의 지역화, 선도, 관찰 할 수있다. 또한, 광학 소체의 성장 분명히 알 수있다. 문화에서 약 30 시간 후, 배아가 죽어 가고있다. 미세 수술 조작으로 수중 필터 종이 샌드위치의 호환성, 여러 폴리스티렌 마이크로 비드를 표시하려면 (~ 지름 40 μm의는) 내부 또는 침수 필터 종이 샌드위치 문화에 닭 배아의 presomitic 중배엽 부근에 이식 하였다. 마이크로 비드는 저장 버퍼 IMPLAN을 제거하는 PBS로 세척 하였다테드 전에 라이트 미네랄 오일 층과 배양 배지를 덮고 (프로토콜 섹션 2.18 스텝과 비교). 유리 파스퇴르 피펫 현미경의 접안 렌즈를 통해 관찰하에 배아 표면에 비드를 전송하는 데 사용되었다. 다섯 구멍을 부드럽게 침술 바늘을 긁어하여 내배엽으로 만들어졌습니다. 스트레칭과 화염에 유리 파스퇴르 피펫을 절곡하여 만든 맞춤 J 모양의 도구, 구슬을 조작하고 그들이 움직이 될 때까지 구멍에 조심스럽게 밀어하는 데 사용되었다. 세 개의 구멍이 하나의 비드 각으로 가득 차 있었다 (그림 3A - 0 시간 및 3b *)와 두 개의 구슬 각 (그림 3A - 0 시간)에 두 개의 구멍. 도 3a 쇼, 선택된 시간 경과 프레임, 구슬의 미세 수술 주입 후 병아리 배아의 개발. 세 비드 성공적으로 원하는 위치를 조직에 도입하고, 그 이동은 위에 묘화 된높은 세부 (그림 3B)의 실험 과정. 배아의 발달은 조작이나 구슬의 존재에 의해 손상 될 것 같지 않았다. 전체 시간 경과 영화에 대한 보충 영화 (6)을 참조하십시오. 촬상 간격은 4 분이었다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig3.jpg"> 그림 3 : 마이크로 비드 주입 후 시간 경과 영상. 원리 증명 실험 마이크로 비드 주입으로 침수 필터 종이 샌드위치의 호환성을 표시합니다. 태아의 머리를 왼쪽에 있지만 실험 동안 묘화되지 않았다. 이미지는 암시 야 조명을 사용하여 획득 하였다. (A) 선택 시간 경과 일곱 마이크로 비드의 주입 후 3 시간 간격으로 조작 된 배아를 보여주는 프레임 (~ 40 μm의 직경). 지속적으로 신장 및 배아 추가 somit를 형성에스. 세 개의 구슬이 제대로 부착과 문화의 18 시간을 통해 조직의 흐름을 내측으로 이동 한 것으로 보인다. 다른 네 개의 구슬은 6 내지 9 그들의 홀에서 문화의 시간을 팝과 후방 표류. 실험의 시작 (0 시간, B *) 및 배양 12 시간 후 (B **)에 presomitic 중배엽에 이식 (B) 세 하나의 구슬의 상세보기 (B3에 B1). 방금 형성 somites의 수는 (B에서 B의 *에서 S9 및 S18 **)를 표시합니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="영화 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie1.jpg"> 기업 영화 1 : EC-문화 복부 측면습니다. 일곱 체절 단계 이후 한천 - 알부민의 BOTTO에 (HH9) 15 일, 배양 복부 측면까지 EC 문화 배아,m 1,33. 촬상 간격은 4 분이었다. 상대적 시간은 왼쪽 상단에 표시됩니다. 배아가 Z 방향에서 밀폐 된 고품질 화상을 획득 할 수있다. 21 시간 후, 심장 박동 및 혈류가 거의 구속하고, 배아 분해하기 시작했다. 하단 패널은 전체 해상도 (100 % 줌)의 presomitic 중배엽 (오른쪽 패널)의 심장 개발 (왼쪽 패널) 및 분할을 시각화하는 동안 상단 패널은 배아의 크기가 조정 개요를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_1_EC_culture-Ventral_up.mp4" target="_blank">(오른쪽 다운로드 클릭).</a> <img alt="영화 2" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie2.jpg"> 보충 영화 2 : 잠수 필터 종이 샌드위치 복부 측면습니다. 일곱 체절 단계 (HH9) 15 년 이후, 복부 SID에서 침수 종이 샌드위치에서 배양 된 배아전자 위를 향. 촬상 간격은 4 분이었다. 상대적 시간은 24 시간 후에 다시 시작, 시간 및 분에 왼쪽 상단에 표시됩니다. 상단 패널은 연속 46 시간 이상 배아의 개발의 크기가 조정 개요를 보여줍니다. 왼쪽 하단 패널은 전체 해상도 (100 % 줌)의 이미지 수집의 첫 10 시간 동안 초기 심장 개발을 시각화. 오른쪽 패널에 초점이 때문에 전체 농축 및 배아 조직의 터닝 손실 될 때까지 전체 해상도 (100 % 줌)에서 개발 약 30 시간에 걸쳐 중배엽을 분할 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_2_Sandwich-Ventral_up.mp4" target="_blank">(오른쪽 다운로드 클릭).</a> <img alt="영화 3" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie3.jpg"> 보충 영화 3 : 머리 배 형성. 로부터의 침수 필터 종이 샌드위치 배아 배양 복부 측면까지 그광고 프로세스 / 머리 배 단계 (HH5-6) 15 약 22 체절 단계 (HH14)에 배양 시간 15 약 27 시간. 촬상 간격은 4 분이었다. 상대적 시간은 24 시간 후에 다시 시작, 시간 및 분에 왼쪽 상단에 표시됩니다. 상단 패널은 배아 발달의 크기가 조정 된 개요를 나타낸다. 하판 전체 해상도 (100 % 크게)에서 태아의 머리 영역을 나타낸다. 헤드 배 및 초기 심장과 신경 튜브의 폐쇄의 형성은 관찰 할 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_3_Sandwich-Ventral_up-Head.mp4" target="_blank">(오른쪽 다운로드 클릭).</a> <img alt="영화 (4)" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie4.jpg"> 보충 영화 4 : Somitogenesis. 헤드 처리 / 머리 배 단계 (HH5-6)에서 침수 필터 종이 샌드위치 배아 배양 복부 쪽 15약 22 체절 단계 (HH14) 배양 시간 15 약 27 시간에. 촬상 간격은 4 분이었다. 상대적 시간은 24 시간 후에 다시 시작, 시간 및 분에 왼쪽 상단에 표시됩니다. 상단 패널은 배아 발달의 크기가 조정 된 개요를 나타낸다. 하판 전체 해상도 (100 % 크게)에서 분할 근축 중배엽를 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_4_Sandwich-Ventral_up-Somitogenesis.mp4" target="_blank">(오른쪽 다운로드 클릭).</a> <img alt="영화 (5)" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie5.jpg"> 보충 영화 5 : 잠수 필터 종이 샌드위치 지느러미 측면습니다. 약 HH16-17 단계 15에 일곱 체절 단계 (HH9) (15)로부터 침수 필터 종이 샌드위치 배아 배양 등의 측면입니다. 촬상 간격은 10 분이었다. 상대 시간이 표시됩니다시간과 분에 왼쪽 상단에, 24 시간 후에 다시 시작. 상단 패널은 배아 발달의 크기가 조정 된 개요를 나타낸다. 하단 패널은 전체 해상도 (100 % 줌)의 초기 뇌의 형태 학적 변화를 보여줍니다. 배아 문화에서 약 30 시간 후에 사망했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_5_Sandwich-Dorsal_up-Head.mp4" target="_blank">(오른쪽 다운로드 클릭).</a> <img alt="영화 (6)" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie6.jpg"> 보충 영화 6 : 마이크로 비드 이식. 아홉 체절 단계 (HH9-10) 15부터 약 19 시간에 대한 침수 필터 종이 샌드위치 배아 배양 복부 측면입니다. 촬상 간격은 4 분이었다. 상대적 시간은 시간과 분에 왼쪽 상단에 표시됩니다. 일곱 마이크로 비드는 PR 주입으로 상판 꼬리 영역의 크기가 조정 된 개요를 나타낸다esomitic 중배엽. 하단 패널은 전체 해상도 (100 % 줌)에 이식 된 마이크로 비드로 영역을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_6_Sandwich-Ventral_up-Microbeads.mp4" target="_blank">(오른쪽 다운로드 클릭).</a>

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