Name: 세균성 접착 및 혈 청 저항에 Vitronectin의 역할을 공부에 대 한 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 학습하세요 세균 외막 단백질과 Vitronectin의 상호작용을 흐름 세포측정법으로 분석하는 방법을. 이 기술은 병원체가 인간 단백질을 이용해 감염을 유발하는 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 작품 안 나 재단 에드윈 버거, Lars Hierta, O.E. 및 Edla 요한슨 재단, 스웨덴 의학 연구 위원회에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (부여 번호 K2015-57-03163-43-4, www.vr.se), 대학에서 암 재단 말 뫼, Physiographical 사회 (Forssman의 기초), 및 스 코 네 카운티 위원회의 연구 및 개발 재단에 병원.

1. 세균성 표면 단백질 Ligand로 Vn의 분석
<ol><li>
Vn-바인딩 cytometry 사용 하 여 세균성 표면에서의 검출 참고: cytometry, 우리 사용 측면 분산형 및 앞으로 분산형 게이트 긍정적인 이벤트를. Vn와 상호 작용을 검사, Hif 임상 격리 (n = 10)7 대장균 BL21 함께 선정 됐다 (DE3) 부정적인 컨트롤 (그림 1A).<ol>
<li>문화 Hif 임상 10 µ g/mL 나드와 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 hemin 보충 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 매체에서 분리 합니다. Luria Bertani 매체를 사용 하 여 대장균14문화. 중간 로그 단계에서 Hif를 수확 (OD600 = 0.3)15, resuspend 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), pH 7.2, 1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (차단 버퍼;를 포함 하는 박테리아와 PBS-BSA). 10 서 스 펜 션 조정9 CFU/mL.</li>
		<li>5 x 106 CFU 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브 (12 x 75 m m2)에 포함 된 aliquots를 전송 하 고 블로킹 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 박테리아, 펠 렛을 5 분 동안 실내 온도 (RT)16 에서 3500 × g 에서 정지를 원심 다음 신중 하 게는 상쾌한은 펠 렛을 방해 하지 않고 제거 하려면 발음.</li>
		<li>블로킹 버퍼를 포함 하는 250의 50 μ와 세균 펠 릿 resuspend nM Vn 동요 없이 RT에 1 시간에 대 한 샘플을 품 어 고. 부 화, 후 5 분, 3500 x g 에서 원심 분리 하 여 박테리아를 작은 다음 PBS와 비슷한 원심 분리 단계를 사용 하 여 시간 3 펠 릿을 세척 합니다.</li>
		<li>세균성 펠 릿 기본 양 반 인간 Vn polyclonal 항 체 (Pab)의 50 μ PBS BSA에 1: 100 희석에 추가 합니다. RT에 1 시간에 대 한 정지를 품 어 다음 세 번 (단계 1.1.3에서에서와 같이) 언바운드 항 체를 제거 하는 PBS 가진 박테리아를 씻어.</li>
		<li>다음, 추가 PBS BSA 포함 fluorescein isothiocyanate (FITC) 50 μ-당나귀 안티 양 Pab (1: 100 희석)를 활용 하 고 어둠 속에서 1 시간에 대 한 RT에서 품 어.</li>
		<li>버퍼만 및 Pab Vn 없이 차단 된 박테리아를 배양 하 여 빈 컨트롤을 준비 합니다.</li>
		<li>박테리아 차단 버퍼의 1 mL로 세 번 세척 하 고 1.1.2 섹션에 설명 된 대로 원심 분리, 여 현 탁 액을 펠 렛. 마지막으로, resuspend와 PBS의 300 µ L 세균성 펠 릿 및 흐름 cytometry7에서 분석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
재조합 PH 및 Vn 사이 상호 작용의 ELISA 분석 참고: 컨트롤 일반적인 바인딩 제외를 포함 해야 합니다. 인간 요인 H (FH) 또는 C4b 묶는 단백질 (C4BP)는 각각 양수와 음수 컨트롤로 사용 됩니다.<ol>
<li>각 50 별도로 인간의 단백질 (Vn, FH, 및 C4BP)의 희석 Tris HCl, pH 9.0 (코팅 버퍼)에 nM. Polysorp 결정 플레이트의 각 음에 단백질 해결책의 100 µ L를 분배. 뚜껑 접시 닫고 결정 플레이트 웰 스에 4 ° C에서 하룻밤 (16h) 촉진 단백질의 동원 정지를 저장 합니다.</li>
		<li>싱크대 위에 거꾸로 기울이기로 결정 접시에서 솔루션을 삭제 하 고 세 번와 300 µ L의 PBS/웰 스를 씻어. 1 h 2.5% (w/v) BSA (PBS-BSA)를 포함 하는 PBS와 RT에 대 한 코팅된 우물을 차단 합니다.</li>
		<li>차단 솔루션을 제거한 후 씻어 0.05% (v/v) 트윈 20 (PBST) 잘 당 포함 된 PBS의 300 µ L로 세 번 웰 스. 각 샘플에 산도 그 태그 잘 하 고 실시간에서 1 시간에 대 한 품 어 50 nM 재조합의 100 µ L를 추가 컨트롤 스에서 PBS BSA의만 100 µ L를 추가 합니다. 참고: 인코딩 Hif에서 PH lph 유전자 PCR에 의해 증폭 되었고 표현한 단백질의 C-말단에 6 × 그 태그를 추가 하는 pET26b 식 벡터에 복제. 재조합 벡터 표현에 대 한 대장균 BL21(DE3)로 변모 했다. Ni NTA 수 지는 재조합 단백질15정화 사용 되었다.</li>
		<li>단백질 해결책을 무시 하 고 우물 잘 당 PBST의 300 µ L로 세 번 세척 하 여 바인딩되지 않은 단백질을 제거 합니다. PBS-BSA 포함 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)의 100 µ L를 추가-반 그의 Pab (1시 10분, 000 희석)를 활용 하 고 실시간에 1 시간에 대 한 품 어</li>
		<li>5% 아세톤 및 45% 메탄올 솔루션에서 tetramethylbenzidine을 용 해 하 여 20 m m 솔루션을 준비 합니다. 솔루션 B를 준비 하려면 19.2 g H2O의 1000 mL에 구 연산 분해 하 다음 코를 추가 하 여 4.25에 pH를 조정 30% H2O2의 230 µ L를 추가 합니다. 실시간에서 어둠 속에서 두 솔루션을 저장 그냥 사용 하기 전에 솔루션 ELISA 검출 시 약을 준비 하는 A의 9.5 mL 500 µ L 솔루션 B의 혼합.</li>
		<li>세 번 잘 당 PBST의 300 µ L로 우물을 세척 하 고 100 µ L ELISA 검출 시 약의 각 음을 추가 하 여 항 원-항 체 복합물을 검출.</li>
		<li>그래서 1 M H2의 50 µ L를 추가 반응을 중지 하4/well. 450에 우물의 광학 밀도 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
재조합 PH 및 씨를 사용 하 여 Vn의 상호 작용 활동의 연구
	<ol>
<li>제조업체의 지침11에 따라 연결 방법, 아민을 사용 하 여 아민 반응 센서에 인간의 Vn을 무력화.</li>
		<li>PBS를 사용 하 여 직렬 4 µ m 0에서 ligand (재조합 PH)을 희석 하 고 96 잘 블랙, 플랫 바닥 결정 플레이트에 결과 솔루션을 전송. 17씨 악기 사용 하 여 30 ° C에서 실험을 실행 합니다.</li>
		<li>BLI 데이터 분석 소프트웨어에서 데이터 폴더를 로드 합니다. '센서 선택' 옵션을 선택 합니다. 그럼, 선택 ' 잘 ' (PBS의 Vn 코팅 센서)에 대 한 참조 빼기.</li>
		<li>'기준선 y 축 정렬' 고 '보정 interstep 및 협회에 맞춤'을 선택 합니다. 눌러서 '프로세스 데이터' 분석 탭에서 자동으로 열립니다.</li>
		<li>분석 탭에서 커브 피팅 아래 '협회와 분리' 옵션을 선택 합니다. 모델 선택 ' 1:1 바인딩 및 글로벌 피팅 '. ' 곡선 ' 하 고 피팅 데이터17내보내기를 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세균성 부착에서 Vn의 역할의 특성
<ol><li>
Vn 코팅 유리 표면에 세균성 부착의 연구
	<ol>
<li>Vn에 PBS와 피펫으로 10 µ L 유리 현미경에이 솔루션의 한 방울으로 슬라이드의 2 µ g/mL 솔루션을 준비 합니다. 부정적인 통제로 인간 혈 청 알 부 민 (HSA)와 슬라이드 실시간 코트에서 30 분 동안 슬라이드에 건조 드롭을 수 있습니다.</li>
		<li>단백질 코팅 유리 슬라이드 세 번 초과 uncoated 단백질을 제거 하는 PBS를 포함 하는 비 커에 2 초 동안 슬라이드를 담거 서 세척. 메 마른 플라스틱 페 트리 접시에 20 mL 신선한 Hif 문화 (1.1.1 단계에서 설명)를 추가 하 고 잠수함 Vn-문화 매체에서 HSA 코팅 유리 슬라이드 /. 20 rpm에서 떨고와 1 시간 동안 37 ° C에 요리를 품 어. 참고: Hif M10 및 Hif M10Δlph 성장 했다 초콜릿 한 천 배지 또는 BHI 액체 매체에서. Lph 돌연변이 대 한 매체는 10 µ g/mL 대15로 보충 되었다.</li>
		<li>부 화, 후 PBS로 채워진 비 커에 세 번 슬라이드를 잠수 하 여 바인딩되지 않은 모든 박테리아를 제거 합니다. 설명 된 대로 그램 얼룩에 의해 박테리아를 시각화 합니다.<ol>
<li>그것을 기울이기 고 휴지에 가장자리를 감동 하 여 각 슬라이드에서 초과 PBS를 제거 합니다. 실시간, 3-5 분에 대 한 슬라이드를 건조 하 고 불꽃을 통해 각 슬라이드 세 번 전달 하 여 준수 박테리아를 고치십시오.</li>
			<li>얼룩 쟁반에 두 손가락으로 가장자리에서 슬라이드를 누른 다음 3-4 방울 (200-300 µ L) 2.3% 크리스탈 바이올렛 솔루션을 추가. 대기 60 s, 다음 슬라이드 탭의 부드러운 스트림 아래 물 3-4 s에 대 한 세척.</li>
			<li>슬라이드에 0.33% 요오드 솔루션의 3-4 방울을 추가 합니다. 1 분을 기다려 다음 수돗물의 부드러운 스트림 아래 슬라이드를 씻어. 조심 스럽게 압 지에 의해 슬라이드 건조.</li>
			<li>75%가 소 프로필 알코올 및 25% 아세톤 슬라이드에 포함 된 탈색 솔루션의 3-4 방울을 추가 합니다. 5-10 s 후 수돗물의 부드러운 스트림 아래 슬라이드를 씻어.</li>
			<li>기본 carbolfuchsin 솔루션의 3-4 방울 (200-300 µ L)를 추가 합니다. 1 분을 기다려 다음 수돗물의 부드러운 스트림 아래 슬라이드를 씻어. 압 지를 사용 하 여 슬라이드를 건조.</li>
			<li>시각화 선택 확대18X 100에는 기름 침수 렌즈 가벼운 현미경 박테리아. Hif WT 및 Vn HSA 코팅 유리 표면에 돌연변이 박테리아의 부착을 비교 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
상피 세포에 박테리아의 Vn 종속 부착의 연구 참고:이 효율적인 준수 분석 결과 우리의 이전 연구4,7에 사용 되었다.<ol>
<li>문화 A549 세포 (유형 II 치조 상피 세포) 10% (vol/vol) 태아 종 아리 혈 청 (FCS) (완전 한 매체) 및 5 µ g/mL gentamicin 보충 F12 매체와 75 cm2 조직 배양 플라스 크에. 80% 합칠 때까지 3 일 동안 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 플라스 크를 품 어 (confluency 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 셀에 의해 표면 범위를 시각화 하 여 예상할 수 있는). 다음 4 단계 분석 결과19,20대 한 상피 세포를 준비 하는 방법을 설명 합니다.<ol>
<li>부드러운 소용돌이 의해 20 mL의 PBS로 두번 플라스 크에 세포 단층을 씻어. 플라스 크 표면에서 세포를 분리, 세포 분리 효소 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 플라스 크를 품 어 모든 플라스틱 표면에서 세포를 분리 하려면 손바닥으로 플라스 크를 누릅니다. 몇 번 위아래로 플라스틱 셀 덩어리를 분산.</li>
			<li>F12 완전 한 매체의 18 mL 플라스 크에 추가 하 고 전체 세포 현 탁 액 50 mL 메 마른 팔 콘 튜브를 전송. RT에서 200 x g 에 5 분 동안 세포 현 탁 액을 원심 및 삭제는 상쾌한. F12 완전 한 매체의 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
			<li>10 µ L 세포 현 탁 액의 제거 및 Eppendorf 관에 다음 Trypan 블루 솔루션의 90 µ L를 추가 합니다. hemocytometer 샘플 로드 (깊이 0.1 m m)는 coverslip 배치 후.</li>
			<li>지역 A, B, C 및 D에에서 모든 가능한 셀 (16 사각형 이루어져 각 필드 및 각 광장 0.0025 m m2의 면적을가지고), 다음 셀의 평균 수를 계산 ([A + B + C + D] / 4). 다음 수식을 사용 하 여 밀리 리터 당 세포의 수를 계산. 실행 가능한 셀/mL = 평균 세포 수 × 104 × 희석 요인20. 참고: 여기, 희석 요인은 10 이다.</li>
			<li>103 셀/mL 사용 하 여 완전 한 중간 포함 5 µ g/mL gentamicin x 5.0에 세포 현 탁 액을 희석. 24 잘 셀 문화 접시의 각 음에 세포 현 탁 액의 500 μ를 분배. 셀 90% 합칠 때까지 5% CO2 에서 37 ° C에서 접시를 품 어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>세균 감염, 이전 우물에서 매체를 제거 (FCS), 없이 F12 매체 추가 그리고 37 ° c.에서 밤새 품 어</li>
		<li>실시간 장소 얼음 판에서 세 번 PBS의 500 µ L로 세포 단층을 세척 하 고 1 시간에 4 ° C에서 v n. 품 판의 10 µ g/mL를 포함 하는 미리 냉장된 F12 매체의 100 µ L를 추가. 제어 우물만 F12 매체를 추가 합니다.</li>
		<li>부 화, 후 pipetting으로 솔루션을 삭제 하 고 갓 재배 Hif M10 문화 실시간 Resuspend에 1 mL의 PBS로 두 번 셀 레이어를 세척 (단계 1.1.1) F12 매체 (2 × 108 CFU/mL). 각 잘에이 세균 현 탁 액의 100 µ L을 추가 하 고 2 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어 참고: 각 잘 약 2 × 105 A549 세포를 포함합니다. 감염, 세균성 CFU 추가 된 2 x 107 을 위한 100의 감염의 다양성에 대응 합니다.</li>
		<li>Pipetting으로 매체를 제거 하 고 세 번 PBS 가진 A549 상피 세포를 씻어. 세포 분리 솔루션의 50 µ L/잘 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 접시를 품 어</li>
		<li>다음, 효소 반응을 중지를 잘 당 F12 완료 중간의 50 µ L를 추가 합니다. 각 우물에서 포함 된 4 개의 유리 구슬 6 mL 유리 관 상피 세포 (≈100 μ [즉, 전체 볼륨])를 전송. 2 분 동안 vortexing에 의해 RT에서 셀 lyse</li>
		<li>10 µ L 세포 lysate의 약 희석 10 µ L lysate의 F12 매체의 990 µ L을 추가 하 여. 초콜릿 한 천 배지로 희석된 샘플의 10 µ L 플레이트.</li>
		<li>하룻밤, 초콜릿 한 천 배지에서 37 ° C를 품 어 다음 식민지를 계산 합니다. 각 식민지는 하나 CFU를 나타냅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vn 종속 저항 인간 혈 청의 살 균 활동을 분석
<ol><li>상업적인 소스에서 구매 NHS입니다. 앞에서 설명한12VDS를 준비 합니다. 180 VDS 보충 nM Vn 해당 Vn 보 건국에 존재 하는.</li>
	<li>보충 단백질을 비활성화 하기 위해 30 분 동안 56 ° C에서 NHS를가 열 하 여 열 비활성화 혈 청 (HIS)를 준비 합니다. 참고: 최적의 혈 청 농도 (5%)와 단계 3.3-3.7에서에서 설명한 분석 결과 대 한 보육 시간 (15 분)는 Hif15에 대 한 경험적으로 결정 했다;이 매개 변수는 다른 세균성 병원 체에 대 한 다 수 있습니다.</li>
	<li>중간 로그 단계로 (이 경우, Hif M10 돌연변이 Hif M10Δlph에) 박테리아 문화 (OD600 0.3 =). 10 분 동안 3500 x g 에서 원심 분리 하 여 박테리아를 작은.</li>
	<li>우선 당 젤라틴 Veronal 버퍼 (DGVB ++, pH 7.3) 포함 2.5% (w/v) 포도 당, 2 mM MgCl2, 0.15 m m CaCl2및 0.1% (wt/vol) 젤라틴의 1 볼륨 세균 펠 릿 resuspend</li>
	<li>1.5 x 10을 추가3 5% 혈 청을 포함 하는 DGVB ++ 의 100 µ L 박테리아의 CFU (보 건국, 그, VDS 또는 VDS + 180 nM Vn). 300 rpm에서 떨고와 15 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>0 분 (T0 샘플) 및 15 분 (Tt 샘플)와 초콜릿 한 천에 접시에 반응 혼합물에서 10 µ L aliquot를 제거 합니다. 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어.</li>
	<li>부 화, 후 접시에 식민지를 계산 합니다. 박테리아의 비율 살해12 다음 수식을 사용 하 여 계산: (TtCFU) / (T0에서 CFU) × 100.</li>
</ol>

<ol><li>Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitronectin+in+bacterial+pathogenesis%3A+a+host+protein+used+in+complement+escape+and+cellular+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion.</a> Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).</li>
<li>Hallstrom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Patterns+of+Microbial+Immune+Escape%3A+Pathogenic+Microbes+of+Diverse+Origin+Target+the+Human+Terminal+Complement+Inhibitor+Vitronectin+via+a+Single+Common+Motif%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif.</a> PloS one. 11 (1), 0147709(2016).</li>
<li>Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sequence+diversity+in+the+Moraxella+catarrhalis.+UspA2%2FUspA2H+head+domain+on+vitronectin+binding+and+antigenic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Micro.+Infect%22%5BJournal%5D)">Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation.</a> Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).</li>
<li>Singh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fine-tuned+interaction+between+trimeric+autotransporter+haemophilus+surface+fibrils+and+vitronectin+leads+to+serum+resistance+and+adherence+to+respiratory+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells.</a> Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).</li>
<li>Kohler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+vitronectin+and+Factor+H+to+Hic+contributes+to+immune+evasion+of+Streptococcus+pneumoniae.+serotype+3%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3.</a> Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).</li>
<li>Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%2C+sorting+and+immunocharacterization+with+proliferating+cell+nuclear+antigen+of+cycling+and+non-cycling+cells+in+synchronized+pea+root+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips.</a> Planta. 202 (2), 188-195 (1997).</li>
<li>Al-Jubair, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemophilus+influenzae+Type+f+Hijacks+Vitronectin+Using+Protein+H+To+Resist+Host+Innate+Immunity+and+Adhere+to+Pulmonary+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells.</a> J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).</li>
<li>Martinez-Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+Proteome-Wide+Discovery+of+Extracellular+Host-Pathogen+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions.</a> J. Immunol. Res. 2017, 2197615(2017).</li>
<li>Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-affinity+profiling+to+identify+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions.</a> Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li>
<li>Sultana, A., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein-protein+and+protein-nucleic+Acid+interactions+by+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cur.+Prot.+Prot.+Sc%22%5BJournal%5D)">Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry.</a> Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).</li>
<li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemophilus+influenzae+acquires+vitronectin+via+the+ubiquitous+Protein+F+to+subvert+host+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity.</a> Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).</li>
<li>Ronander, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+adhesin+protein+E%3A+characterization+and+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity.</a> J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).</li>
<li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bact%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li>
<li>Fleury, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Haemophilus+influenzae+factor+H-Binding+lipoprotein+involved+in+serum+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Imunol%22%5BJournal%5D)">Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance.</a> J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li>
<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-throughput%2C+label-free%2C+real-time+molecular+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li>
<li>McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18428379">Microscopy and image analysis.</a> Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4(2005).</li>
<li>Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+J.+Canc%22%5BJournal%5D)">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).</li>
<li>Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+A549+cell+line+as+a+type+II+pulmonary+epithelial+cell+model+for+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism.</a> Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).</li>
<li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemophilus+influenzae+P4+Interacts+With+Extracellular+Matrix+Proteins+Promoting+Adhesion+and+Serum+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance.</a> J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).</li>
<li>Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+structure+of+Haemophilus+influenzae+protein+E+reveals+multiple+binding+sites+for+host+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors.</a> Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).</li>
<li>Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+as+a+tool+for+exploring+bacterial+proteins%3A+model+of+RickA+in+Rickettsia+conorii%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiolog%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii.</a> New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).</li>
<li>Pinne, M., Haake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-fluorescence+assay+of+leptospiral+surface-exposed+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).</li>
</ol>

저자는 금융 충돌의 관심 있다.

세균성 병원 체 세포 표면에 Vn 모집를 보완 요인의 증 착 및 막 공격 복잡 한2의 완료를 방지 하기 위해이 보완 레 귤 레이 터. Vn 또한 기능 다리 분자 세균 표면 단백질 사이의 호스트 세포 표면 수용 체, 상피 세포의 표면에 고착 하 고 이후 국제화 중재 하 병원 체를 활성화 합니다. 이 연구에서 혈 청 저항 및의 향상을 제공에 i) 바인딩 Vn의 세균성 세포, ii) 단백질 단백질 상호 작용 및 선호도 상수의 표면 및 iii) Vn의 기능적 역할을 추정 하는 데 사용할 수 있는 프로토콜 설명 호스트 세포의 표면에의 준수
Cytometry는 일반적으로 박테리아가 Vn 바인딩할 확인 하는 데 사용 하는 양적 기술입니다. 그러나, Vn 농도 Vn 바인딩 (용량과 다양 한 수용 체) 세균성 종에 따라 다를 수로, 낙관 되어야 한다. 여기서 설명 하는 분석 결과에 1-100 µ g/mL Vn의 선형 바인딩 및 채도 매개 변수 추정에 사...

Vitronectin (Vn)는 중요 한 인간의 당단백질 fibrinolytic 시스템의 규제를 통해 항상성 유지에 관여 이다. Vn 또한 보완 레 귤 레이 터로 C5b6-7 복잡 한 형성과 C9 중 합 하는 동안 터미널 보충 통로 억제 함으로써 작용 한다. 여러 가지 세균성 병원 체 저항 보완 증 착1,2,3의 수단으로 세포 표면에 Vn을 모집 하기 위해 표시 되었습니다. 또한, Vn 박테리아 및 호스트 상피 세포 수용 체, 그로 인하여 추진 준수 및 병원 체2,,45의 국제화 사이 "샌드위치" 분자 기능을 합니다. 바인딩 Vn의 세균성 세포 표면에는 현재 정체 불명된 다른 단백질에 의해 중재 됩니다. Vn-에서 바인딩 회피 호스 면역 반응의 기능적인 역할을 완전히 elucidating 따라서 Vn 모집 단백질의 식별을 요구할 것 이다.
Vn-바인딩 단백질을 확인 하는 초기 단계는 관심의 병원 체는 순화 Vn. 교류 cytometry 바인딩할 수 있는지 여부를 테스트 Vn 병원 체 세포에 바인딩되어 있는지 여부를 확인 하는 편리 하 고 간단한 방법입니다. 이 연구에서 우리는 다양 한 Haemophilus 함께 유형 f (Hif) 임상 격리6Vn의 바인딩을 평가. 여기에 설명 된 방법은 양적 이며 다양 한 세균성 긴장의 바인딩 용량을 구분 하는 데 사용할 수 있습니다. 이전 연구에서 우리는 Vn-바인딩 단백질7단백질 H (전화), Hif의 특징. 따라서, 현재 연구에서 야생-타입 (WT) Hif 및 Hif M10Δlph 돌연변이의 Vn 바인딩 잠재력 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 비교 했다.
병원 체 Vn 바인딩합니다 확인은, 두 번째 단계는 표면 프로테옴 잠재적인 Vn-바인딩 단백질 식별 특성. 다양 한 접근법이 목적8,9를 사용할 수 있습니다 그러나 이러한 방법론은이 보고서에서 설명 하지 않습니다. 단백질 단백질 상호 작용을 조사 하기 위한 가장 적합 한 방법은 recombinantly 대장균 에서 선택한 세균성 표면 단백질을 표현 하 고 친화성 크로마토그래피에 의해 정화 하입니다. 여기, 우리 사용 PH Vn와 분자의 상호 작용 방법을 설명 합니다. 재조합 PH와 Vn 간의 상호 작용은 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)7 과 바이오-레이어 간섭계 (BLI)10,11이라는 최근에 개발 된 레이블 없는 기술을 사용 하 여 특징 이었다. 반면 ELISAs 단백질 단백질 상호 작용을 확인 하는 데 사용 될 수, 씨는 상호 작용의 운동 매개 변수에 대 한 자세한 데이터를 제공 합니다.
세균성 부착에서 Vn의 기능적 역할을 연구 하기 두 개의 서로 다른 분석을 활용할 수 있습니다. 여기에 설명 된 첫 번째 분석 결과 두 번째 시험 검사 상피 세포의 표면에 부착 하는 반면 Vn 코팅 유리 표면에 세균성 부착의 직접 측정은. 첫 번째 분석 결과 대 한 유리 슬라이드 했다 Vn, 코팅 그리고 WT 또는 돌연변이 Hif 긴장의 바인딩 그램 얼룩 그리고 현미경 검사 법에 의해 평가 되었다. 이 기술은 쉽게 박테리아가 Vn12바인딩할 능력에 따라 구분 합니다. 포유류 세포에 세균성 접착의 유형 II 치조 상피 세포; 단층에 교양된 박테리아를 추가 하 여 다음 분석 세균성 부착 했다 식민지 형성의 수를 계산 하 여 평가 단위 (CFUs). 준수 하 고 내 면 박테리아는 Vn4,13의 유무에서 고유 수 있습니다.
Vn 수집 세균 혈 청 저항에서의 역할은 혈 청 죽이 분석 결과 (즉, 혈 청 살 균 활동)를 사용 하 여 평가 되었습니다. 혈 청 저항에서 Vn 수집의 중요성을 평가, Vn 고갈 혈 청 (VDS)의 살 균 활동 정상적인 인간 혈 청 (NHS)의 비교 되었다. 쉽게 사용 하는 방법은 혈 청 저항에 따라 구속력이 박테리아 대 Vn-바인딩을 구분 합니다. 우리는 여러 가지 세균성 병원 체4,12의 혈 청 저항에 Vn의 역할을 연구 하기이 방법을 사용.
수많은 방법 호스트 병원 체 상호 작용 연구 보고 되었습니다. 여기, 우리는 적용할 수 있습니다 쉽게 어떤 병원 체의 연구를 병에 Vn의 역할 평가 프로토콜의 집합을 설명 합니다. 우리는 다양 한 병원 체를 사용 하 여 이러한 프로토콜을 테스트 하 고 Hif이이 보고서에 대 한 예제로 선정 되었다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL thermomixter</td><td>Eppendorf</td><td>5355</td><td>dry block heating and cooling shaker</td></tr><tr><td>5 mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>60819-138</td><td>12 &times; 75 mm 스타일</td></tr><tr><td>5% CO2 공급 인큐베이터&nbsp;</td><td>써모 사이언티픽&nbsp;</td><td></td><td></td>BBD6220</tr><tr><td>6 mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89000-478</td><td>12 &times; 75 mm 스타일 캡</td></tr><tr><td>24-웰 플레이트</td><td>BD Falcon</td><td>08-772-1H</td><td>세포 배양 등급</td></tr><tr><td>30% 과산화수소 (H2O2) 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>실험실 분석 등급</td></tr><tr><td>75 cm2 조직 배양 플라스크</td><td>BD Falcon</td><td>BD353136</td><td>Vented</td></tr><tr><td>96 웰 블랙 플랫 바닥 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td>조직 배양 처리 &마이크로; 투명 검은 판</td></tr><tr><td>A549 세포주 인간</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86012804-1VL</td><td></td></tr><tr><td>세포 분리 효소 (Accutase)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-500ML</td><td>세포 배양 등급</td></tr><tr><td>AR2G 센서</td><td>Pall Life Science</td><td>18-5095</td><td>아미노 커플링에 의한 고정 단백질에 센서&nbsp;</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>VWR</td><td>97064-786</td><td>분석 등급</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>바이뷸러스 종이&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28511-007</td><td></td></tr><tr><td>바이오 레이어 간섭계</td><td>Pall Life Science</td><td>FB-50258</td><td>이중층 간섭계 측정 장비</td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td></td></tr><tr><td>C4BP (C4b 결합 단백질)</td> <td>Complement Technology, Inc.</td><td>A109</td><td>냉동 액체 형태로 구입</td></tr><tr><td>: 염화칼슘 (CaCl2)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Carbol-fuchsin 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT8018-250ML</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275-500G</td><td>American Chemical Society (ACS) 등급</td></tr><tr><td>탈색 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>E. coli 호스트 (E. coli BL21)</td><td>Novagen</td><td>69450-3</td><td>단백질 발현 호스트</td></tr><tr><td>F12 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td><td>세포 배양 등급</td></tr><tr><td>유세포 분석기&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>651154</td><td>연구 응용을 위한 세포 분석 등급&nbsp;</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청 (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td>세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>Normal human serum (NHS)</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>NHS</td><td>풀드 인간 혈청</td></tr><tr><td>FITC-conjugated donkey anti-sheep 항체&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>STAR88F</td><td>Polyclonal</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>세포 배양 등급</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td>세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>혈구 분석기</td><td>Marienfeld</td><td>640210</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated anti-His tag 항체</td><td>Abcam</td><td>ab1269</td><td>다클론</td></tr><tr><td>인간 인자 H</td><td>보체 기술, Inc.</td><td>A137</td><td>은</td></tr><tr><td>C4BP</td><td>Complement Technology, Inc.</td>의 냉동 액체로 구입했습니다.<td>A109</td><td>냉동 용액</td></tr><tr><td>인간 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1653-10G</td><td>동결 건조 분말</td></tr><tr><td>히스티딘 친화성 수지 컬럼 (HisTrap HP)</td><td>GE Health Care Life Science</td><td>17-5247-01</td><td>Ni Sepharose로 사전 포장</td></tr><tr><td>된 컬럼 His-tagged PH</td><td></td><td></td><td>실험실에서 재조합 발현 및 정제</td></tr> 요<tr><td>오드 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT902-8FOZ</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>VWR</td><td>BDH1135-1LP</td><td>분석 등급</td></tr><tr><td>&nbsp; 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td>반전 현미경</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td>평면, 크기 25 mm &times; 75 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>마그네슘 클로라이드 (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-1KG</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드는 C 단자를 포함하고 있습니다. 백본에 6x His-tag (pET26(b))Novagen</td><td></td> <td>69862-3</td><td>DNA 벡터</td></tr><tr><td>Polysorb microtitre plates&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9410</td><td>ELISA용</td></tr><tr><td>수산화칼륨 (KOH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>6009</td><td>American Chemical Society (ACS) 등급</td></tr><tr><td>양 항인간 Vn 항체</td><td>AbD Serotec</td><td>AHP396</td><td>Polyclonal</td></tr><tr><td>Shaker&nbsp;</td><td>스튜어트 사이언티픽</td><td>STR6</td><td>플랫폼 쉐이커</td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크</td><td>BD 팔콘</td><td>3175167</td><td>75 cm2</td></tr><tr><td>&nbsp; 써모믹서&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3317</td><td>드라이 블록 가열 및 냉각 쉐이커</td></tr><tr><td>테트라메틸벤지딘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>860336-100MG</td><td>ELISA 등급</td></tr><tr>인간 플라즈마 <td>Sigma-Aldrich</td><td>V8379-50UG</td><td>세포 배양 등급</td> <td>Vitronectin(Vn)</td></tr></tbody></table>

세균성 접착 및 혈 청 저항에 vitronectin의 역할을 공부에 대 한 분석

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

박테리아는 호스트 면역 반응을 회피의 수단으로 보완 레 귤 레이 터를 사용 합니다. 여기, 우리는 호스트 면역 시스템에 저항에 세균성 세포 표면 놀이에 역할 vitronectin 인수를 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 교류 cytometry 실험 Haemophilus 함께 유형 f의 세균성 수용 체 외부 막 단백질 H에 대 한 리간드로 인간의 플라즈마 vitronectin를 확인. 순화 된 재조합 단백질 H와 vitronectin, 간의 단백질-단백질 상호 작용 하는 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 고용 되었다 하 고 바이오-레이어 간섭계를 사용 하 여 평가 했다 선호도 바인딩. 호스트 면역 반응의 회피에 세균성 세포 표면에 단백질 H vitronectin의 바인딩의 생물학 중요성 정상 및 vitronectin 고갈 인간의 혈 청 혈 청 저항 분석 결과 사용 하 여 확인 되었다. 세균성 부착에서 vitronectin의 중요성 vitronectin 코팅, 그램 얼룩 뒤 없이 유리 슬라이드를 사용 하 여 분석 했다. 마지막으로, 세균성 접착 인간 폐 포 상피 세포 monolayers 조사 했다. 여기에 설명 된 프로토콜 관심의 어떤 세균성 종의 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.

박테리아의 표면에 Vn 바인딩 cytometry에 의해 결정 되었다. 이 연구에서 임상 격리 된 테스트 모든 Hif 셀 표면에 Vn을 채용. 세포 표면에 Vn의 상호 작용은 대장균 부정적인 제어 스트레인 (그림 1A)에 대 한 관찰 되었다. 그림 1B와 같이 PH Hif 세포의 표면에 주요 Vn-바인딩 단백질 이다. WT Hif 긴장에 의해 Vn의 바인딩 M10 발생 변화는 인구에서 Hif M10Δlph Vn 바인딩되지 않은 고는 컨트롤과 유사 하 게 나타났다.
PH와 Vn 간의 단백질-단백질 상호 작용은 ELISA와 씨에 의해 견적 되었다. 재조합 PH 인간의 요소...

이 보고서는 특성화 세균성 외부 막 단백질 및 인간 보완 레 귤 레이 터 vitronectin 사이 상호 작용에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜은 바인딩 반응 어떤 세균성 종에 vitronectin의 생물 학적 기능을 공부 하 고 사용할 수 있습니다.

세균성 접착 및 혈 청 저항에 Vitronectin의 역할을 공부에 대 한 분석

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

이 방법은 세균성 병원체가 인간 단백질을 사용하여 인간에 있는 질병을 일으키는 원인이 되는 방법과 같은 호스트 병원체 상호 작용 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 어떤 병원체가 호스트의 감염을 확립하기 위해 Vitronectin를 이용할 수 있는지 대답할 수 있다는 것입니다. 우리는 비트론틴에 초점을 맞출 것 이다, 세포 외 매트릭스에 참여 하는 호스트 단백질, 하지만 또한 보완 활성화의 결정 경로에 보완 억제제로 기능.이 사실은 인간에 있는 질병을 일으키는 원인이 되는 병원체를 위해 아주 중요하고 높게 매력적입니다. 유동 세포측정을 준비하기 위해 250나노몰러 비트론틴을 함유한 블로킹 버퍼 50마이크로리터로 세균성 펠릿을 다시 보습한다. 그런 다음 실온에서 1 시간 동안 샘플을 흔들어주지 않고 배양하십시오.인큐베이션 후, 5 분 동안 3, 500 g에서 원심 분리에 의해 박테리아를 펠릿. 그런 다음 PBS 및 유사한 원심 분리 단계를 사용하여 펠릿을 세 번 세척합니다. 세척 후, PBS BSA에서 1-100 희석에서 세균 펠릿에 1차 양 항인간 비트로넥틴 폴리클론 항체의 50 마이크로리터를 첨가한다.실온에서 1시간 동안 서스펜션을 배양합니다. 그런 다음 PBS로 박테리아를 세 번 세척하여 언바운드 항체를 제거합니다. 다음으로, 플루오레세인 이소티오카네이트를 함유한 PBS BSA의 50마이크로리터를 펠릿에 당나귀 항양 폴리클론 항체를 첨가한다.어둠 속에서 1 시간 동안 실온에서 배양하십시오. 마지막으로, 세 가지 세척 단계 후, PBS의 300 마이크로 리터와 세균 펠릿을 다시 중단하고 유동 세포 측정에 의해 분석. ELISA를 준비하려면 PolySorp 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 100 마이크로리터의 단백질 용액을 분배합니다.뚜껑으로 접시를 닫고 밤새 섭씨 4도에 보관하여 마이크로티터 플레이트 웰에 단백질의 고정을 용이하게합니다. 싱크대 위로 거꾸로 기울어져 마이크로티터 플레이트에서 용액을 버립니다. 그런 다음 우물당 PBS 300 마이크로리터로 우물을 세 번 씻으시다.2.5 중량 볼륨 % BSA를 포함하는 PBS와 실온에서 1 시간 동안 코팅 된 우물을 차단합니다. 차단 용액을 제거한 후 우물을 300 마이크로리터당 300마이크로리터로 세 번 세척합니다. 이제 각 샘플에 태그된 그의 태그된 PH를 50 나노몰어로 재조합한 100개의 마이크로리터를 추가합

assays-for-studying-role-vitronectin-bacterial-adhesion-serum

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 프로토콜은 교양 세포에 준수 아르 단위를 형성하는 박테리아 식민지의 숫자를 계산에 구성된 간단한 세균 유착 분석이다. 분석은 강력한이며, adhesin 독립 공부하고, 다수의 유사 콘텐츠는 세균 pathogenesis 작업을 대부분의 실험실에 사용됩니다.

포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

이 비디오는 고정되지 않은 첫 번째 단백질에 대한 두 번째 단백질의 결합을 측정하여 두 단백질 간의 단백질-단백질 상호 작용을 감지하는 ELISA 기반 기술에 대해 설명합니다. 결합된 두 번째 단백질은 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)와 같은 효소로 표지된 특정 항체를 사용하여 검출됩니다.

미끼와 먹이 단백질 간의 상호 작용을 분석하기 위한 ELISA 기반 방법

이 비디오에서는 헤모필루스 인플루엔자가 숙주 상피 세포에 순응하는 과정에서 비트로넥틴의 역할을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다.

숙주 상피 세포에 대한 박테리아 부착에서 Vitronectin의 역할을 연구하기 위한 분석

이 비디오는 인간 혈청 당단백질인 비트로넥틴이 박테리아 저항성에 미치는 역할을 보여줍니다. 혈청의 항체는 박테리아 표면 단백질과 상호 작용하여 보체 단백질을 활성화하고 막 공격 복합체를 형성하여 박테리아 세포 용해를 일으킵니다. 박테리아 막 단백질에 대한 비트로넥틴 결합은 막 공격 복합체 형성을 방지하여 박테리아가 생존할 수 있도록 합니다.

인간 혈청의 살균 활성에 대한 박테리아 내성에서 Vitronectin의 역할 결정

이 비디오에서는 형광 현미경을 사용하여 암세포가 호중구 세포외 트랩(NET)에 부착되는 것을 감지하는 분석을 시연합니다. 테스트 웰에서는 NET에 부착된 형광 표지된 암세포의 수가 눈에 띄게 증가한 반면, DNase로 처리된 웰은 NET에 대한 암세포 부착력이 감소한 것으로 나타났습니다.

암세포가 호중구 세포외 트랩에 부착되는 것을 감지하기 위한 In vitro adhesion assay

이 비디오는 비트로넥틴과 박테리아 표면 단백질의 상호 작용을 감지하는 방법을 보여줍니다. 유세포 분석 분석은 비트로넥틴에 결합된 형광 표지 항체의 형광 신호를 측정하여 박테리아 표면에서 그 존재를 확인합니다. 이 기술은 숙주-병원체 상호 작용 및 잠재적인 박테리아 감염 요법에 대한 통찰력을 제공합니다.

유세포 분석을 사용한 박테리아 표면에 대한 Vitronectin 결합 검출

감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에...

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

전단 응력을 받는 혈관과 박테리아의 상호 작용을 연구하기 위해 혈관 접착에 기여하는 박테리아 및 숙주 요인을 해부할 수 있는 유동 챔버 및 생체 내 장간막 생체 내 현미경 모델이 설명됩니다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

숙주 세포에 대한 박테리아 부착은 숙주 집락화 및 감염 과정에서 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 폴리머 결합 재조합 애착체의 생성을 생체 모방 물질로 설명하며, 이를 통해 다른 박테리아 요인과 독립적으로 이러한 과정에 대한 개별 애착체의 기여도를 분석할 수 있습니다.

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

바이러스에 감염된 HeLa 세포 단층의 부착을 위한 왕국 간 연관성 및 경쟁(박테리아 및 진균)을 결정하기 위한 방법이 본원에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 원핵생물, 진핵생물 및 바이러스의 여러 조합으로 확장될 수 있습니다.

박테리아와 균류에 의해 바이러스에 감염된 세포에 바이오 필름 개시의 결정

조정 가능한 밀도를 가진 RGD 기능화된 avidin-biotin tethers를 사용하여 단일 이동 혈소판을 이미징하기 위한 자세한 프로토콜이 제공되어 혈소판이 avidin-biotin 결합을 파열하기에 충분한 힘을 생성한다는 것을 밝혔습니다.

RGD 기능성 Avidin-Biotin 테더를 사용한 혈소판 이동을 연구하기 위한 In vitro 분석

학습하세요 세균 외막 단백질과 Vitronectin의 상호작용을 흐름 세포측정법으로 분석하는 방법을. 이 기술은 병원체가 인간 단백질을 이용해 감염을 유발하는 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

세균성 접착 및 혈 청 저항에 Vitronectin의 역할을 공부에 대 한 분석

더 많은 동영상 탐색