Name: 센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 배우세요 원심 분리를 이용한 혈액 단핵세포의 유도 만능 줄기 세포 재프로그래밍 방법입니다. 이 기술은 떠 있는 세포의 효율적인 부착을 촉진하여 약물 스크리닝과 재생의학 연구에 활용됩니다.

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본 연구는 미래창조과학부 연구지원(2013R1A1A1076125)으로 진행되었다.

윤리 진술 : 본 연구 프로토콜 가톨릭 대학교 (KC12TISI0861)의 기관 검토위원회에 의해 승인되었다. 혈액에서 단핵구 세포의 분리 (1) <ol><li> 단핵구 세포의 분리 (일 -5) <ol><li> 셀 준비 튜브 (CPT)에서 혈액 추첨에서 신선한 혈액의 10 ml의를 얻습니다. </li><li> 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 혈액을 전송하고 하나의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 희석 : 4 비율. 주 : 희석 높은 비율은 더 높은 순도를 위해 사용될 수있다. </li><li> 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 밀도 구배 배지 10 ㎖를 첨가하고 신중 밀도 구배 매체 위에 희석 혈액 층을 포함한다. 원심 브레이크없이, 실온 (RT)에서 30 분 동안 750 × g으로 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 버피 층 전송 튜브를 PBS 30 mL를 넣고 세포를 세척 하였다. </li><li> RT에서 5 분 동안 515 XG에 세포를 원심 분리기. &lt;/ 리&gt; <li> PBS를 폐기하고 혈액 세포 배지 0.5 ml의 세포를 재현 탁. </li><li> 세포를 카운트하고, 24 웰 플레이트의 웰 당 1 × 10 6 세포를 접시. 증발을 방지하기 위해 주변의 우물에 PBS를 추가합니다. </li><li> 전달 전에 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 5 일 동안 세포를 안정화. 세포를 방해하지 않고 일 3-4에 신선한 혈액 세포 미디어의 추가 0.5 ML을 추가합니다. </li></ol></li></ol> 센다이 바이러스 2. 형질 <ol><li> 전달 (0 일) <ol><li> 모아서 15 ml의 원추형 튜브에 혈액 세포를 전송하여 혈구를 사용하여 계산. </li><li> 전달 당 3 × 10 5 세포를 준비하고 실온에서 5 분 동안 515 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 흡인함으로써 상층 액을 제거하고 혈액 세포 배지 0.5 ml의 세포를 재현 탁. </li><li> 비 코팅 24- 웰 플레이트의 웰에 세포를 옮긴다. </li><li> 얼음 센다이 바이러스 액을 해동하고, SU에 추가spended 세포. 제조업체의 권장 사항에 따라 세포에 센다이 바이러스를 추가합니다. </li><li> 밀봉 막 접시를 밀봉하고 30 ℃에서 30 분 동안 1150 × g으로 원심 분리하여 그것을. </li><li> 원심 분리 후, 5 % CO 2 밤새 (O / N)으로 37 ℃에서 세포를 배양한다. </li></ol></li><li> 공급 매트릭스 셀 전송 (1 일) <ol><li> 다음 날, 코트 비트로 넥틴과 24 웰 플레이트. 최종 5 μg의 / ㎖ 농도에 대한 PBS의 비트로 넥틴 솔루션을 희석. 24- 웰 플레이트의 웰에 비트로 넥틴 1 ㎖를 첨가하고, 적어도 1 시간 동안 RT에서이를 부화. 사용 전에, 코팅 용액을 제거한다. 코팅 된 플레이트 3 일 동안 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> 잘 코팅에 세포와 바이러스를 포함하는 모든 미디어를 전송합니다. </li><li> 신선한 혈액 세포 미디어의 추가 0.5 ㎖의 나머지 세포를 수집하고 세포를 함유 웰에 추가한다. </li><li> 35 ° C에서 10 분 동안 1,150 XG에서 접시를 원심 분리기. </li><li> 센트 후rifugation, 상층 액을 제거 IPSC 미디어 1 ㎖를 추가하고, 5 % CO 2 O / N 37 ° C에서 세포를 유지한다. </li></ol></li><li> 제 2 셀 트랜스퍼 (주 2) <ol><li> 코팅 단계 2.2.1에 기술 된 바와 같이 5 μg의 / ㎖ 비트로 넥틴과 새로운 24- 웰 플레이트의 웰. 각 형질에 대한 플레이트 잘 하나를 사용합니다. </li><li> 새롭게 코팅 된 비트로 넥틴 플레이트에 상기 제 1 플레이트로부터 세포 현탁액을 전송. 주의 : 필요하지 않으면, 현탁 세포는 폐기 될 수있다. 단계 2.3에서 설명한 절차는 현탁 세포를 2-3 회 반복 할 수있다. 단계가 반복 될 경우, 세포를 수확. </li><li> 한편, 5 % CO 2 O / N에서 37 ℃를 유지 관리를 위해, 제 1 플레이트의 웰에 IPSC 배지 1 mL를 넣어 배양한다. </li><li> 37 ° C에 부착 된 세포를 유지하고 5 % CO 2와 신선한 IPSC 미디어와 함께 매일 미디어 변경을 수행합니다. 식민지는 전달 후 일에 14-21 나타납니다. </li><li> CentrifugE 1150 XG 10 분간 35 ℃에서 현탁 세포를 포함하는 새로 도장 판. </li><li> 원심 분리 후, CO 2 O / N이 5 %에서 37 ℃에서 세포를 배양한다. </li><li> 다음날, 상층 액을 제거하고 신선한 IPSC의 용지로 교체합니다. 주의 : 단계 2.3에서 설명한 절차는 현탁 세포를 2-3 회 반복 할 수있다. 단계가 반복 될 경우, 상층 액에 세포를 수확 단계 2.3를 반복합니다. </li><li> 80 % 포화 상태에 도달 할 때까지 매일 미디어 변화에 부착 된 세포를 유지한다. </li></ol></li></ol> 3. 재 프로그래밍 셀 유지 보수 <ol><li> 24 웰 플레이트 배양 후 조기 유지 보수 <ol><li> 세포가 합류 일단 7-10일 전달 후하는 비트로 넥틴 코팅, 60-mm 요리를 준비합니다. 최종 5 μg의 / ㎖ 농도에 대한 PBS에서 비트로 넥틴 솔루션을 희석. 접시에 비트로 넥틴의 1 ML을 추가하고 적어도 1 시간 동안 실온에서 그것을 품어. </li><li> 씻어PBS로 세포와 세포를 분리 PBS / 1 mM의 EDTA 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 2 분 동안 CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션을 5 %. </li><li> 세포를 수확하고 2 분 동안 250 XG와 RT에서 그들을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 신선한 IPSC 미디어의 3 ml의 세포를 재현 탁. </li><li> 새로 코팅 된 60 mm 접시에 모든 재현 탁 세포를 플레이트. </li><li> 세포가 80 % 컨 플루 언트 될 때까지 5 % CO 2에서 37 ° C에서 그들 세포에 10 mM의 Rho 키나아제 억제제를 추가하고 유지한다. </li></ol></li><li> 식민지 모양에 대한 분할 (서브 클로닝 준비) <ol><li> 단계 3.1.2에 설명 된대로 비트로 넥틴 코팅, 100-mm 요리를 준비합니다. </li><li> PBS로 세포를 세척하고 세포를 분리 PBS / 1 mM의 EDTA 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 2 분 동안 CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션을 5 %. </li><li> 세포를 수확하고 2 분 동안 250 XG와 RT에서 그들을 원심 분리기. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 세어 접시 당 1 × 104 세포를 준비합니다.</li><li> 250 XG에서 세포를 원심 분리기 및 RT 2 분. </li><li> IPSC 배지 6 ㎖, 재현 탁에 1 × 104 세포가 도포 100 mm 접시에 입혀, 미디어에 10mM의 Rho 키나아제 억제제를 추가한다. </li><li> 큰 식민지가 나타날 때까지 일주일 동안 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 세포를 품어. 참고 : 유지 및 서브 클로닝을 위해 식민지를 확장합니다. 서브 클로닝은 일반적으로 5 구절 아래에 이루어집니다. </li></ol></li><li> 식민지 용액을 분리 IPSC 식민지를 사용하여 따기 <ol><li> 식민지 따기, 씨앗 단계 3.2.7에서 언급 한 바와 같이 비트로 넥틴 코팅, 100 mm 접시에 1 × 104 세포, 전에 일주일. </li><li> 비트로 넥틴 용액 2 ㎖를 추가하고 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양하여 비트로 넥틴 코팅, 60-mm 요리를 준비합니다. </li><li> 현미경 (40X 또는 100X 배율)을 통해 관찰함으로써, 마커 펜을 사용하여 명확한 경계와 식민지를 표시합니다. 단계 3.3.2에서 만든 새로운 판에서 비트로 넥틴 솔루션을 제거하고 6 ml에 추가IPSC의 매체는 10 mM의 Rho 키나아제 보충. </li><li> 세포에서 배양 배지를 제거하고 PBS 3 ㎖로 씻는다. </li><li> IPSC 식민지 분리 액 1ml를 추가하고 RT에서 30 초 동안 그들을 품어. </li><li> 플레이트에서 솔루션을 제거하고 추가로 30 초 동안 RT에서 그것을 품어. </li><li> P200 피펫을 사용하여 판에서 미디어 200 μl를 그리는 피펫 팅하여 대상 식민지를 분리합니다. 새로운 100 mm 접시에 흩어져있는 식민지를 전송합니다. </li><li> 부화 및 5 % CO 2에서 37 ℃에서 세포를 유지한다. 참고 : 그들이 10 특성이 적어도 10 구절 이후에 이루어졌다 통로에 도착할 때까지 순수한 IPSC 식민지를 획득 한 후, 세포를 유지 하였다. 항체 희석 및 프라이머 정보는 표 1 및 표 2에 나타낸다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+engineering+of+human+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application.</a> Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
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<li>Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+and+personalized+medicine%3A+current+progress+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives.</a> Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).</li>
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<li>Ohmine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+GMP-grade+hematopoietic+progenitor+cells+and+mononuclear+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).</li>
<li>Mae, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nat Commun. 4, 1367(2013).</li>
</ol>

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배아 줄기 세포 (는 ESC)는 여러 단점을 보였다 때문에, 다른 도구의 필요성이 요구되었다. 따라서 야마나카에 의해 유도 된 다 능성 줄기 세포의 발달 (iPSCs)은 국제 주목 받게되었다. 야마나카는 만능 성인이 체세포에 네 개의 유전자를 추가로 유도 될 수 있다는 것을 발견한지 거의 10이었다. iPSCs 성숙한 체세포에서 &quot;유도&quot;된다 때문에, 한번는 ESC 관련된 문제이었던 윤리적 문제를 회피 할 수있다. 는 ESC 달리 iPSCs 개개인으로부터 생성 될 수있다. 따라서, 이들은 개인 의료 연구 및 약물 스크리닝, 질병 모델링 또는 다른 재생 의학 연구에 사용될 수있다. 첫 번째 인간의 IPSC 성공적으로이 셀 유형을 재 프로그래밍 2007 년 다양한 그룹에서 피부 섬유 아세포에서 생성되었지만, 침습적 수술이 일차 전지를 얻기 위해 필요했다. 따라서, 아이디어 아니었다다양한 질병 iPSCs를 생성하거나 재생 의학을 설계 리터 소스. 대안 쉽게 얻어진 ...

줄기 세포는 최근 몇 년간 한 임상 치료에서 가장 매력적인 물질 중 하나이었다. 줄기 세포의 분화능 매력적인 특성과 자기 갱신 할 수있는 기능이다. 1981 년, 제 배아 줄기 세포 (는 ESC)는 마우스 배아 (2)로부터 분리 하였다. 이 기술은 인간 배아에 적용된 때, 그것은 여러 윤리적 문제에 직면했다. 박사 야마나카와 그의 팀이 마우스 체세포에서 첫 번째 만능 세포를 재 프로그램 할 때 2006 년, 줄기 세포 분야는 가능성을 회복하고 관심은 3 재연했다. 여러 정의 요소를 제공함으로써, 다 능성 줄기 세포가 성공적으로 성숙한 체세포에서 &quot;유도&quot;이었고, 따라서 지명되었다 &quot;(iPSCs)를 유도 만능 줄기 세포.&quot; 2007 년,이 기술은는 ESC의 정확한 특성을 가진 세포를 산출, 인간 세포 4에 적용되었지만 윤리적 논쟁 없음. 이론적으로 유도 만능 줄기CS는 개인 또는 환자로부터 얻은 세포 유형에서 생성 될 수있다. 환자 별 iPSCs는 질병 표현형 및 각 개별 환자의 후생 유전 학적 조건을 시뮬레이션 할 수있는 잠재적 인 도구로 상승하고있다. 유전자 편집 또는 병원성 상태를 반전 할 수있는 다른 방법을 사용하여 환자 별 iPSCs 또한 개인화 된 약 5에서 사용될 수있다. 그들은 6 자동 이식을 더욱 가능하게, 도너와 같은 면역 ID를 가지고 있기 때문에 또한 iPSCs 덜 면역 거부 반응과 연관된다. 따라서, iPSCs 질병 모델링, 약물 검사, 및 재생 치료에서 가장 유망한 플랫폼이되었다. 이러한 혜택, 지속적으로 개발 중에있는 작은 셀 소스에서 시간의 최소 금액에서 순수하고 높은 수율을 줄 수있는 개선 된 프로토콜을 감안할 때. 미래의 애플리케이션에 가장 효율적인 프로토콜을 찾는 하나의 중요한 고려 사항은 일차 전지 유형이다. 초기 IPSC 생성 프로토 대부분의COLS은 원래 IPSC 라인은 피부 섬유 아세포 (4)로부터 유도 된 이후 부착 세포에 최적화되어 있습니다. 그러나, 이들 세포의 분리 및 제조는 노동 집약적이다. 또한, 피부 섬유 아세포의 분리는 광범위한 응용 프로그램의 주요 단점이 될 수 침습 수술 절차가 포함되어 있습니다. 따라서, iPSCs의 추가 사용, 편리한 수집과 셀 소스가 필요합니다. 그것은 오히려 최소 침습 절차 7-9 통해 획득하기 때문에 혈액 이상적인 셀 소스로서 간주된다. 본 연구는 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에서 hiPSCs 발생 프로토콜에 대한 간단한 수정을 개발 하였다. 예컨대 CD34 + 세포와 같은 특정 세포 유형의 어려운 팽창 과정없이 전혈 세포 또는 PBMC를 직렬 야마나카 인자 함유 센다이 바이러스 형질 도입 한 후 원심 분리하여 매트릭스 - 코팅 된 플레이트 상에 플레이 팅 하였다. 이 방법은 요구되는 시간을 단축형질 도입 부유 세포의 부착과 자신에 부착 할 수 없었다 재 프로그래밍 셀의 손실을 감소시켰다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>100 mm 접시</td><td>TPP&nbsp;</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50ml 코니컬 튜브</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15ml 코니컬 튜브</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10ml 일회용 피펫</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5ml 일회용 피펫</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>TPP</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">PBMC Isolation Materials</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td></td><td>StemSpan STEMCELL Technologies</td><td>9805</td><td>혈액 세포 매체</td></tr><tr><td>CC110</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>8697</td><td>혈액 세포 배지 보충제 (100x)</td></tr><tr> <td colspan = "4 ">< 강력>iPSC 생성 및 배양 재료 </td></tr><tr><td>CytoTune-iPSC 센다이 재 프로그래밍 키트</td><td>Life Technologies</td><td>A16518</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>매체 STEMCELL Technologies</td><td>5940</td><td>iPSC 매체</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express (TrypLE)</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>12604-039</td><td>Colony detaching solution</td></tr><tr><td colspan="4">Quality Control Materials</td></tr><tr><td>18 mm Cover Glass</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알디히드</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민&nbsp;</td><td>벡터랩</td><td>SP-5050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SSEA4 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2 항체</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4 항체</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티-마우스 IgG (H+L) 항체</td><td>분자 프로브</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 염소 안티-토끼 IgG (H+L) 항체</td><td>분자 프로브</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>분자 프로브</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold antifade reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 유리, 코팅&nbsp;</td><td>현일 Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마 알드리치</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>이소프리필알코올</td><td>밀리포어</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>덕산</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA 중합효소</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10X TBE Buffer&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>로딩 스타</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1kb (+) DNA 사다리 마커</td><td>효소</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 인산가수분해효소</td><td>Millipore</td><td>SCR004</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>린스 버퍼</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520.1000</td><td>린스 버퍼</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td>린스 버퍼</td></tr><tr><td>염산</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td>린스 버퍼</td></tr></tbody></table>

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 최근의 발전은 성숙한 체세포는 미분화, 만능 상태로 돌아갈 수 있음을 증명했다. 초기 실험은 일반적으로 피부 섬유 아세포로 행해졌 등 각질 세포, 소변 세포, 섬유 아세포, : 지금, 프로그래밍 다양한 성인 체세포의 종류 이루어집니다. 그러나 이는 환자의 섬유 아세포를 수득 침습 수술이 필요했다. 따라서, 혈액 및 소변 세포와 같은 세포 현탁액이 때문에 일차 세포를 얻는 편리함 프로그래밍 이상적으로 간주 하였다. 여기서, 우리는 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에서 IPSC 생성하는 효율적인 프로토콜을보고한다. 새로운 매트릭스 도장 판하여 원심 직렬로 형질 도입 된 PBMC를 도금함으로써,이 프로토콜은 쉽게 IPSC 콜로니를 제공 할 수있다. 이 방법은 또한 제대혈 단핵구 (CBMCs)에 적용 가능하다. 본 연구는 간단하고 효율적인 PROT를 제시PBMC를하고 CBMCs의 재 프로그래밍에 대한 ocol.

이 프로토콜은 혈액에서 분리 된 PBMC를 재 프로그램 할 수있는 간단한 방법을 제시한다. 직렬 원심 도금의 조합을 사용 iPSCs 성공적으로 생성되었다. 이 방법은 iPSCs 단리 또는 특정 세포 유형을 확장하지 않고 전체 혈액 세포의 적은 양으로 생성 될 수있다. 우리는 성공적으로 작은 세포 배양 접시 만 1 × 104 세포에서 iPSCs를 생성합니다. 프로그래밍 전에, 혈액 세포를 밀도 구배 매체를 사용하여 분리 하였다. 혈액 세포는 오일 분리 한 후 형질 도입 하였다. 도 1a는 현탁 세포 리 프로그래밍 방법의 방식을 도시한다. 분리 후, PBMC를 센다이 바이러스가 비 코팅 웰 야마나카 인자를 함유하는 형질 도입 하였다. 다음날, 세포 현탁액을 원심 분리를 이용하여 비트로 넥틴 코팅 된 플레이트 상에 ...

우리는 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제안합니다. 원심분리를 통해 형질도입된 혈액 세포를 매트릭스 코팅된 플레이트에 도금함으로써 부유 세포에서 iPSC를 성공적으로 유도할 수 있습니다. 이 기술은 PBMC 및 CBMC와 같은 셀에 대한 간단하고 효과적인 재프로그래밍 프로토콜을 제안합니다.

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

본 연구의 전반적인 목표는 원심분리를 이용한 연속 도말법을 사용하여 말초혈액 단핵구를 유도만능줄기세포로 리프로그래밍하는 것입니다. 원래 iPSC는 섬유아세포를 리프로그래밍하여 생성되었습니다. 오늘날에는 리프로그래밍을 위해 다양한 세포들이 사용되고 있습니다.하지만 혈액의 접근성 덕분에, PBMC는 약물 스크리닝, 질병 모델링 및 재생 의학 개발과 같은 iPSC의 추가 응용을 위한 유용한 세포 공급원이 될 수 있습니다. 본 연구를 통해 원심력을 이용하여 PBMC를 iPSC로 리프로그래밍하는 프로토콜을 공유하고자 합니다. 이 프로토콜은 부유 세포를 리프로그래밍할 때 또 다른 선택지를 제공할 것입니다.절차를 시연하기 위해 저희 연구실의 대학원생인 Nam 씨가 함께하겠습니다. 단핵구를 분리하려면, 먼저 세포 준비 튜브를 이용한 채혈을 통해 10 mL 이상의 신선한 혈액을 확보합니다. 그다음, 혈액을 새로운 50 mL 원추형 튜브로 옮기고 멸균 PBS와 1:4 비율로 희석합니다.그 후, 새로운 50mL 원추형 튜브에 밀도 구배 매질 10mL를 넣고, 희석된 혈액을 밀도 구배 매질 위에 조심스럽게 층을 이루도록 첨가합니다. 그다음, 원심분리 중지 단계 없이 상온에서 750×g로 30분 동안 샘플을 원심분리합니다. 30분 후, 버피 층(buffy layer)을 새로운 50mL 원추형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.PBS 30 milliliters를 추가하여 세포를 세척합니다. 그런 다음, 실온에서 515 ×g로 5분 동안 세포를 원심 분리합니다. 이후 PBS를 제거하고, 0.5 milliliters의 혈구 배지에 세포를 재현탁합니다.그 후, 세포 수를 측정하여 24-well 플레이트에 분주합니다. 증발을 방지하기 위해 주변 웰에 PBS를 추가합니다. 그 다음, 형질전환 전 37 °C에서 5일 동안 세포를 안정화합니다.세포가 흐트러지지 않게 주의하며 3일에서 4일째에 신선한 혈액 세포 배지를 0.5 milliliters 추가합니다. 이 과정에서 혈액 세포를 15-milliliter 원뿔형 튜브로 옮긴 후, 혈구계수기로 세포 수를 측정합니다. 그다음, 형질전환을 위해 3 × 10⁵ 개의 세포를 준비하고, 상온에서 515 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.그 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 세포를 0.5 milliliters의 혈액 세포 배지에 재부유합니다. 그다음, 세포를 코팅되지 않은 24-well plate의 웰로 옮깁니다. Sendai 바이러스 혼합물을 얼음 위에서 해동한 후, 부유된 세포에 첨가합니다.플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉하고, 30 °C에서 1,150 ×g로 30분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 24-웰 플레이트에 vitronectin을 코팅하기 위해 vitronectin 용액을 PBS로 희석하여 최종 농도를 5 µg/mL로 맞춥니다.다음으로, 웰에 vitronectin 1 mL를 넣고 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 코팅 용액을 제거하고 세포와 바이러스가 포함된 모든 배지를 코팅된 웰로 옮깁니다. 그런 다음, 신선한 혈구 배지 0.5 mL를 추가로 사용하여 남은 세포를 수집하여 세포가 들어 있는 웰에 넣습니다.그 후, 플레이트를 35 °C에서 1,150 ×g로 10분 동안 원심분리하고, 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 두 번째 세포 이식을 위해, 앞서 설명한 대로 웰에 5 µg/mL vitronectin을 코팅합니다. 각 형질전환(transduction)당 플레이트의 웰 하나를 사용하며, 첫 번째 플레이트의 세포 현탁액을 새로 코팅된 vitronectin 플레이트로 옮깁니다.그동안 유지 관리를 위해 첫 번째 플레이트의 웰에 iPSC 배지 1 mL를 첨가하고, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양하며 매일 신선한 iPSC 배지로 교체합니다. 형질전환 후 14일에서 21일 사이에 콜로니가 나타납니다. 부유 세포가 포함된 새로 코팅된 플레이트를 35 °C에서 1,150 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 상층액을 제거하고 신선한 유도만능줄기세포 배지로 교체합니다. 세포가 80% 밀도(confluency)에 도달할 때까지 매일 배지를 교체하며 부착 세포를 유지합니다.콜로니 피킹 일주일 전, 비트로넥틴이 코팅된 100mm 디시에 1×10⁴ 개의 세포를 파종합니다. 그다음, 비트로넥틴 용액 2mL를 첨가하여 비트로넥틴이 코팅된 60mm 디시를 준비하고, 이를 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 현미경으로 관찰하며 경계가 뚜렷한 콜로니를 마커 펜을 사용하여 플레이트 바닥에 표시합니다.새 플레이트에서 비트로넥틴(vitronectin) 용액을 제거하고, 10 mM RHO kinase가 첨가된 유도만능줄기세포 배지 6 mL를 넣습니다. 이어서 세포에서 배양액을 제거하고 3 mL의 PBS로 세척합니다. 그 다음 iPSC 콜로니 분리 용액 1 mL를 넣고 상온에서 30초 동안 배양합니다.그 후, 플레이트에서 용액을 제거하고 상온에서 30초 동안 추가로 배양합니다. 30분 뒤, 플레이트에서 배지 200 µL를 취하고, 피펫팅을 통해 표적 콜로니를 분리합니다. 그런 다음, 분리된 콜로니를 새로운 60 mm 디시로 옮깁니다.세포를 37°C, 5% CO2 조건에서 계代수 10(passage ten)에 도달할 때까지 배양 및 유지하십시오. 리프로그래밍 초기 단계에서 iPSC는 부착된 비리프로그래밍 분화 세포와 혼합되어 있었습니다. 증식 전에는 iPSC와 다른 세포들을 서로 구별할 수 있었습니다.세포를 낮은 밀도로 파종하여, 피킹이 가능할 만큼 충분한 크기의 콜로니를 얻었습니다. 콜로니를 분리한 후, 세포 덩어리를 단일 세포로 해리하여 배양했습니다. 그 결과, 순수한 iPSC 콜로니가 관찰되었습니다.순수 유도만능줄기세포를 확장한 후, 세포의 품질을 테스트하였습니다. 유도만능줄기세포의 미분화 상태를 확인하기 위해 세포를 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase)로 염색하였습니다. 분리된 유도만능줄기세포에서 유래된 모든 콜로니가 양성 염색 반응을 보였습니다.면역형광 염색을 통해 다능성 마커를 확인하였습니다. 리프로그래밍된 세포는 SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4, 그리고 가장 중요한 TRA-1-60과 같은 다능성 마커를 높게 발현하였으며, RTPCR을 통해 다능성 마커의 발현을 확인하였습니다. 원심분리를 이용한 연속 플레이팅을 사용하여, 전이용 PBMC를 매트릭스가 코팅된 플레이트에 부착시켰습니다.첨부된 내용과 같이 iPSC 콜로니를 반복적으로 회수하여 정제합니다. 이 프로토콜을 사용하면 PBMC로부터 한 달 이내에 iPSC를 생성할 수 있습니다. 본 프로토콜은 형질전환된 세포의 부착에 소요되는 시간을 단축하고, 스스로 부착하지 못해 소실될 수 있는 리프로그래밍된 세포의 손실을 방지합니다.하지만 이 절차를 시도할 때, 완전히 리프로그래밍된 콜로니 형성 iPSC의 정제 과정이 매우 중요할 수 있습니다. 이전에 우리는 이 프로토콜을 사용하여 PBMC와 단핵구를 성공적으로 리프로그래밍했습니다. 이렇게 생성된 혈액 세포 유래 iPC는 다양한 연구 분야에서 폭넓게 활용될 수 있습니다.이 프로토콜은 향후 응용 및 연구를 위해 다른 유형의 부유 현탁 세포의 리프로그래밍 과정에 도움이 될 수 있습니다.

induced-pluripotent-stem-cell-generation-from-blood-cells-using

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 비디오는 센다이 바이러스를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMNC)를 유도 신경 줄기 세포(iNSC)로 재프로그래밍하는 방법을 보여줍니다. 센다이 바이러스는 세포를 재프로그래밍하기 위한 효율적이고 안전한 수단을 제공하는 비통합형 바이러스입니다.

말초혈액 단핵세포(PBMNC)에서 유도 신경 줄기세포(iNSC) 생성: PBMNC를 iNSC로 재프로그래밍하는 센다이 바이러스 기반 절차

여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

여기에서는 에피솜 기반 재프로그래밍 전략과 히스톤 탈아세틸화효소 억제제를 사용하여 말초 혈액에서 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

에피 솜과 HDAC 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성

직접 방법 말초 혈 세포로부터 농축 조혈 전구 세포로부터 인간 신경 줄기 세포를 유도하기 위해 개발되었다.

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 전사 인자의 강제 발현을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 혈구 내피 및 다중전위 조혈 전구 세포의 효율적인 유도를 설명합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

이 프로토콜은 재프로그래밍 인자를 포함하는 마트리겔 및 센다이 바이러스 벡터의 조합을 사용하여 공급자가 없는 조건에서 인간 말초 T 세포에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하는 방법을 설명합니다.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

이 프로토콜의 목표는 흑색종 종양 침투 림프구를 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는 프로토콜을 보여주는 것입니다.

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

배우세요 원심 분리를 이용한 혈액 단핵세포의 유도 만능 줄기 세포 재프로그래밍 방법입니다. 이 기술은 떠 있는 세포의 효율적인 부착을 촉진하여 약물 스크리닝과 재생의학 연구에 활용됩니다.

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

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