마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬
November 4th, 2016
우리는 PDC의 기능 연구를위한 루푸스 발생하기 쉬운 마우스의 골수로부터 고순도 형질 수지상 세포 (PDC)를 분리 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 프로토콜을보고합니다.
이 실험의 전반적인 목표는 루푸스가 발생하기 쉬운 마우스의 골수에서 고순도의 플라스마사이토이드 수지상 세포(PDC)를 분리하여 그 기능을 연구하는 것입니다. 이 방법은 루푸스 발달 후기 단계에서 PDC를 생성하는 인터페론 알파와 같은 특정 면역 세포 집단의 특성과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 하나 또는 여러 개의 타겟 집단을 마그네틱 비드 분류보다 더 높은 순도로 농축할 수 있다는 것입니다.
수확 후 뒷다리 뼈와 4ml의 완전한 배지를 모르타르에 옮깁니다. 6ml의 새로운 완전 매체를 추가하여 총 부피를 10ml로 만듭니다. 그리고 유봉으로 뼈를 부드럽게 부수십시오.
유봉을 부드럽게 저어 골수를 제거합니다. 그런 다음 70미크론 스트레이너를 통해 모든 매체를 얼음 위의 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 모르타르에 10ml의 신선한 완전 배지를 추가합니다.
그리고 뼈가 하얗게 나타날 때까지 상층액을 두 번 더 여과합니다. 그런 다음 골수 세포를 원심 분리하고 펠릿을 10ml의 새로운 완전 배지에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 15ml 원뿔형 튜브에 새로 준비된 5ml의 밀도 구배 매체에 세포를 층을 쌓고 층을 방해하지 않도록 주의합니다.
그리고 원심분리에 의해 세포를 분리한다. 그런 다음 용액의 상단 8 밀리리터를 조심스럽게 제거하고 계면에서 2 밀리리터의 버피 코트를 수집합니다. 분리된 단핵 세포에 12ml의 얼음처럼 차가운 완전 배지를 추가하고 튜브를 덮어 반전으로 혼합합니다.
그런 다음 원심분리로 세포를 펠릿화합니다. FACS를 위해 세포를 염색하려면 섭씨 4도에서 100마이크로리터의 CD1632FC 차단 항체에 다시 현탁시킵니다. 10분 후, 4ml의 얼음처럼 차가운 선별 버퍼로 세포를 세척하고 100마이크로리터의 적절한 세포 표면 염색 항체 칵테일로 세포에 라벨을 붙입니다.
어둠 속에서 섭씨 4도에서 15분 동안. 4ml의 얼음처럼 차가운 분류 버퍼로 세포를 세척하여 결합되지 않은 형광 접합 항체를 제거합니다. 그런 다음 펠릿을 500마이크로리터의 FACS 로딩 용액에 다시 현탁시키고 샘플을 얼음 위의 FACS 튜브로 옮깁니다.
보상 대조군을 염색하려면 튜브당 10-6번째 비장세포를 1회 분주합니다. 4ml의 분류 버퍼로 셀을 세척하고 100마이크로리터의 분류 버퍼에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 마스터 세포 표면 항체 칵테일의 적절한 형광 접합 항체를 각 해당 보상 튜브에 추가하고 튜브를 흔들어 혼합합니다.
어둠 속에서 섭씨 4도의 어둠 속에서 15분 후 모든 샘플을 분류 버퍼로 세척하고 펠릿을 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 분류 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 500마이크로리터의 FACS 로딩 용액에 다시 현탁되는 DAPI 튜브를 제외하고. 형광 활성화 세포 분류를 통해 표적 세포 집단을 정제하기 위해 선별 밸브 아래에 항생제가 보충된 500마이크로리터의 FBS가 들어 있는 수집 튜브를 로드합니다.
다음으로, 염색되지 않은 튜브를 로드하고 10, 000개의 이벤트를 수집하여 각 형광 강도에 대한 네거티브 게이트를 설정합니다. 그리고 10, 단 하나 얼룩 보상 관에 있는 000의 사건은 각 형광성 광도에 대한 긍정적인 문을 놓기 위하여 관을 답니다. 실험 샘플에서 3, 000개의 이벤트를 수집하여 정렬된 세포 집단의 게이트를 설정합니다.
형광 강도를 X 및 Y 액세스 그래프의 매개변수로 사용하여 대상 세포 집단을 수동으로 게이트합니다. 그런 다음 표적 세포 집단을 수집 튜브로 분류합니다. 분류가 끝나면 최대 4ml의 아이스콜 완전 배지를 세포에 추가합니다.
그런 다음 튜브를 덮고 반전으로 세포를 혼합합니다. 원심분리를 통해 정제된 세포를 펠렛화하여 상층액의 마지막 200마이크로리터를 제외한 모든 세포를 흡인합니다. 그런 다음 펠릿을 1ml의 얼음처럼 차가운 완전 배지에 다시 현탁시키고 두 번째 원심분리를 위해 세포를 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
마지막으로, 상층액의 마지막 100마이크로리터를 제외한 모든 세포를 흡인하고 분류된 세포 집단을 사용할 때까지 얼음에 보관합니다. 루푸스가 발생하기 쉬운 마우스에서 골수 플라스마사이토이드 수지상 세포의 자기 활성화 세포 분류는 농축 후 순도가 7.75%에 불과합니다. 그러나 FACS가 풍부한 플라스마사이토이드 수지상 세포는 분류 후 96.4%의 높은 순도를 보여줍니다.
높은 순도를 보장하기 위해 단핵 골수 세포를 먼저 게이트하고 전방 및 측면 산란 매개변수에 의해 파편과 분리합니다. 전방 산란 너비 대 전방 산란 높이, 측면 산란 폭 대 측면 산란 높이를 사용하여 단일 셀은 응집체에 의해 생성된 거짓 긍정 신호를 피하기 위해 추가로 게이트됩니다. 그런 다음 살아있는 단일 DAPI 음성 세포는 CD11c 양성, CD11B 음성 세포 표면 발현에 의해 게이팅되어 B220 양성, PDCA-1 양성 표적 골수 플라스맥토이드 수지상 세포 집단의 추가 게이팅을 허용합니다.
분류된 PDC 집단은 순도가 높을 뿐만 아니라 시험관 내에서 CPG 자극 시 IFNalpha를 생산할 수 있는 능력으로 기능적으로도 정상입니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포의 생존력을 보존하기 위해 뼈를 부수고 방출된 골수를 부드럽게 저어주는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 RNA 염기서열분석 또는 시험관 내 배양 및 자극과 같은 다른 방법을 수행하여 농축 세포 집단의 유전자 발현 또는 기능에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.
개발 후 이 기술은 PDC 연구자들이 루푸스 및 루푸스 취약 마우스 모델의 개발에서 이 강력한 세포의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 루푸스가 발생하기 쉬운 마우스의 골수에서 고도로 정제된 PDC 집단을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 연구는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 루푸스 경향성 마우스의 골수에서 형질세포양 수지상 세포(pDC)를 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 pDC의 후속 기능 연구를 위한 높은 순도를 달성하는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 면역학
- 세포 생물학
- 자가면역
배경
- 형질세포양 수지상 세포는 면역 반응에 중요합니다.
- 특히 루푸스 진행 중에 인터페론 알파를 생성합니다.
- 정확한 기능 분석을 위해 높은 순도의 분리가 필수적입니다.
- 형광 활성화 세포 분류는 기존 방법에 비해 장점이 있습니다.
연구 목적
- 루푸스 경향성 마우스에서 pDC를 분리합니다.
- pDC의 기능적 특성을 연구합니다.
- 루푸스에서 면역 세포 행동에 대한 이해를 증진합니다.
사용된 방법
- 루푸스 경향성 마우스에서 골수를 수확합니다.
- 분리를 위해 형광 활성화 세포 분류를 사용합니다.
- 세포 처리를 위한 완전한 배지를 준비합니다.
- 분류를 위해 세포를 방출하기 위해 뼈를 부숩니다.
주요 결과
- 높은 순도로 pDC를 성공적으로 분리했습니다.
- 루푸스에서 pDC 기능에 대한 이해를 증진했습니다.
- 형광 활성화 세포 분류의 장점을 입증했습니다.
- 향후 연구를 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공했습니다.
결론
- 이 프로토콜은 기능 연구를 위해 pDC를 효과적으로 분리합니다.
- 연구 결과는 루푸스 병리에 대한 이해에 기여합니다.
- 향후 연구는 이 방법론을 기반으로 진행할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Isolating rare immune cell populations with high purity is critical for mechanistic de-risking in target validation and preclinical model development. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables precise phenotypic separation of plasmacytoid dendritic cells from lupus-prone mouse bone marrow, supporting reliable functional assays and translational biomarker discovery. This approach reduces biological noise in early discovery, improving predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of plasmacytoid dendritic cell function in lupus pathogenesis by isolating a pure population for interferon alpha production studies.
- Operational Value: Achieves up to 96.4% purity post-sorting, significantly exceeding magnetic-activated cell sorting alternatives.
- Strategic Value: Supports target confidence by reducing cellular heterogeneity in functional readouts, aiding go/no-go decisions in immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified plasmacytoid dendritic cells suitable for in vitro stimulation assays, such as CpG-induced interferon alpha measurement.
- Operational Value: Permits simultaneous separation of multiple cell populations, increasing experimental throughput and assay standardization.
- Strategic Value: Creates a reproducible input for screening workflows, enabling reliable compound evaluation against defined immune phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system using lupus-prone mouse models to study plasmacytoid dendritic cell contributions to autoimmunity.
- Operational Value: Isolated cells remain functionally normal, capable of interferon alpha production upon stimulation, validating assay readiness.
- Strategic Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by supplying well-characterized primary cells for mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early target validation through phenotypic screening and enabling lead identification via functional readouts in purified immune cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating plasmacytoid dendritic cells to clarify their role in interferon-driven lupus pathology.
- Screening: Delivers standardized, high-purity cell populations for reproducible functional assays and compound screening.
- Analytics: Enables quantitative dependent variable measurements such as cytokine production, flow cytometry readouts, and purity assessment via forward/side scatter gating.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of lupus-prone mice, aligning with mechanistic de-risking in autoimmune disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for isolating rare immune cells across multiple immunology and autoimmunity projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduction of mechanistic ambiguity in immune cell function studies.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined gating strategies and compensation controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions and reduced late-stage biological risk in immunomodulator development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable preclinical data from purified cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, cell staining, and compensation controls for accurate fluorescence-activated cell sorting.
- Dependent on instrumentation including flow cytometers, sorting equipment, and centrifugation systems for bone marrow processing.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, gating strategies, and sorting protocols across immunology and assay development groups.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other model systems or tissue sources beyond mouse bone marrow.
- Includes practical limitations such as the need for gentle bone marrow disruption to preserve cell viability and the time-intensive nature of multi-step purification.
