센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 연구의 전반적인 목표는 원심분리에 의한 연속 도금을 사용하여 말초 혈액 단핵 세포를 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는 것입니다. 원래 iPSC는 섬유아세포를 재프로그래밍하여 생성되었습니다. 오늘날에는 다양한 재프로그래밍이 사용됩니다.

그러나 혈액의 접근성 때문에 PBMC는 약물 스크리닝, 논문 모델링 및 재생 의학 개발에서 iPSC의 추가 적용을 위해 허용되지 않는 세포 공급원이 될 수 있습니다. 이 연구를 통해 원심력을 추가하여 PBMC를 사용하여 iPSC를 재프로그래밍하는 방법에 대한 프로토콜을 공유할 것입니다. 이 프로토콜은 부동 셀을 다시 프로그래밍할 때 또 다른 옵션을 제공합니다.

절차를 시연하기 위해 제 연구실의 대학원생인 Nam을 사용할 것입니다. 단핵구세포를 분리하려면 먼저 세포 준비 튜브에서 채혈을 통해 최소 10ml의 신선한 혈액을 확보합니다. 다음으로, 혈액을 50밀리리터의 새로운 원뿔형 튜브로 옮기고 멸균 PBS로 1:4의 비율로 희석합니다.

그런 다음 새로운 50ml 원추형 튜브에 10ml의 밀도 구배 매체를 추가하고 밀도 구배 매체 위에 희석된 혈액을 조심스럽게 층을 이룹니다. 그런 다음 원심분리 중단 없이 실온에서 30분 동안 750배 g으로 샘플을 원심분리합니다. 30분 후 버피 층을 새 50ml 원뿔형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

PBS 30ml를 넣고 세포를 씻습니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 515배 g으로 세포를 원심분리합니다. 그 후, PBS를 버리고 0.5ml의 혈액 세포 배지에 세포를 재현탁합니다.

그런 다음 세포를 세고 24웰 플레이트에 플레이트합니다. 증발을 방지하기 위해 주변 우물에 PBS를 첨가하십시오. 그 후, 형질도입 전에 섭씨 37도에서 5일 동안 세포를 안정화합니다.

세포를 방해하지 않고 3-4일째에 0.5ml의 신선한 혈액 세포 배지를 추가로 첨가하십시오. 이 절차에서는 혈액 세포를 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 혈구계를 사용하여 계산합니다. 다음으로, transduction을 위해 10 배에서 5 번째 세포를 3 회 준비하고 실온에서 5 분 동안 515 회 g으로 세포를 원심 분리합니다.

그 후, 흡입에 의해 상층액을 버리고 0.5 밀리리터의 혈액 세포 배지에 세포를 재현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 코팅되지 않은 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 센다이 바이러스 혼합물을 얼음에서 해동하고 부유 세포에 첨가합니다.

플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉하고 섭씨 30도에서 30분 동안 1, 150회 g으로 원심분리합니다. 원심분리 후 섭씨 37도의 5% 이산화탄소에서 밤새 세포를 배양합니다. 24웰 플레이트를 비트로넥틴으로 코팅하려면 다음 날 PBS에 비트로넥틴 용액을 희석하여 밀리리터당 5마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다.

다음으로, 비트로넥틴 1ml를 웰에 넣고 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 코팅 용액을 제거하고 세포와 바이러스를 포함하는 모든 매체를 코팅된 웰로 옮깁니다. 그런 다음 추가로 0.5ml의 신선한 혈액 세포 배지로 나머지 세포를 수집하고 세포 함유 웰에 추가합니다.

그 후, 35 °C에서 10 분 동안 150 회 g로 플레이트를 원심 분리 한 다음 하룻밤 동안 5 % 이산화탄소에서 37 °C로 셀을 유지하십시오. 두 번째 세포 전달의 경우, 앞서 설명한 대로 웰을 밀리리터당 5마이크로그램의 비트로넥틴으로 코팅합니다. 각 transduction에 대해 플레이트의 한 well을 사용하고 첫 번째 플레이트에서 새로 코팅된 vitronectin 플레이트로 세포 현탁액을 옮깁니다.

한편, 유지보수를 위해 첫 번째 플레이트의 웰에 1ml의 iPSC 배지를 첨가하고 섭씨 37도의 이산화탄소 5%를 함유한 상태로 배양한 후 새로운 iPSC 배지로 매일 배지를 교체합니다. 군체는 형질전환 후 14일에서 21일에 나타납니다. 부유 세포를 포함하는 새로 코팅된 플레이트를 섭씨 35도에서 10분 동안 1, 150배 g로 원심분리합니다.

원심분리 후 섭씨 37도의 이산화탄소 5%에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 다음날, 상등액을 제거하고 신선한 유도 만능 줄기 세포 배지로 교체하십시오. 80% 포화도에 도달할 때까지 매일 배지를 교체하여 부착된 세포를 유지합니다.

군체를 채취하기 일주일 전에 비트로넥틴으로 코팅된 100mm 접시에 10배에서 4번째 세포를 파종합니다. 다음으로, 비트로넥틴 용액 2ml를 넣어 비트로넥틴으로 코팅된 60mm 접시를 준비하고 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 현미경을 통해 관찰하여 마커 펜을 사용하여 접시 바닥의 식민지를 명확한 경계로 표시합니다.

새 플레이트에서 비트로넥틴 용액을 제거하고 10밀리몰 RHO 키나아제를 보충한 유도 만능 줄기 세포 배지 6ml를 추가합니다. 그 후, 세포에서 배양 배지를 제거하고 PBS 3 밀리리터로 세척합니다. 그런 다음 iPSC 집락 분리 용액 1ml를 넣고 실온에서 30초 동안 배양합니다.

그런 다음 플레이트에서 용액을 제거하고 실온에서 30초 더 배양합니다. 30분 후 플레이트에서 200마이크로리터의 배지를 추출하고 파이펫팅으로 대상 콜로니를 분리합니다. 그런 다음 흩어져 있는 군체를 새로운 60mm 접시로 옮깁니다.

세포가 10 계대에 도달 할 때까지 섭씨 37 도의 5 % 이산화탄소에서 세포를 배양하고 유지합니다. 재프로그래밍의 초기 단계에서 iPSC는 부착된 재프로그래밍되지 않은 분화 세포와 혼합되었습니다. 확장 전에는 iPSC와 다른 세포를 구별하는 것이 달랐습니다.

세포를 낮은 밀도로 파종함으로써 따기에 충분히 큰 군체를 얻을 수 있었습니다. 군체를 분리한 후, 세포 덩어리를 단일 세포로 해리하고 배양했습니다. 그 후 순수한 iPSC 집락이 관찰되었습니다.

순수 유도 만능 줄기 세포가 팽창한 후 세포의 품질을 테스트했습니다. 유도된 만능 줄기세포의 미분화 상태를 확인하기 위해 세포를 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase)로 염색했습니다. 분리된 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 콜로니는 모두 양성 염색을 보였습니다.

만능 마커는 면역형광 염색에 의해 확인되었습니다. 재프로그래밍된 세포는 SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4 및 가장 중요한 TRA-1-60과 같은 고도로 발현된 만능 마커의 발현을 RTPCR에 의해 확인했습니다. 원심 분리에 의한 연속 도금을 사용하여 운송 수단의 부착은 미터법 코팅 플레이트에 PBMC를 사용합니다.

거기에 부착물은 보류된 대로 존재하며, iPSC 콜로니는 정제를 위해 반복됩니다. 이 프로토콜을 사용하면 한 달 이내에 PBMC에서 iPSC를 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 형질도입된 세포의 부착에 필요한 시간을 단축하고 자체적으로 부착할 수 없는 재프로그래밍된 세포의 손실을 방지합니다.

그러나 이 절차를 시도할 때 완전히 재프로그래밍된 콜로니 형성 iPSC의 정제가 중요할 수 있습니다. 이전에는 이 프로토콜을 사용하여 PBMC와 단핵 세포를 성공적으로 재프로그래밍했습니다. 생성된 혈액 세포 유래 iPC는 다양한 연구 분야에서 광범위하게 사용될 수 있습니다.

이 프로토콜은 추가 응용 프로그램 및 연구를 위해 다른 유형의 부유 부유 세포의 재프로그래밍 프로세스를 도울 수 있습니다.