고급 동물의 간에서 대장 전이의 모델 : 이미징 기술 및 전이성 클론의 특성

이 접근법의 전반적인 목표는 결장직장암에 의해 생성된 전이성 종양 클론에 의한 간 집락화를 모델링하고 이 모델을 사용하여 간 전이의 진단 및 치료를 개선하는 것입니다. 임상적 관찰은 전이성 질환의 이질성을 나타냅니다. 우리의 모델은 이러한 이질성을 포착하여 올리고전이성 및 다발전이성 질환과 관련된 유전자를 검출할 수 있는 기능을 제공합니다.

그리고 이 지식을 전이의 조기 발견 및 치료를 개선하기 위해 사용합니다. 우리 기술의 주요 장점은 결장직장암 환자에서 유래한 이중 표지된 단클론 세포주를 사용하고 생체 내 및 생체 외 모두에서 간 전이의 발달을 관찰할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 전이성 질환 치료로 확장됩니다.

이를 통해 전이성 병변의 수와 각 병변의 성장 동역학에 대한 정량적 추정을 통해 모든 잠재적 약물을 테스트할 수 있는 능력을 제공합니다. 루시퍼라제 tdTomato 표지된 HCT116 세포를 생성하고 배지, 시약 및 기기를 준비한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 transspect된 세포를 웰당 다음 밀도로 96웰 플레이트에 3회씩 플레이트화합니다. 5시간 동안 세포를 배양한 후 데스크탑에서 이미지 소프트웨어를 시작하여 IVIS 시스템을 사용하여 tdTomato 형광 강도를 정량화합니다.

초기화 버튼을 클릭하여 이미징 시간, 중간 비닝, F/Stop에 대해 2개, 여기 필터에 대해 535, 방출 필터에 대해 580을 초기화합니다. 96웰 플레이트를 이미징 스테이션에 놓고 Acquire를 클릭하여 이미징을 시작합니다. 이미지를 획득한 후 Tool Palette에서 ROI tools를 클릭하고 슬릿 아이콘에서 12x8을 선택합니다.

96웰 플레이트의 이미지에서 신호 영역을 커버하는 12x8 슬릿을 만들고 Measurements 탭을 클릭합니다. 초당 광자, 스테라디안당, 제곱센티미터당 광자 단위가 있는 ROI 측정 테이블이 있는 창을 관찰합니다. 비장 주사 약 1시간 전에 세포가 70-80%의 포화도에 도달하면 세포에 0.05%의 트립신과 0.53밀리몰의 EDTA를 추가하여 세포를 해리합니다.

세포를 3-5분 동안 배양한 후 동일한 부피의 C-DMEM을 사용하여 트립신을 중화합니다. 뭉침을 방지하기 위해 배양물을 철저히 피펫팅한 다음 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다. 1x DBPS의 부유 세포를 1.2 - 2 x 10의 농도로 100 마이크로리터당 6개 세포로 동결하고 응집을 방지하기 위해 철저히 피펫팅합니다.

그런 다음 주입할 때까지 세포를 얼음 위에 두고, 때때로 튜브에 다시 매달아 놓습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 6-8주 된 암컷 흉선 누드 마우스에 진통제를 투여하고 마취한 후, 비장을 왼쪽 옆구리의 피부를 통해 외부에서 보이는 보라색 부위로 확인하고 장기 바로 위의 피부에 8mm 왼쪽 옆구리를 절개합니다. 그런 다음 복벽을 들어 올려 작게 절개합니다.

복강으로 공기를 넣어 내부 장기가 절개 부위에서 멀어지도록 합니다. 그런 다음 복벽 절개 부위를 약 5mm로 확대합니다. 주사에 대해 입증된 단계는 절차에 매우 중요합니다.

주사 중 종양 세포의 누출은 간 외 전이로 이어질 수 있습니다. 주사는 문맥 혈전증을 예방하기 위해 30-60초 이상 천천히 진행해야 하며, 150만 개 이하의 세포를 사용해야 합니다. 면봉을 사용하여 절개 부위 주위를 부드럽게 눌러 비장을 노출시킵니다.

필요한 경우 췌장 지방을 부드럽게 조작하여 노출을 돕고 비장을 손상시키지 않도록 할 수 있습니다. 27게이지 바늘이 달린 1밀리리터 주사기를 사용하여 30-60초 동안 노출된 비장 끝에 100마이크로리터의 세포를 주입합니다. 주사가 끝나면 주사를 제거하기 전에 비장에 마이크로 클립을 삽입하여 주입된 세포 현탁액의 누출을 방지하고 5분 동안 그대로 둡니다.

주사 후 5분 후에 휴대용 소작 장치를 사용하여 지혈을 위한 비장 절제술을 시행합니다. 혈관의 근위부를 인접한 지방 조직과 사전 응고하여 앞쪽의 비장 문턱부터 시작합니다. 주사 부위에서 비장 출혈이 발생할 수 있습니다.

마이크로 클립은 비장에 적용되어 종양 세포 누출을 방지하고 비장 출혈을 제어합니다. 지혈 방법에는 소작, 3-5분 동안 압력 유지, 필요한 경우 봉합 결찰이 포함될 수 있습니다. 5.0 흡수성 꼰 봉합사와 단일 수평 스티치를 사용하여 복벽을 닫습니다.

그런 다음 4.0 비흡수성 모노 필라멘트 봉합사를 사용하여 단일 수평 스티치로 피부를 닫습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 수술 후 동물을 모니터링합니다. 생물 발광 이미징을 수행하려면 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 마취한 후 미리 준비된 반딧불이 루시페린 150마이크로리터를 동물에게 복강내 주사합니다.

IVIS에 있는 마우스를 누운 자세로 놓고 동물 사이에 스페이서를 배치하여 인접한 마우스에 대한 신호를 최소화합니다. 루시페린 주입 3분 후, IVIS를 초기화한 후 발광, 1초 노출 시간 및 중간 비닝을 선택합니다. Acquire 버튼을 클릭하여 이미징을 시작하고, 루시페린 주입 후 3분 후에 이미징이 일관되게 수행되도록 합니다.

이미지가 획득되고 이미지 창과 도구 팔레트가 나타나면 ROI 도구를 클릭하고 이미징된 마우스의 수에 해당하는 원 아이콘에서 1에서 5 사이의 숫자를 선택합니다. ROI를 정의하려면 마우스의 복강에서 발광 신호의 신호 영역에 원을 친 다음 ROI 측정값을 임의의 방사 단위로 클릭합니다. 배경에 대한 추가 ROI 원을 포함합니다.

IVIS를 초기화한 후 확산 발광 영상 단층촬영(DLIT)을 수행하려면 주입 후 4주가 지나면 이미징 마법사, 생물 발광을 선택하고 다음을 클릭합니다. DLIT를 선택하고 다음을 클릭합니다. Firefly 프로브를 선택하고 다음을 클릭합니다.

이미지 피사체에 대해 마우스를 선택하고, 시야각에 대해 노출 매개변수 C-13 cm에 대해 자동을 선택하고, 피사체 유형으로 0.5 cm를 선택한 후 다음을 클릭합니다. 그런 다음 Acquire 버튼을 클릭하여 이미징을 시작합니다. 이미지를 획득한 후 분석 탭에서 DLIT 3D 재구성 탭을 선택하고 재구성을 클릭하여 3D 재구성 이미지를 생성합니다.

Tools and 3D Animation(도구 및 3D 애니메이션)을 클릭합니다. 그런 다음 3D 애니메이션 창에서 Y축에서 CCW 스핀을 선택합니다. Record and Save(기록 및 저장)를 클릭하여 파일을 mov 형식 파일로 저장합니다.

생체 외 형광 이미징을 수행하려면 텍스트 프로토콜에 따라 마우스에서 간을 채취하고 해부한 후 IVIS를 사용하여 각 종양 군체의 형광 강도를 측정합니다. 형광을 선택하면 4초 노출 시간, 중간 비닝, F/Stop에 2, 여기 필터에 535, 방출 필터에 580을 선택할 수 있습니다. Acquire 버튼을 클릭하여 이미징을 시작합니다.

이미지를 가져온 후 도구 팔레트에서 이미지 창을 찾습니다. ROI Tools를 클릭하고 원 아이콘에서 1을 선택합니다. ROI를 정의하려면 영상에서 개별 종양 군집체의 신호 영역에 원을 그리십시오.

배경의 추가 ROI 원을 얻은 다음 Measurements of the ROI를 임의의 방사 단위로 클릭합니다. 배경의 추가 ROI 원을 확보합니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 따라 계산을 수행합니다.

생물 발광(bioluminescence)에서 볼 수 있듯이, 비장 주사 3주 후 HCT116 L2T 클론 P1 및 P2는 클론 O1 및 O2에 비해 종양 부담이 더 컸습니다. 이러한 데이터는 클론 O1 및 O2가 올리고전이성 질환을 모방할 수 있는 반면, P1 및 P2는 간의 공격적이고 광범위한 전이성 집락화를 나타낼 수 있음을 나타냅니다. 비장 주사 후 4주 현재 간의 생체 외 형광을 정량화한 결과, P1 및 P2가 O1 및 O2 간에 비해 형광 강도가 더 높다는 것이 확인되었습니다. 종양 클론의 형광 표지는 간에 있는 개별 전이성 집락의 수와 크기를 식별했습니다.

전반적으로 생체 외 형광 이미지는 거시적 결과와 일치했지만 표면 아래에 숨겨진 작은 군체는 형광 이미징으로 더 잘 감지되었습니다. 여기에 묘사된 바와 같이, 전이성 콜로니의 수와 크기는 각 간에서 계수 및 측정되었으며, 각 모노클론에 대해 각 전이성 콜로니에서 생체 외 형광 이미징이 수행되었습니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이 P1의 총 전이 수는 P2, O1 및 O2에 비해 더 높았으며, 개별 집락의 평균 크기는 P1, O1 및 O2보다 P2에서 더 컸습니다. 우리의 모델은 전이의 분자 이질성과 관련된 새로운 설득 유전자를 식별하는 접근 방식을 제공합니다.

이러한 유전자는 전이 치료에 대한 새로운 접근 방식의 표적으로 사용될 수 있습니다. 우리의 모델은 또한 현재의 대규모 임상 데이터베이스에서 나오지만 전이성 질환의 맥락에서 아직 기능적으로 정의되지 않은 다양한 단백질 코딩 및 비코딩 유전자의 검증에 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 동물 수술의 섬세함 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

그러나 연습을 통해 짧은 시간에 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 동물 수술 지침을 따르고, 출혈을 주의 깊게 조절하고, 종양 세포 현탁액의 누출을 방지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.