단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

단백질 상호 작용은 세포의 기능의 핵심이다. 열량 및 분광 기술은 일반적으로 그 특성을하는 데 사용됩니다. 여기에서 우리는 Shwachman - 다이아몬드 증후군 (SBDS)에 돌연변이 단백질과 신장 인자 같은 1는 GTPase (EFL1) 사이의 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성을 설명합니다.

이 실험의 전반적인 목표는 형광 이방성(Fluorescence Anisotropy)을 사용하여 관심 있는 두 단백질 간의 상호 작용을 평가하고 정량화하는 것입니다. 이러한 조치는 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 단백질 생화학 및 단백질 생물 물리학 분야(예: 상호 작용이 세포 기능에 중요한 단백질).

이 기술의 주요 장점은 단백질-단백질 상호 작용에 대한 정량적 및 정성적 정보를 얻을 수 있다는 것입니다. 정제된 SBDS-FlAsH 단백질을 준비하려면 먼저 암피실린 1밀리리터당 100마이크로그램이 보충된 LB 액체 배지 1리터를 준비합니다. 그리고 그 안에서 배양은 섭씨 37도에서 600나노미터의 광학 밀도가 0.5에서 0.7에 도달할 때까지 박테리아를 변형시켰습니다.

배양액에 0.5 millimolar IPTG를 첨가하여 SBDS-FlAsH 단백질 발현을 유도하고 5시간 더 배양을 계속합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 10분 동안 3800배 G로 원심분리하여 박테리아 현탁액을 수집합니다. 상층액을 제거합니다.

1밀리몰 PMSF가 보충된 35ml의 SBDS 용해 버터에 세포를 다시 현탁시킵니다. 섭씨 4도에서 10 초 켜기와 30 초 끄기 사이클을 사용하여 총 4 분 동안 초음파 처리에 의해 용해합니다. 그런 다음, 섭씨 4도에서 50분 동안 9, 000배 G로 샘플을 원심분리하십시오.

상층액을 유지하고 팔레트를 버리고 세포 파편을 제거하십시오. 니켈 친화도 컬럼을 3 컬럼 부피의 SBDS lysis 버퍼로 평형을 이룬 후, 정화된 상등액 전체를 컬럼에 주입합니다. 3 컬럼 부피의 SBDS lysis buffer로 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거합니다.

컬럼 세척 후 결합된 단백질을 3개의 컬럼 부피의 SBDS 용리 완충액으로 용리시킵니다. 단백질을 추가로 정제하려면 sulfopropyl 양이온 교환기 컬럼을 3개의 컬럼 부피의 저염 S 컬럼 버퍼로 평형을 이룹니다. 단백질을 50밀리몰의 인산염 완충액 PH 6.5로 6배 희석하고 컬럼에 도입합니다.

결합되지 않은 물질을 3개의 저염 S 컬럼 버퍼로 세척합니다. 그런 다음 컬럼에 50밀리몰의 인산염 완충액 PH 6.5, 1몰의 염화나트륨을 추가하여 한 단계로 단백질을 용리시킵니다. 용출액을 50 밀리몰 인산염 완충액 PH 6.5로 3 배 희석합니다.

다음, 15 분 동안 3800 시간 G에 원심 분리에 의하여 초여과 장치로 단백질을 집중하십시오. 이러한 유형의 실험에 사용된 단백질의 품질은 매우 강력합니다. 사용된 단백질 샘플의 순도가 높지 않은 경우 데이터 해석이 복잡해집니다.

SDS-PAGE 분석 및 Coomassie 염색을 통해 SBDS-FlAsH 단백질의 순도를 검증합니다. 단백질을 액체 질소에 급속 동결하고 나중에 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 정제된 EFL1 단백질을 준비하기 위해 첫 번째 배양은 우라실이 없는 1리터의 합성 드롭아웃 배지에서 섭씨 30도의 효모를 변형시키고 600나노미터의 광학 밀도가 1.8에 도달할 때까지 0.5%의 포도당을 보충했습니다.

배양액에 2.8%의 갈락토오스를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고 섭씨 30도에서 18시간 동안 배양을 계속합니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 3800배 G의 원심분리로 효모 현탁액을 수집합니다. 원심분리 후 상층액을 제거합니다.

PMSF 1밀리몰과 벤자미딘 1밀리몰이 보충된 EFL1 용해 완충액 50ml에 세포를 다시 현탁시킵니다. 유리 구슬을 사용하여 비드 비터에서 마찰로 세포를 파괴하고, 섭씨 4도에서 2분 켜기와 15분 끄기 주기를 사용하여 총 6분 동안 세포를 파괴합니다. 그런 다음, 섭씨 4도에서 50분 동안 9, 000배 G로 샘플을 원심분리하십시오.

상층액을 유지하고 입천장을 버리고 세포 파편을 제거하십시오. 다음으로, 니켈 친화도 컬럼을 3개의 컬럼 부피의 EFL1 용해 버퍼로 평형을 이핍니다. 평형을 이룬 컬럼에 정화된 모든 상등액을 주입합니다.

3 컬럼 부피의 EFL1 용해 완충액으로 컬럼을 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거한 후, 3 컬럼 부피의 EFL1 용출 완충액으로 결합된 단백질을 용리화합니다. EFL1 단백질을 추가로 정제하려면 크기 배제 컬럼을 1.5 컬럼 부피의 이방성 완충액으로 평형을 이룹니다. 니켈 친화도 칼럼에서 회피된 EFL1 단백질을 3800배 G.에서 원심분리하여 한외여과 장치를 사용하여 1밀리리터로 농축한 다음 농축된 샘플을 크기 배제 컬럼에 도입합니다.

용출된 단백질을 수집하고 한외 여과를 통해 약 30마이크로몰의 최종 농도로 농축합니다. SDS-PAGE 분석 및 Coomassie 염색을 통해 EFL1 단백질의 순도를 확인합니다. 단백질을 액체 질소에 급속 동결하고 나중에 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

5마이크로미터 부피의 이방성 완충액에 3나노몰의 SBDS-FlAsH 단백질과 3나노몰의 루미오 그린 염료를 혼합합니다. 섭씨 4도에서 8시간 동안 반응을 진행하십시오. 8시간 후, 밤새 이방성 완충액에 대해 검체를 투석하여 유리 염료를 제거합니다.

Quartz Cuvette를 사용하여 분광 광도계에서 280나노미터 및 508나노미터에서 흡수제를 측정합니다. 그런 다음 Lambert-Beer Law를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 라벨링된 단백질의 백분율을 정량화합니다. 이방영양 값을 측정하기 전에 단백질 군단의 각 여과 단계를 신중하게 수행하여 전체 샘플이 용액에 분주되고 균질해지도록 해야 합니다.

형광 큐벳에 200마이크로리터의 30나노몰 SBDS-FlAsH를 이방영양 완충액에 넣고 2마이크로리터의 30마이크로몰 EFL1을 적정합니다. 철저히 혼합하고 이방성 및 형광 값을 측정하기 전에 반응을 3분 동안 그대로 두십시오. 총 40마이크로리터의 EFL1이 추가될 때까지 이 과정을 반복합니다.

마지막 단계로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 추정된 바인딩 모델에 데이터를 맞춥니다. 이영양 실험을 수행하려면 형광 강도의 큰 변화를 배제하는 것이 중요합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 SBDS-FlAsH의 형광은 EFL1에 결합할 때 눈에 띄게 변하지 않습니다.

SBDS-FlAsH를 함유한 석영 큐벳에 EFL1을 적정하면 초기에 관찰된 이방성이 증가합니다. EFL1의 몇 가지 추가 사항은 비선형 최소 제곱 회귀를 사용하여 추정된 바인딩 모델에 맞출 수 있는 해당 바인딩 곡선을 설명합니다. 이 경우 단일 결합 부위 모델은 실험 데이터를 적절하게 설명하지 않습니다.

대신, 두 개의 동일하지 않은 결합 부위 모델이 실험 데이터를 적절하게 설명합니다. 일단 숙달되면 형광 이방영양 결합 실험이 제대로 수행되면 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 정제된 단백질을 대량으로 섭취하는 것이 중요합니다.

이 절차와 병행하여, 적절한 결합 모델을 지원하기 위해 단편 기반 보체 분석 또는 연구된 단백질의 다른 도메인에 대한 형광 이방국과 함께 사용되던 이와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 결합 실험을 수행한 후 형광 이방성을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.