Name: 탐식의 초기 단계를 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 학습하세요 공초점 현미경을 이용한 탐식 초기 단계 시각화 기법으로 Candida albicans와 같은 병원체가 숙주 세포에 진입하는 메커니즘을 실시간으로 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 면역학 및 감염병 연구에 활용됩니다.

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우리는 이미징을위한 MIT의 화이트 헤드 연구소의 웬디 연어와 중사 님 시설의 니키 왓슨 감사합니다.

DC2.4 및 RAW 264.7 세포주 1. 준비 주 : 마크로파지 형 세포주 RAW 264.7 및 수지상 세포주 DC2.4 모두 뮤린 기원이며, 다음의 조건은 세포 성장을 위해 사용되었다. <ol><li> 보충 된 DMEM에서 RAW 264.7 세포 (둘 베코 최소 이글 배지) 철 10 %, 5 % CO 2 인큐베이터에서 가습 37 ℃에서 비활성화 된 태아 소 혈청 (FBS). </li><li> L 글루타민 대신 DMEM 보충 사용 RPMI (로스웰 파크 메모리얼 연구소) 매체를 제외하고, RAW 264.7 세포의 그것과 유사한 조건에서 DC2.4 세포를 성장. </li></ol> 2. 형광 공액 미립자의 제조 : C. albicans에, 자이 모산, IgG의 코팅 비즈 <ol><li> 칸디다 알비 칸스 성장 <ol><li> 열린 우리당 (2 % 박토 - 펩톤, 1 %로 보충 YPD 25 ml의 냉동 글리세롤 재고에서 C. albicans에 스트레인 SC5314 접종효모 추출물, 2 % 글루코스 밤새 30 ° C에서 80 μg의 / ㎖의 우리 딘). 참고 : OD (12)의 600보다 더 칸디다 문화를 성장하지 마십시오. </li><li> 알비 칸스 (C. albicans) 1 mL를 취하여 실온에서 5 분 동안 2000 × g으로 그것을 스핀 다운. </li><li> 뜨는을 기음과 PBS 1 ml의와 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 2000 × g으로 원심 분리하여 침전물을 수집한다. </li><li> 단계를 반복 2.1.4. </li><li> 식세포의 수와 관련하여 C. albicans에의 감염 (MOI)의 다양성을 계산하고 섹션 3. OD에 설명 된대로 1 (600)하면 1ml를 당 2.5 × 10 (7) 칸디다 알비 칸스에 해당되는 식균 작용 분석을 진행합니다. 주 : 칸디다-BFP의 발생 기준 (13)에 대하여 설명한다. </li></ol></li><li> 자이 모산과의 IgG 코팅 구슬의 제조 참고 : 자이 모산은 인 β 글루칸 함유사카로 마이 세스 세레 비지에서 파생 된 곰팡이 탄수화물 입자 준비. 자이 모산은 대 식세포 및 수지상 세포에서 염증성 신호를 불러 일으키는 것으로 알려져 있으며,이를 식균 작용 연구 13, 14, 15에서 광범위하게 사용되어왔다. <ol><li> 간단히 입자를 포함하는 튜브를 와동, 및 1.5 ㎖의 튜브에 실험에 충분한 양으로 나누어지는. 참고 : 일반적으로 우리는 (하나의 셀에 대해, 10 모산 입자 또는 IgG를 코팅 구슬을 추가) 1시 10분 비율을 사용합니다. </li><li> 얼음 차가운 PBS 1 ML을 추가, 10,000 x g에서 1 분간 원심 분리하여 입자를 수집합니다. </li><li> 뜨는을 대기음 1 ml의 얼음처럼 차가운 PBS의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 단계를 반복 2.2.2-2.2.3 참고 : 2.2.5 단계 또는 사용까지 4 ° C에서 튜브를 저장하기 위해 진행합니다. </li><li> 을 방지하기 위해 초음파 욕조 초음파 처리기에서 10 초 미립자 (120 V, 50 ~ 60 kHz로)를 초음파 처리뉴욕 입자의 응집. </li></ol></li></ol> 3. 탐식 참고 탐식이 입자의 표면 리간드와의 상호 작용을 통해 PRRS 식세포의 세포 표면 입자의 결합으로 시작하는 복잡한 과정이다. 결합은 액틴의 조립체와의 접촉 부위에서 관련 단백질 및 포식성 컵의 형성으로 이어진다. 후속 액틴 분해는 phagosome 발생 및 미립자의 전체 말림 초래한다. 우리는 식균 작용의 여러 단계를 설명 아래. <ol><li> 바인딩 분석 참고 : 본 실험의 목적은 대상 입자에 리간드와 식세포상의 수용체 사이의 상호 작용을 포함 식세포의 제 1 단계를 모니터링한다. <ol><li> 이들은 실험시 60-70% 합류되도록 챔버 슬라이드에 약 5 × 104 세포를 시드. Alternatively, 커버 슬립 접시에 세포 또는 유리 바닥 96 웰 플레이트 (24 또는 12 웰 형식). 밤새 5 % CO 2와 37 ° C 가습 인큐베이터에서 세포를 품어. 주 : 혈구 세포 또는 이와 유사한 기술을 사용하여 계산 될 수있다. </li><li> 10 분 동안 10 ° C에서 챔버 슬라이드 (또는 판)을 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 각 웰 피펫 또는 흡입기를 사용하여 매체를 제거합니다. 주의 : 챔버의 coverglass 시스템의 각 웰이 작은주의로이 단계를 수행; 피펫의 팁 또는 흡입기의 강한 공기 흐름 세포를 교란하기 쉽습니다. </li><li> 세포 배양 배지로 형광 표지 된 미립자를 혼합 (전술 한 바와 같이 제조 됨). 세포에, (10의 MOI에) 형광 접합 - 자이 모산 또는 라텍스 구슬 토끼의 IgG-FITC (셀 당 10 입자) 칸디다 -BFP를 추가합니다. 모든 셀이 포함되도록 잘 한 챔버 200 μL 미디어의 최종 볼륨을 사용합니다. </li><li> 277에서 챔버 슬라이드를 스핀 다운10 ℃에서 3 분 XG. 주 :이 원심 분리 공정은 미립자와 세포 사이의 접촉을 증가시키는 것을 돕고, 그 결합 과정을 동기화한다. </li><li> 즉시 5 분 동안 5 % CO 2, 37 ℃, 가습 인큐베이터 챔버 슬라이드를 옮긴다. </li><li> 인큐베이터에서 챔버 슬라이드를 제거하고 미디어를 대기음. </li><li> 세포가 얼음처럼 차가운 PBS로 3 배 씻으십시오. 참고 : 광학 현미경과 결합되지 않은 입자의 존재를 확인하고 필요한 경우 PBS로 여러 번 씻는다. 이 분석 동안에 배경 잡음을 최소화하는 웰로부터 비 결합 입자를 제거하는 것이 필수적이다. </li><li> 실온에서 30 분 동안 배양하여 PBS에 희석 된 500 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)을 첨가하여 세포를 고정한다. 주의 :이 단계는 고도로 독성, 부식성 및 잠재적 인 발암 물질 4 % PFA의 사용을 필요로한다. 이 액체를 사용할 때 적절한주의를 기울여야합니다. 또한, 빛으로부터 샘플을 보호합니다. </li><li&gt; 챔버로 PBS 500 μl를 추가하여 세포를 씻으 부드럽게 솔루션을 대기음. </li><li> 두 번 3.1.9 단계를 반복합니다. 참고 :이 단계에서, 바로 이전의 PBS를 제거한 후 각각의 유리 병 리필. </li><li> 10 분 동안 PBS에서 50 mM의 NH 4 CL 500 μL와 함께 배양하여 고정을 중지합니다. </li><li> 단계 3.1.10에 기술 된 바와 같이 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 실온에서 30 분 동안 (PBS에 0.1 % 사포닌, 0.2 % BSA) 결합 완충액 250 μL를 첨가하여 세포를 Permeabilize 하시려면. </li><li> 얼룩 (: 결합 버퍼 (500) 1 희석) 형광 접합 팔로이 딘을 추가하여 F는 액틴. 실온에서 1 시간 동안 세포를 인큐베이션. </li><li> 단계 3.1.10에 기술 된 바와 같이 PBS로 세포를 세 번 씻는다. </li><li> 공 초점 현미경 (63X 목표, 402 nm 내지 488 nm의 레이저)를 사용하여 이미지를 캡처하고 ImageJ에 16 사용하여 이미지를 분석 할 수 있습니다. 참고 : 성공적인 입자가 식세포 CU의 존재에 의해 특징 바인딩사이트에 페이지 위치 미립자 접촉 탐식 세포 (그림 1). 단계 3.2.5을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 식균 작용 통풍 관 분석 주 :이 실험은 공 촛점 현미경 (도 2)를 이용하여 형광 표지 된 대 식세포에 의한 미립자의 완전한 내재화를 모니터링하도록 설계된다. <ol><li> 이들은 실험시 60-70% 합류되도록 챔버 슬라이드에 약 5 × 104 세포를 시드. 또한, 커버 슬립 접시에 세포 또는 유리 바닥 96 웰 플레이트 (24 또는 12 웰 형식). 밤새 5 % CO 2와 37 ° C 가습 인큐베이터에서 세포를 품어. 주 : 혈구 세포 또는 이와 유사한 기술을 사용하여 계산 될 수있다. </li><li> 10 분 동안 10 ° C에서 챔버 슬라이드 (또는 플레이트)를 유지한다. 주 : 냉각 동기화 식균 작용을 갖고이어서 이입뿐만 아니라 불필요한 식균 작용을 차단하고,하기 위해 필요하다. </li><li> 반환 한3.1.3에서 3.1.5로 ORM 단계 </li><li> 5 % CO 2와 37 ° C 가습 인큐베이터 챔버 슬라이드로 이동, 다른 시점 동안 품어. 30, 60, 90 분 후 감염 후 세포를 수정. C. 알비 칸스 60 분 후 감염에 균사를 형성하기 시작 관찰; 식세포는 90 분 8 후 세포 사멸 (pyroptosis)을 표시하기 시작합니다. 주 :이 추천 및 최적화는 세포 종류와 입자에 따라 중요하다. </li><li> 3.1.7에서 3.1.15로 단계를 수행합니다. ImageJ에 16을 사용하여 이미지를 분석 할 수 있습니다. 참고 : 성공적으로 흡수가 식세포의 세포질 내의 입자의 완전한 국제화 특징으로한다 (그림 2). 이러한 팔로이 딘으로 세포 표면 마커 식세포 염색하여 세포의 윤곽을 묘사하도록 돕는다. 이는 입자가 세포 표면 또는 COMPL에 결합되어 있는지 여부를 확인하는 것도 위해 Z-스택을 수행하는 필수etely 내면화. </li></ol></li><li> 탐식의 라이브 영상 참고 :이 프로토콜에서 우리는 형광 접합 자이 모산을 사용하여 식균 작용의 다른 단계를 캡처하는 공 초점 현미경의 사용을 설명합니다. 우리는 안정적으로 mCherry - 태그 F - 굴지 8을 표현하는 수지상 세포 라인 DC2.4, 살아있는 세포에서 사상 굴지의 분포를 표시하는 바이오 센서를 사용합니다. 식세포는 액틴 구동 방법이기 때문에,이 셀의 라이브 영상을 F 액틴 네트워크의 이동 및 역학을 캡처 우릴 수뿐만 아니라 살아있는 세포 내의 다른 식세포 이벤트 (도 3, 영화 1)를 시각화 할뿐만 아니라. <ol><li> 이들은 실험시 60~70% 합류되도록 농도 챔버 슬라이드에서 약 5 × 104 세포를 시드. 밤새 5 % CO 2와 37 ° C 가습 인큐베이터에서 세포를 품어. 참고 : 세포는 혈구 또는를 사용하여 계산 될 수있다유사한 기술. </li><li> 10 분 동안 얼음에 챔버 슬라이드를 유지합니다. 주 : 냉각 불필요한 흡수를 차단하고, 동기화 된 식균 작용을하기 위해 필요하다. </li><li> 3.1.3에서 3.1.5로 단계를 수행 </li><li> 37 ° C에 현미경 스테이지를 사전 따뜻하게 5 % CO 2 챔버를 평형. 이미징을 시작하기 전에 안정 온도와 CO 2에 대한 30 ~ 45 분을 기다립니다. 참고 : CO 2 및 온도 수준이 식균 작용에 중요하기 때문에, 그것은 환경 챔버를 평형 전에 실험 현미경 히터를 켜하는 것이 중요하다. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2에서 평형 현미경 인큐베이터 인클로저에있는 세포를 포함하는 챔버 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 라이브 영상 (17), (18)을 수행합니다. 주 : 레이저 파워 (게인, 핀홀 등)의 설정이 제의 종류에 따라 달라질 수있다전자 현미경과 형광 프로브를 사용합니다. 따라서, 우리는 라이브 영상 (17, 18)에 대한 최적의 조건을 현미경의 사용 설명서를 참고하시기 바랍니다. <ol><li> 공 초점 레이저 주사 현미경 (및 관련 소프트웨어) 라이브 이미징을 사용합니다. 1-1.1 에어리 단위의 핀홀과 63X 1.4NA 기름 목표를 사용합니다. </li><li> 이미징을 시작하려면, 챔버 슬라이드의 대표 지역을 찾을 수있는 시야를 사용했습니다. 다음으로, 소프트웨어의 위치 옵션을 클릭하여 필드를 선택합니다. 488과 582 나노 미터 사이의 파장을 검출하기 위해, 582 nm의 빔 스플리터 488 nm의 레이저에 대한 필터 세트를 사용 트랙 1에 GFP를 검출한다. </li><li> 트랙 2에서는 mCherry (RFP)를위한 최적의 설정 필터 578 nm에서 빔 스플리터를 사용 nm의 578 내지 600 파장을 검출을 선택합니다. 488 nm에서 50 %의 레이저 출력과 600-700의 이득 출력이 578 nm의 레이저를 사용한다. 90 분 총 이미지마다 30 초를 얻습니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune recognition.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).</li>
<li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Information processing during phagocytosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li>
<li>Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+macrophage+%26%2334%3Bprobing%26%2334%3B+is+required+for+the+efficient+capture+of+phagocytic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic macrophage &#34;probing&#34; is required for the efficient capture of phagocytic targets.</a> J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).</li>
<li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li>
<li>Botelho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+biphasic+changes+in+phosphatidylinositol-4%2C5-bisphosphate+at+sites+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis.</a> J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).</li>
<li>Tafesse, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Sphingolipid+Biosynthesis+Blocks+Phagocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Pathog. 11, e1005188(2015).</li>
<li>Kwik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+cholesterol%2C+lateral+mobility%2C+and+the+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate-dependent+organization+of+cell+actin%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin.</a> PNAS. 100, 13964-13969 (2003).</li>
<li>Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides+in+phagocytosis+and+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22BBA%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis.</a> BBA. 1851, 805-823 (2015).</li>
<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Strijbis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruton%27s+Tyrosine+Kinase+%28BTK%29+and+Vav1+contribute+to+Dectin1-dependent+phagocytosis+of+Candida+albicans+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages.</a> PLoS Pathog. 9, e1003446(2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-glucan+receptor+Dectin-1+activates+the+integrin+Mac-1+in+neutrophils+via+Vav+protein+signaling+to+promote+Candida+albicans+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance.</a> Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).</li>
<li>Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+recognition+is+mediated+by+the+association+of+dectin-1+and+galectin-3+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages.</a> PNAS. 108, 14270-14275 (2011).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24974023">Fluorescence live cell imaging.</a> Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+that+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
<li>Jaumouille, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+reorganization+by+Syk+regulates+Fcgamma+receptor+responsiveness+by+increasing+its+lateral+mobility+and+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering.</a> Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).</li>
<li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Immunopath%22%5BJournal%5D)">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).</li>
<li>Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+host-Leishmania+interactions%3A+significance+in+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Para.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis.</a> Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).</li>
<li>John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii.</a> Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).</li>
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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

대 식세포 및 수지상 세포와 같은 전문 식세포, 삼켜 때문에 병원균이 침입 숙주 방어 시스템의 중요한 요소 식균 작용을 제거한다. 이 과정에서 식세포는 세포 표면 8, 19, 20에서 광범위한 막 조직 개편과 세포 골격 재 배열을 받다. 더 나은이 역동적 인 과정을 이해하기 위해, 식균 작용의 다른 단계의 시각화는 필수적이다. 여기서 우리는 식세포의 다양한 단계를 모니터링하는 데 사용 된 현미경 기반 방법을 설명했다. 라이브 영상 법의 주요 의미는 분자 수준에서 호스트 병원체 인터페이스를 모니터링하는 놀라운 능력을 제공한다는 것이다. 미생물 감염의 주요 단계의 시각화를 허용함으로써, 라이브 영상의 면역 반응의 기본적인 특성에 대한 통찰력을 제공 임계병원균 8,...

박테리아, 바이러스, 곰팡이 등 병원균에 지속적으로 노출에도 불구하고, 우리 몸에 잘 감염에 대한 보호를 제공하는 면역 메커니즘을 갖추고있다. 선천성 면역 시스템은 침입하는 병원체에 대한 방어의 첫 번째 줄과 인식 및 외국 목표를 내면화 식세포에 주로 의존한다. 식균 작용은 0.5 μm의보다 큰 원치 않는 미립자의 말림을 포함 진화론 보존 세포 과정이다. 대 식세포는 말림 3 종래 병원균에 존재하는 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPs가)를 인식 할 수 있도록 세포 표면에서 (또한 패턴 인식 수용체 PRRS라고도 함) 면역 수용체의 넓은 범위를 표현한다. 병원체가 세포 표면 수용체 클러스터링 다음과 식세포 컵의 형성을 유발 바인딩. 이 주위에 돌출 굴지 중심의 막 리모델링 결과타겟은, 결국 감싸는와 핀치 오프하면 이산 phagosomal 액포 2,5-을 형성한다. phagosome는 성숙하고 phagolysosome (6)을 형성 후기 엔도 좀과 리소좀과 이후의 융합에 의해 산성화. 식균 작용은 수용체 - 매개 및 액틴 구동 이벤트로서 설명되어 있지만,이 프로세스는 또한 phosphoinositides (PI들) 및 스핑 고리 피드 (7, 8) 등의 세포막을 구성하는 지질의 시공간 변경에 의존한다. 액틴의 중합이 식세포 컵의 기지에서 phosphoinositol-4,5-biphosphate (PI (4,5) P 2)의 지방 축적에 의해 결정되지만, 굴지의 해중합은 (PI (4,5) P의 전환에 따라 달라집니다 2 phosphoinositol-3,4,5-biphosphate합니다 (PI (3,4,5) P) 3, 9. 모두 수정대상 주위 pseudopods 후자는 식세포 (10)의 세포질에 입자 침몰 가능의 성공적인 확장의 전 리드 필수입니다. 탐식하는 기능이 셀은 하나의 전문 식세포, 대 식세포 / 단핵 세포, 과립구 / 호중구 및 수지상 세포 또는 섬유 아세포 및 상피 세포에 11 비전문 식세포, 등. 전문 식세포에 의해 수행 식세포가 병원체에 대한 타고난 및 적응 면역 반응의 조정을 담당하면서 모든 식세포에 의해 수행 식균 작용은 조직의 유지 보수 및 리모델링의 중심 역할을한다. 전문 식세포는 적응 면역 체계의 림프 세포에도 존재하는 항원을 삼켜과 병원균을 죽일,하지만하지 않습니다. 이 때문에 선도, 염증성 사이토 카인의 방출과 림프 세포의 결합에 기여감염 (12)의 성공적인 봉쇄. 기존의 생화학 적 기술은 번역 후 변형 단백질 사이의 다양한 높은 친 화성 협회 등의 식균 작용하는 동안 다른 세포 과정의 분자 메커니즘에 관한 지식을 얻는 수단이되고있다. 그러나, 종래의 생화학 적 방법을 이용하여 탐식 이벤트 시공간 동역학에 관한 정보를 얻는 것이 곤란하다. 라이브 세포 이미징뿐만 아니라 우리가 시간에 민감한 방식으로 세포 이벤트를 모니터링 할 수 있습니다뿐만 아니라, 단일 세포 수준에서 정보를 얻기 위해 우리가 할 수 있습니다. 여기서 우리는 식세포의 다른 단계를 조사하는 방법을 설명뿐만 아니라, 공 초점 현미경을 사용하여 시공간 전체 과정을 분석.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>세포 신호 기술&nbsp;</td><td>9998</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP-231-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s 미니멀 이글' s medium)</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline)</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>FITC-coupled IgG-coated latex beads</td><td>Cayman</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution (PBS 중 4%))</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122">15-140-122</a></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution (PBS에서 0.4% (w/v))</td><td>Corning cellgro</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Surfact-Amps 세제 솔루션</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; 85114</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan-Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>Z23374</td><td></td></tr><tr><td>챔버 1.0 붕규산 커버글라스 시스템(챔버 8개)</td><td>ThermoFisher</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Glasstic slide 10 with grids</td><td>Hycor</td><td>87144</td><td></td></tr></tbody></table>

탐식의 초기 단계를 시각화

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

포유류의 몸은 병원균의 침입으로부터 자신을 방어하는 데 도움이 메커니즘의 다양한 계층이 장착되어 있습니다. 이러한 호중구, 수지상 세포, 대 식세포 등 - - 면역 시스템의 전문 식세포 감지하고 식균 작용 (1)를 통해 이러한 침입하는 병원균을 취소 할 수있는 타고난 능력을 유지합니다. 식균 작용은 세포 표면 2, 3에서 막 개편과 액틴 리모델링의 안무 이벤트를 포함한다. 식세포가 성공적으로 내면화와 식균 작용의 모든 단계가 충족 된 경우에만 외국 분자를 근절. 이러한 단계는 인식 및 세포 표면에 존재하는 패턴 인식 수용체에 의한 병원균 (PRRS)의 결합을 포함 액틴 부화 막의 돌기 (pseudopods) 내지 식세포 컵의 형성은 미립자를 둘러싸하고 phagosome의 절단은 phagolysosome 성숙이어서 그 결과병원체 3,4- 사멸. 식균 작용의 다양한 단계의 이미징 및 정량이 세포 과정의 분자 메커니즘을 해명하기위한 수단이다. 본 원고는 식균 작용의 여러 단계를 공부하는 방법을보고합니다. 우리는 시각화하고 바인딩, 식세포 컵 형성을 정량화 할 수있는 현미경 기반의 접근 방식, 그리고 식세포에 의해 입자의 국제화에 대해 설명합니다. 식세포에 타고난 수용체가 더 큰 0.5 μm의, 우리는 여기에 제시 분석은 병원성 곰팡이 칸디다 알비 칸스 및 자이 모산과의 IgG 코팅 구슬과 같은 다른 입자의 사용을 포함하는 대상 입자에 리간드가 발생할 때 식균 작용이 발생있다.

식균 작용의 다른 단계를 모니터링하는 현미경 기반 방법이 제공된다. DC2.4 세포에 의해 다양한 형광 입자의 식균 작용 동안 다른 이벤트가 표시됩니다. 여기에 설명 된 기술을 사용하여, 우리는 식세포 작용의 초기 단계에서 스핑 고리 피드의 역할을 조사 하였다. 이를 위해 Sptlc2는 스핑 고지 생합성 경로에서 제 속도 - 제한 단계를 촉매하는 효소의 유전자가 결핍 DC2.4 수지상 세포를 사용 하였다. 야생형 세포에 비해 Sptlc2는 - / - 세포 DC2.4 크게 세라마이드, 스 핑고 미엘린 및 글루코 8 포함한 스핑 고리 피드의 수준을 감소시켰다. Sptlc2 - / - DC2.4 세포뿐만 아니라, C. 알비 칸스, 모산 및 IgG의 라텍스 비드 (8)의 흡수에 결합 불량하다. 도 1에서, DC2.4 셀 내의 결합 형광 접합-모산 입자가 도시된다 (...

여기에서는 zymosan 및 IgG 코팅 비드를 포함하여 0.5μm보다 큰 곰팡이, 칸디다 알비칸스 및 미립자와 같은 병원체의 식세포작용 중 이벤트의 초기 폭포를 시각화하고 정량화하는 현미경 기반 기술에 대해 설명합니다.

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

이 기술의 전반적인 목표는 컨포칼 현미경을 사용하여 식세포작용의 여러 단계를 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 교차 병원체 상호 작용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 주로 감염 중에 병원체가 숙주 세포에 어떻게 들어가는지 이해하기 위한 것입니다.이 기술의 가장 큰 장점은 간단하고 시간에 민감한 방식으로 식균작용 중에 발생하는 이벤트의 바이러스 세포에 대한 정보를 얻을 수 있다는 것입니다. 먼저, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형광 접합 zymosan을 준비합니다. 전날, 챔버 슬라이드에서 네 번째 DC 2.4 세포에 약 5 배 10을 파종하여 실험 당시 웰이 60-70 % 융합이되도록합니다.세포가 적절한 밀도에 도달하면, 챔버 슬라이드를 섭씨 10도에서 10분 동안 놓습니다. 세포의 냉각은 세포내이입(endocytosis)을 차단하기 위해 필요하며, 세포작용(cytosis)을 토글해야 할 때도 필요합니다. 그리고 나서 동기화된 식세포작용(synagocytosis)을 갖게 됩니다.그런 다음 피펫 또는 흡입기를 사용하여 각 웰에서 매체를 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 형광 접합 zymosan을 감염 다중도 10으로 세포 배양 배지와 혼합합니다. 다음으로, 각 챔버 웰에 500마이크로리터의 배지를 추가하여 모든 셀이 덮이도록 합니다.그런 다음 챔버 슬라이드를 스핀다운하여 세포의 미립자 사이의 접촉을 늘리고 결합 과정을 동기화합니다. 원심분리 후 챔버 슬라이드를 CO2 함량이 5%인 섭씨 37도의 가습 인큐베이터로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 5분 후 인큐베이터에서 챔버 슬라이드를 제거하고 배지를 흡인합니다.그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세 번 씻습니다. 최종 세척 후 광학 현미경으로 결합되지 않은 입자의 존재 여부를 확인하고 필요한 경우 추가 세척을 수행합니다. 해석 중 배경 소음을 최소화하기 위해 웰에서 결합되지 않은 입자를 제거하는 것이 중요합니다.다음으로, PBS의 4% 파라포름알데히드 500마이크로리터를 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하여 세포를 고정합니다. 셀을 고정한 후 각 챔버에 500마이크로리터의 PBS를 첨가한 다음 용액을 부드럽게 흡인하여 세척합니다. 세탁 단계를 두 번 더 반복합니다.세 번째 세척 후 PBS에 500마이크로리터의 50밀리몰 염화암모늄을 세포에 첨가하고 10분 동안 배양하여 반응을 중지합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 실온 PBS에서 세포를 세척합니다. 다음으로, 각 웰에 500마이크로리터의 결합 완충액을 첨가하고 실온에서 30분 동안 세포를 배양하여 세포를 투과화합니다.다음 단계는 형광 접합 팔로이딘을 세포에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하여 F-actin을 염색하는 것입니다. 그런 다음 500마이크로리터의 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 마지막으로 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하고 ImageJ를 사용하여 이미지를 분석합니다.zymosan 흡수를 측정하려면 결합 분석에 표시된 대로 세포가 있는 챔버 슬라이드를 준비합니다. 냉각 및 라벨링 단계에 따라 챔버 슬라이드를 CO2 함량이 5%인 섭씨 37도의 가습 인큐베이터로 옮깁니다. 그리고 다른 시점에 대해 세포를 배양합니다.감염 후 30분, 60분, 90분 후에 세포를 고정합니다. 이러한 시점은 각각의 세포 유형과 사용되는 형광 입자에 따라 최적화해야 합니다. 그런 다음 ImageJ를 사용하여 이미지를 분석합니다.성공적인 흡수는 식세포의 세포질 내부에 있는 미립자가 완전히 내재화되는 것이 특징입니다. 시작하려면 현미경 스테이지 환경 챔버를 섭씨 37도로 가열하고 챔버를 5% CO2로 평형을 이루어 준비합니다. 이미징하기 전에 온도와 CO2가 안정화될 때까지 30-45분 동안 기다립니다.CO2와 온도 수준을 확인하는 것은 식균작용에 매우 중요하며, 실험 전에 현미경 히터를 켜서 챔버의 환경을 평형화하는 것이 중요합니다. 다음으로, 결합 분석에서 나타난 바와 같이 mCherry F-actin을 안정화하는 DC 2.4 세포가 있는 챔버 슬라이드를 준비합니다. 구덩이 및 라벨링 단계에 따라 원심분리기의 챔버 슬라이드를 예열된 현미경 스테이지로 직접 옮깁니다.마지막으로, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 라이브 이미징을 수행하여 F-actin 네트워크의 움직임과 역학을 캡처할 뿐만 아니라 살아있는 세포 내의 다양한 식세포 이벤트를 시각화합니다. 여기에 녹색으로 표시된 세포는 빨간색으로 표시된 캐나다 BFP에 감염된 야생형 DC 2.4 세포입니다. 타임랩스 이미징은 식세포작용의 초기 단계를 시각화하는 데 사용되며 여기에는 30초 간격으로 표시됩니다.별표로 표시된 위치는 액틴 리모델링이 발생하는 곳입니다. 전체 프로세스는 몇 분 만에 발생합니다. 여기에서 스핑고지질의 역할은 식세포작용의 초기 단계에서 그들의 역할에 대해 평가되었습니다.이 기술을 사용하여 스핑고지질은 칸디다 알비칸스(candida albicans)가 세포에 결합하는 데 필수적이며 전반적인 식세포작용(phagocytosis)을 감소시키는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 식세포 결합의 감소는 zymosans에 대한 DC 2.4 세포 결합에서도 나타났습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 식세포작용의 초기 단계를 연구하기 위해 라이브 이미징을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 1-2시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 면역 세포와 이 병원체 사이의 복잡한 관계를 이해하기 위해 박테리아와 기생충을 포함한 다른 병원체의 식세포작용을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 면역 세포의 식세포작용 및 거대세포작용(macropinocytosis)을 포함한 수용체 매개 세포내이입(endocytosis)을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 독립적인 대식세포 매개 적혈구(RBC) 식세포작용 이벤트를 모니터링하기 위한 분석을 보여줍니다. 마우스 면역글로불린 G(IgG)-옵소니화된 인간 적혈구를 마우스 대식세포와 함께 배양하고 컨포칼 현미경으로 관찰합니다. 적혈구는 식세포컵(phagocytic cup) 형성을 통해 대식세포에 포위되어 리소좀 분해를 목표로 합니다.

IgG-Opsonized 적혈구의 대식세포 식세포작용(Macrophage Phagocytosis)의 실시간 이미징

이 비디오는 유리 바닥 접시 표면에 부착된 IgG-opsonized 적혈구(RBC)의 대식세포 매개 식세포작용 중 식체(phagosome) 형성 및 폐쇄를 실시간으로 시각화하기 위한 고해상도 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경 기술을 보여줍니다. 대식세포는 적혈구 주위로 가성족(pseudopodia)을 확장하고 식체(phagosome) 내부를 삼켜 유리 표면에서 분리합니다.

TIRF 현미경 기반 식체 형성 및 폐쇄 시각화

우리는 라이브 세포 영상 현미경에 대한 방법을...

곰팡이 병원체 Phagocytosis의 라이브 셀 비디오 현미경

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

여기에서는 형광 측정 방법을 사용하여 부착 대식세포 세포주에 의한 형광 입자의 식세포작용을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 입자 내부화의 고처리량 정량화와 그에 따른 액틴 중합화를 용이하게 합니다.

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

우리는 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 대식세포에서 전례 없는 고해상도 phagosome formation 및 close를 3차원으로 시각화하는 실험 설정을 설명합니다. 이를 통해 phagocytic cup의 기저부, 확장된 pseudopods, phagosome scission의 정확한 위치를 모니터링할 수 있습니다.

&quot;Phagosome 폐쇄 분석은&quot;사용하여 입체적으로 Phagosome 형성을 시각화하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)

이 논문은 phagosomal의 pH 및 영역뿐만 아니라 비율 적 지표 seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, 또는 S-1을 사용하여 인간 및 마우스 호중구의 세포 내 pH를 측정하는 간단한 방법을 설명한다. 이 라이브 셀 공 초점 형광 현미경 및 이미지 분석을 사용하여 얻을 수있다.

호중구 Phagosome 이미징 및 세포질은 비례의 pH 표시기를 사용하여

여기는 마우스 주민 복 막 대 식 세포에 의해 회전 디스크 confocal 현미경 이미지 단일 phagocytic 이벤트를 사용 하 여 방법에 설명 합니다. 프로토콜은 다른 phagocytic 세포를 확장할 수 있습니다.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

Leishmania 감염에서 식균작용과 관련된 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기에서, 우리는 숙주 세포와의 리슈마니아 상호작용 동안 발생하는 초기 사건을 평가하는 방법을 설명한다.

공초점 현미경을 사용하여 리슈마니아 의 식균작용 조사

여기에 제시된 것은 pH 에 민감한 형광 분자에 공주되는 비협화효모(zymosan) 입자의 대식세포(MΦ) 식세포증의 중간엽 줄기세포(MSC) 중재조절의 동적 이미지를 정량화하고 생성하는 프로토콜이다.

대식세포식세포의 중간엽 줄기세포 조절; 수량 및 이미징

이 연구는 포유류 세포에서 Godanti Bhasma(GB) 입자의 식세포 처리를 규명하여 세포 흡수, 액포 역학, 산성화 및 분해를 특성화합니다. 이러한 발견은 근본적인 식균작용 메커니즘에 대한 이해를 증진시킬 뿐만 아니라 GB를 새로운 치료 전략을 개발하기 위한 유망한 모델 시스템으로 확립했습니다.

포유류 세포에서 Godanti Bhasma에 의해 유발된 식세포작용의 순차적 세포 이벤트 탐색

학습하세요 공초점 현미경을 이용한 탐식 초기 단계 시각화 기법으로 Candida albicans와 같은 병원체가 숙주 세포에 진입하는 메커니즘을 실시간으로 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 면역학 및 감염병 연구에 활용됩니다.

탐식의 초기 단계를 시각화

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