Name: 고급 동물의 간에서 대장 전이의 모델 : 이미징 기술 및 전이성 클론의 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 학습하세요 대장암 간 전이 모델링 방법으로 이중 표지 단일 클론 세포주를 활용하여 전이성 질병의 이질성을 정량적 이미징으로 분석하고 조기 진단 및 치료 전략 개선을 위한 유전자를 식별하는 기술입니다.

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우리는 Luc2-tdTomato 플라스미드와 HCT116 세포주의 도움 씨 애니 Solanki (동물 자원 센터) 쥐 관리, 박사 라라 레오니 박사 제프리 L. 그린 (시카고 대학)에 감사드립니다 DLIT와. 형광 및 발광 강도의 정량화는 IVIS 스펙트럼에 시카고 대학 (퍼킨 엘머, 홉 킨톤, MA)에 통합 작은 동물 영상 연구 자원에서 수행되었다. 이 작품은 암 연구를위한 버지니아와 DK 루드비히 기금에 의해 지원되었다, 폐 암 연구 재단 (LCRF), 전립선 암 재단 (PCF) 및 암 센터 지원 그랜트 (P30CA014599). 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비에 아무런 역할을하지 않았다.

모든 동물의 절차는 시카고 대학 (프로토콜 # 72213-09)에서 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 무균 조건 하에서 수행 하였다. 1. 준비 <ol><li> 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린 및 100mg / ml 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) : 500 HCT116 종양 세포의 배양을위한 배지의 용액을 만든다. </li><li> 20 분 동안 251 ° F에서 4 수술 타월, 거즈, 두 개의 작은 Adson 픽업, 바늘 구동부 위 두 쌍 작은 클램프 3 microclips - 악기 3 등 비장 주입 모델에 사용되는 오토 클레이브 . </li><li> , 마우스에 대한 수술 후 마취를 준비 비장 주입 다음 피하 투여 할 수 있습니다. 마우스 당 0.9 생리 식염수 500 μL에 부 프레 노르 핀의 4 μg의 - 2 희석. </li><li> 복강 내 주사 지속 시간에 대한 반디 루시페린의 150 μg의 / 150 μL의 분취 량을 준비생물 발광 분석을 보내고. -20 ° C에서 보관하고 빛으로부터 보호합니다. </li></ol> 루시 페라 제 / tdTomato 표지 단일 클론 셀 라인 10, 11를의 2 세대 <ol><li> 해동 HCT116 인간 대장 암 세포를 10 % FBS, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신을 가진 DMEM에서 293FT 인간 배아 신장 세포를 유지한다. 5 % CO 2, 37 ℃에서 문화를 유지한다. </li><li> 높은 역가의 렌티 바이러스를 생성합니다. <ol><li> 12 × 106 293FT 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 완전 DMEM 18 ㎖ (cDMEM)에서 15cm 세포 배양 접시에서 통로 (3) 및 (10) 사이에서 세포, 1 % 비 필수 아미노산 - D 1 플레이트 (10) . 37 ° C에서 품어 5 % CO 2. </li><li> 이 D에서 다음 형질 감염 용액을 사용하여 세포를 형질 감염 : <ol><li> 각각의 접시를 들어, 다음을 사용하십시오 루시 페라 제 (Luc2) 및 tdTomato 삽입 pFUG의 렌티 바이러스 벡터의 37.5 μg의의 DNA 혼합물멸균 H 2 O의 1062 μL의 총에 재현 탁 (11) (시카고 대학에서 박사 제프리 그린의 선물), pCMVΔ8.74 25 μg의, 그리고 pMD2.G의 12.5 μg의를 구성 2 M CaCl2를 188 μL를 추가합니다. </li><li> 추가 1250 배 헤 페스 완충 식염수 (HBS, 50mM의 헤 페스, 1.5 밀리미터 나 2 HPO 4, 180 mM의 염화나트륨, pH를 7.12)를 DNA / CaCl2를 용액에 한 번에 한 방울의 μL 관통 기포 취입하면서 피펫으로 솔루션입니다. </li><li> 20 분 동안 실온에서 인큐베이션하고 25 μM의 최종 농도를 확인하기 위해 RT cDMEM 클로로퀸 및 15.5 mL를 첨가. </li></ol></li><li> 293FT 세포의 각 접시에 미디어를 기음과 형질 전환 솔루션으로 교체합니다. 도금 세포가 쉽게시키다로, 천천히 형질 용액 16 mL를 넣고. </li><li> D 3 일 후 8 - 다시, 타키 16 시간의 형질 감염 용액을 제거하고, 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)로 한번 세포를 씻어NG는 셀을 제거하지 않도록주의. 10 mM의 헤 페스 신선한 cDMEM 18 mL로 미디어를 교체합니다. 참고 천천히 요리 이동 형질 감염 용액을 흡인하고 세포 빠지지 않도록 플레이트의 측벽을 통해 미디어를 추가한다. </li><li> D (4)에 형질 감염 시점으로부터 48 시간에, 세포를 빠지지 않도록 천천히 피펫으로 흡인하여 접시에서 매체를 수집한다. 원심 분리기에서 5 분 동안 300 XG에 수집 된 미디어가 큰 세포 찌꺼기를 침전한다. </li><li> 사용하여 바이러스 상층 액을 필터 0.45 μm의 저 단백질 결합 50,000 XG, 4 ° C에서 2 시간 동안 SW-28 로터를 사용하여 필터 플라스크와 원심 분리기. 원심 분리 완료 후 즉시 상등액을 경사 분리하고 와이퍼와 상기 튜브의 내부를 건조. </li><li> 1 % FBS로 감소 세럼 중간 (RSM)의 50 μL의 바이러스 성 펠렛을 재현 탁. 분취 량은 나중에 사용하기 (바이러스 주)에 대한 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 렌티 바이러스를 형질 도입와 HCT116 세포로 ES는 tdTomato 양성 클론의 패널을 생성합니다. <ol><li> 바이러스 감염 전 1 1 × 105 웰 플레이트 (24) (D)의 밀도에 HCT116 세포 접시. </li><li> 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 8 μg의 / ML의 폴리 브렌과 : (100 희석 1) (cRSM) RSM의 4 mL에 (2.2.7)에서 재 부유 바이러스의 40 μL를 희석. </li><li> 감염의 날, DPBS 한 번 세포를 세척 한 다음 각 웰에 단계 2.3.2에서 희석 바이러스의 250 μL를 추가합니다. 각 웰에 cDMEM의 1 mL를 넣고 다음 37 ° C에서 4 시간 5 % CO 2 품어하고; 72 시간 - 48 CO 2를 37 ° C에서 품어 5 %. </li><li> 0.05 % 트립신 1 ㎖ 및 0.53 mM의 EDTA로 세포를 재현 탁하고 트립신 중화 cDMEM 1 mL를 넣어. 4 분 동안 300 XG에 microcentrifuge 관 및 펠릿에 세포를 전송합니다. 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 (HBSS) 플러스 2 % FBS 1 mL에 펠릿 배를 씻으십시오. </li><li> 단계 2.3.4에서 펠렛을 재현 탁1 × 106 세포 / ㎖에서 단일 세포 현탁액 FACS 완충액 (2 % FBCS 및 PBS 2 mM의 EDTA)와. </li><li> 정렬 PE 양성 세포 게이팅 셀 소터를 사용 tdTomato 양성 HCT116 세포 (여기 / 방출 : 585분의 556 ㎚). 부모 tdTomato 양성 HCT116 세포 (도 1A)을 생성하는 5 % CO 2, 37 ℃에서 10 cm 접시에 수집 된 세포를 성장한다. </li><li> 0.05 % 트립신 8 mL의 3 0.53 mM의 EDTA와 2.3.6에서 부모 tdTomato 양성 HCT116 세포를 재현 탁 - 5 분 ​​후 트립신을 중화 8 mL의 cDMEM의 추가합니다. <ol><li> 4 분 동안 300 XG에 50 ML의 튜브 및 펠릿에 세포를 전송합니다. 상층 액을 제거하고 cDMEM (그림 1B) 200 μL 당 1 셀에 부모 tdTomato 양성 HCT116 세포를 희석. </li></ol></li><li> 5 % CO 2, 37 ° C (그림 1C)에서 96 웰 플레이트에 잘 당 하나의 셀 (희석 200 μL)를 플레이트. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 플라스크에서 개별 단일 클론 성장. (그림 1D). </li></ol></li></ol> 세포 수의 함수로서 형광 신호 강도 3. 교정 <ol><li> 10 3 0의 밀도 지금 HCT116-L2T이라 형질 HCT116 세포를 플레이트 (2) × 104 3 × 105, × 104 (5), 7 × 104, × 104 9 10 5 세포 / 웰의 각 밀도 삼중의 96 웰 플레이트. </li><li> 배양 5 시간 후, IVIS (10)를 사용하여 형광 강도를 tdTomato 정량화. <ol><li> 소프트웨어를 시작하려면 바탕 화면의 이미지 소프트웨어 아이콘을 클릭합니다. 이미징 시스템을 초기화하기 위해 &quot;초기화&quot;버튼을 클릭합니다. (몇 분 정도 소요) 초기화가 완료되면, &quot;형광&quot;, &quot;사초&quot;노출 시간, &quot;중간&quot;비닝 (binning), &quot;2&quot;F / 정지를 선택, &quot;535&quot;여기 필터,와 &quot;580&quot;방출 필터. </li><li> 이미징 스테이션의 96 웰 플레이트를 놓고 촬영을 시작합니다 &quot;획득&quot;을 클릭합니다. 이미지가 획득 한 후, 도구 팔레트에서 &quot;ROI 도구&quot;버튼을 클릭 슬릿 아이콘 12 × 8을 선택합니다. </li><li> 96 웰 플레이트의 이미지 신호의 영역을 커버하고 측정 탭을 클릭하여 12 × 8 슬릿을 만듭니다. 평방 cm 당 스테 라디안 당의 당 광자 단위로 투자 수익 (ROI) 측정 테이블과 창을 관찰 (광자 / S / SR / cm 2). </li></ol></li><li> 셀의 개수 및 신호 강도를 나타내는 함수 (Y 축)과 동일한 인수 (X 축)와 산점도를 구축. 형광 강도의 단위에 대응하는 세포의 양을 계산 (도 2) (10), 데이터 분석 소프트웨어를 이용하여 회귀 곡선을 계산한다. </li></ol> 간 전이 4. 동물 모델 <ol><li> HCT116-L2T 셀 (70)에 도달하면- 80 % 컨 플루는 비장 주입 약 1 시간 전을 준비합니다. 3 0.53 mM의 EDTA 0.05 % 트립신을 사용하여 세포를 해리 - 5 분 ​​후 cDMEM 동량로 중화. 응집을 방지하기 위해 철저하게 피펫해야합니다. </li><li> 자동 세포 계수기로 세포를 계산합니다. </li><li> 2 × 106 세포 / 100 μL - 1.2의 농도로 1X DPBS에서 세포를 재현 탁. 피펫과 응집을 방지하기 위해 철저하게 세포를 재현 탁해야합니다. </li><li> 때때로 튜브를 재현 탁, 사출까지 얼음에 세포를 유지합니다. </li><li> 생쥐를 마취에 앞서, 단계 13에 기재된 프레 놀핀 혼합물의 500 μL를 주입하여 피하로 수술 전 마취 루스 유체를 제공한다. 통증 (감소 이동성, 구부리고 키, 신랑 실패, 처리 발성)의 징후가 해결 될 때까지 하루에 두 번 추가 프레 노르 핀 혼합물의 동일한 용량을 관리 할 수 ​​있습니다. </li><li> 6 ~ 8 주 마취마취 실에서 산소의 2 % 이소 플루 란과 올드 여성 무 흉선 누드 마우스. 쥐가 꼬리를 곤란하게하여 마취하에 완전히 있는지 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. 비장 주입에 대한 개별 코 콘 각 마취 마우스를 전송합니다. 절개에 앞서, 각 마우스는 무균 수술 드레이프로 피복되어야한다. </li><li> 누드 마우스의 왼쪽 측면에 피부를 통해 외부에서 보이는 보라색 영역으로 비장을 확인합니다. 미세 절제 가위를 사용하여, 바로 비장 위의 피부 상에 8mm 왼쪽 측면 절개를합니다. <ol><li> 다음으로, 복부 벽에 들어 올려 작은 절개를합니다. 내부 장기를 절개 부위로부터 멀리 이동되도록 복강 내로 공기를 허용한다. 약 5 mm의 복벽 절개를 크게한다. </li><li> 부드럽게 면봉으로 절개 주위에 압력을 적용하여 비장을 노출. 필요한 경우, 췌장의 지방 부드럽게 사람이 될 수있다비장을 손상하지 않도록 노출에 도움이 ipulated. </li></ol></li><li> 천천히 노출 비장의 끝으로 27 G 바늘 1 ML의 주사기를 사용하여 세포의 100 μL를 주입. 여분 간 종양을 방지하기 위해, 60 초 - 30 이상에 걸쳐서 천천히 주입한다. </li><li> 종래 주입 세포 현탁액의 유출을 방지하기 위해, 사출의 끝에서 바늘을 제거하는 비장에 microclip 배치. </li><li> 5 분 동안 장소에 microclip를 남겨주세요. </li><li> 주 사후 5 분은 지혈을위한 휴대용 소작 장치를 사용하여 비장 절제술을 수행한다. 전방 측면에서 시작되는 지라 폐문을 해부하다. 대형 선박을 해부하면, 과도한 출혈을 방지하기 위해 소작을 이용하여, 인접하는 지방 조직과 혈관의 전방 측 미리 응집. 참고 : 지혈하는 방법 :가, 소작 직접 출혈 지점을 응고 3 출혈 지점에 압력을가 - 5 분, 또는 5-0 실크 넥타이 출혈 지점을 봉합-결찰. </li&gt; <li> 두 개의 층에 각 마우스의 측면 절개를 닫습니다. 첫째, 하나의 가로 스티치에서 5-0 흡수 꼰 봉합 (예를 들어, vicryl)와 복벽을 닫습니다. 다음에, 하나의 수평 스티치 다시 4-0 흡수성 필라멘트 봉합사 (예 prolene의)을 사용하여 피부를 닫는다. </li><li> 모든 절차 사이의 무균 상태를 유지하기 위해 70 % 이소프로판올을 분사하여 모든 악기를 청소합니다. 참고 : 그들이 마취에서 깨어있는 동안 동물이 따뜻하게되어 있는지 확인합니다. 그들은 외래되고 정상적인 활동으로 돌아갈 때까지 수술 후 모든 쥐를 모니터링합니다. 5 분 - 일반적으로, 회복 시간은 약 3이다. 그들은 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다. </li></ol> 생체 발광 생물 이미징 5. <ol><li> 에 이미지를 수행주 단위로 측정하고 시간이 지남에 따라 생물 발광의 변화를 정량화한다. </li><li> 마취 챔버에 마우스를 놓고 산소의 2 % 이소 플루 란으로 그들을 마취. 쥐가 꼬리를 곤란하게하여 마취하에 완전히 있는지 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. </li><li> 다음으로, 복강 단계 1.4에서 반딧불 루시페린 preprepared 150 μL 각 마우스를 주입. </li><li> 개별 코 콘 이소 플루 란을 투여와 함께 IVIS에서 마우스를 놓습니다. 인접 마우스에 신호를 최소화하기 위해 사이에 스페이서와 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 다섯 마우스의 최대 한번에 이미징 될 수있다. </li><li> 측정 및 생물 발광 강도를 루시페린 주사 후 3 분을 분석 할 수 있습니다. <ol><li> 단계 3.2.1에 설명 된대로 IVIS 초기화 후, &quot;발광&quot;, &quot;일초&quot;노출 시간, 및 &quot;중간&quot;비닝 (binning)을 선택한다. </li><li> imagin을 시작합니다 &quot;취득&quot;버튼을 클릭지. 루시페린 주입 후 일정한 시간 (3 분)에서 각각의 영상을 수행해야합니다. </li><li> 이미지가 획득 한 후, 이미지 창 및 도구 팔레트가 나타납니다. &quot;ROI 도구&quot;를 클릭하고 &quot;1&quot;, &quot;2&quot;, &quot;3&quot;, &quot;4&quot;또는 &quot;5&quot;원 아이콘에서 이미지화 마우스의 수에 대응. </li><li> ,이자 (로아)의 영역을 정의 마우스의 복강에 발광 신호의 신호 영역에 동그라미를 한 다음 복사 효율의 임의의 단위로 투자 수익 (ROI)의 &quot;측정&quot;을 클릭합니다 ((광자 / 초 / cm 2 / 스테 라디안) / (μW / cm 2)). 배경의 추가 투자 수익 (ROI) 원을 가지고 있는지 확인하십시오. </li></ol></li><li> 사주 포스트 분사 이전 동물의 희생에서 개별 종양 식민지의 생물 발광 강도의 실시간 3D 재구성을 사용하여 종양 부담과 분포를 평가하기 위해 IVIS를 사용하여 확산 발광 이미징 단층 촬영 (DLIT)를 수행합니다. <oL&gt; <li> 쥐를 마취 단계 5.2.4에 기술 된 바와 같이, 루시페린을 주입. DLIT 한번에 한 마우스에 대해 수행된다. </li><li> 단계 3.2.1에 설명 된대로 IVIS를 초기화 한 후, &quot;이미지 마법사&quot;, &quot;생물 발광&quot;을 선택하고 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. &quot;DLIT&quot;를 선택하고 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. &quot;반딧불&quot;프로브를 선택하고 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. &quot;마우스&quot;이미지 제목, &quot;자동&quot;노출 매개 변수,보기의 &quot;C-13 cm&quot;필드 및 &quot;0.5 cm&quot;주제 높이를 선택하고 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. 영상을 시작합니다 &quot;획득&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 이미지가 획득 한 후, &quot;DLIT 3D 재건&quot;탭을 선택하고 &quot;분석&quot;탭과 3D 복원 영상을 생성하기 위해 &quot;재구성&quot;을 클릭합니다. </li><li> &quot;도구&quot;와 &quot;3D 애니메이션&quot;을 클릭합니다. 3 차원 애니메이션 창에서 &quot;Y 축에 회전 CCW&quot;를 선택합니다. .mov 인 형식 파일에 &quot;레코드&quot;와 &quot;저장&quot;을 클릭합니다. </li></ol></li></ol> 6. 예 생체 형광 영상 <ol><li> 비장 주사 다음 육주 - 마취, 또는 4에서 제도적 지침에 따라 동안 자궁 경부 전위로 마우스를 희생. </li><li> 간을 수확. 오른쪽 측면에 왼쪽에서 수평 절개를합니다. 픽업과 칼 모양의 프로세스를 잡아, 낫 모양, 간장 정맥과 하대 정맥을 해부하다. <ol><li> hepatoduodenal 인대를 해부하면서 꼬리가 로브를 손상하지 않도록주의하면서 오른쪽 간신 인대의 hepatoduodenal 인대, 그리고 왼쪽 간신 인대를 해부하다. 이 형광도 표시됩니다으로 간을 수확 한 후, 담낭을 제거합니다. 본 추가 여분 간 종양의 기록합니다. </li></ol></li><li> 본 거시적 숫자 및 간 종양의 크기의 노트를 가지고, 그리고 DPBS에 수확 간 놓습니다. 참고 : 종양은 육안으로 거시적으로 볼 수 있습니다흰색으로 종양 (대표 예를 들어,도 4 참조). </li><li> 이전 이미징 시트 배치에, 각각의 간을 부드럽게 종이 타월에 모래 바닥으로 물기를 제거합니다. </li><li> IVIS를 사용하여 각 종양 식민지에서 형광 강도를 측정한다. <ol><li> &quot;형광&quot;, &quot;사초&quot;노출 시간, &quot;중간&quot;비닝 (binning), &quot;2&quot;F / 정지, &quot;535&quot;여기 필터 및 &quot;580&quot;방출 필터를 선택합니다. 영상을 시작합니다 &quot;획득&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 영상을 획득 한 후, 화상 창 도구 팔레트를 찾아. &quot;ROI 도구&quot;를 클릭하고 원 아이콘에서 &quot;1&quot;을 선택합니다. ((방사 효율의 임의의 단위로 투자 수익 (ROI)의 &quot;측정&quot;을 클릭 한 다음 동그라미 이미지에 개별 종양 식민지의 신호 영역의 ROI를 정의하고 광자 / S / cm 2) / 스테 라디안 / (μW / cm 2) ). 배경의 추가 투자 수익 (ROI) 원을 가지고 있는지 확인하십시오. </li></oL&gt; </li><li> 이 구형으로 가정하여 총 종양 볼륨을 계산합니다. 종양의 부피 = 4 ×의 π의 XR 3분의 3 (R = 반지름). splenically 주입 된 세포의 수로 나눈 간 종양의 수와 암 콜로니 형성 세포 (FC)의 비율을 계산한다. </li><li> 단계 3.3에서 선형 근사에서 식민지 당 총 세포 수 (=의 X)를 계산합니다. TD (날) (28) / Y.을 같이 = Y = X (2) 상기 TD 로그로 세포 분열 (= Y)의 개수를 계산 </li></ol>

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현재 보고서에 기재된 동물 모델은 두 가지 방식에 기초한다. 우선, 정착 및 간에서 증식 다른 성향과 전이성 클론을 관찰 할 수있는 기능을 보장하기 위해 높은 이종 모노클로 날 세포주 패널 오히려 설정된 분획 암 세포주 12,13보다 설립되었다. 전이 현상에 대한 단일 클론 방식은 최근의 게놈 데이터 (14)에 의해 정당화되고, 성공적 전이성 10,15,16 프로세스를 모델링 이전에 사용되었다. 둘째, 루시 페라 제 및 tdTomato 마커에 의해 부모 세포주의 이중 라벨은 전이성 성장 생체 내 및 생체 외 모두의 향상된 분석을 제공하기 위해 설립되었습니다. 발광 및 형광 표식 상세한 해부 검사 간 colonizatio의 주파수 또는 효과로 간주 전이성 종양의 양 둘 다의 전위 부량 (허용N) 및 개별 식민지의 크기입니다. 후자 용이 단계 2에 기재된 간단한 보정 절차를 사용하여 셀의 실제 개수로 변환이 <...

차 대장 암 (CRC)에서 간 전이 환자는 예후가 불량 특징으로한다. 12 % - 5 간전 (단계 IV)을 가진 환자가 단지 8의 5 년 생존율이 동안 88 % 3,4 - 기본 nonmetastatic CRC에 대한 5 년 생존율 (단계는 I - III) (75)으로 추정 6. 그러나, 전이성 환자는 전이 및 다른 재발 시간의 서로 다른 숫자를 제시, 이종 그룹을 나타냅니다. 임상 관찰과 (지역 성장 속도에 비례) 단일 전이의 크기 (식민지 능력 또는 식민지의 주파수에 비례 할 수 있음) 전이의 수는 독립적 인 예후 인자 1,7가 있음을 나타냅니다. 성장 능력과 전파 및 간 미세 환경에서 생존 능력 : 즉, 간 식민지화 전이성 클론의 성공은 두 가지 특성에 의존한다. 디자인캡처 크게 간 전이 생물학에 대한 우리의 이해를 향상시키고 잠재적 인 치료 접근 방법의 설계를위한 효과적인 도구를 제공 할 수 있습니다 전이성 클론의 특성을 정량화의 기능이 성공적으로 임상 모델. 실험 간전 모델 이전 8,9보고되었지만, 이들 중 어느 정량적 캡처 생체와 생체 외 모두 개별 전이성 클론의 특성을 설명하는 기능을 제공했다. 여기, 우리는 다른 간 식민지의 효율성과 성장 특성을 가진 종양 클론의 생성을 포함하는 간 전이의 새로운 고급 모델을 제시한다. 우리는 전이성 용량 본질적인 차이가 모노클로 날 세포주의 생성과 루시페라아제 및 tdTomato 형광 단백질 암세포 이중 표지의 조합을 채용. 이 실험 모델에서, 데이터의 개발 것을 나타간 전이는 식민지 주파수의 용어 및 임상 관찰과 일치 배가 시간 (TD)으로 설명 될 수있다. 이 모델의 정량적 특성은 약물 발견 및 진단 목적으로 쉽게 채용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo 이미징 시스템</td><td>캘리퍼 생명 과학</td><td>124262</td><td>In Vivo 이미징 시스템</td></tr><tr><td>LivingImage 4.0 소프트웨어</td><td>캘리퍼 생명 과학</td><td>128165</td><td>이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>VAD-MGX 연구 마취기</td><td>Vetamac</td><td>VAD-MGX</td><td>흡입 마취기</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>세포 배양 시약</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>세포 배양 시약</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신, 액체(10,000 단위 페니실린; 10,000 &뮤; g 스트렙토마이신)</td><td>인비트로젠</td><td>15140163</td><td>세포 배양 시약</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>24020117</td><td>세포 배양 시약</td></tr><tr><td>부프레넥스 주사 (0.3 mg/mL)</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td>부프레노르핀 염산염</td></tr><tr><td>제미니 소작 시스템</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>비장 절제술용 휴대용 소작</td></tr>기 <tr><td>마이크로 클립; 곧장; 70g 압력; 1.5mm 클립 너비; 10mm 턱 길이</td><td>Roboz 수술 기구</td><td>RS-5426</td><td>Hemoclip: 비장 주사 후 지혈 기구</td></tr><tr><td>D-루시페린, 칼륨염</td><td>Goldbio Technology</td><td>LUCK-1G</td><td>루시페린 칼륨염</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 환원 혈청 매체</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>환원 혈청 매체</td></tr><tr><td>TC20 자동 세포 계수기</td><td>BIO-RAD</td><td>1450102</td><td>자동 세포 계수기</td></tr><tr><td>JMP10 소프트웨어&nbsp;</td><td>SAS Institute</td><td></td><td>데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>BD FACSAria II 세포 분류기</td><td>BD Biocsiences</td><td></td><td>세포 분류기</td></tr></tbody></table>

고급 동물의 간에서 대장 전이의 모델 : 이미징 기술 및 전이성 클론의 특성

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

간 및 전이 진행의 느린 속도의 제한된 수의 환자는 성공적으로 치료 로컬로 처리 될 수 1,2- 접근한다. 그러나, 약간의 간 전이의 이질성에 대해 알려져 있으며, 개별 전이성 콜로니의 발달을 평가 할 수있는 동물 모델이 필요하다. 여기서는 정량적 간에서 개별적인 종양 클론의 개발을 시각화하고 성장 동역학 및 정착 효율을 추정하는 능력을 제공 간 전이의 고급 모델을 제시한다. 우리는 안정적으로 루시 페라 제와 tdTomato 다른 성장 특성을 갖는으로 표시 HCT116 인간 대장 암 세포의 단일 클론 파생 상품의 패널을 생성합니다. 비장 절제술 다음 비장 주입,이 클론의 대부분의 간 전이를 생성 할 수 있지만, 다른 주파수의 정착 및 가변 성장률이다. 생체 내 이미징 SYSTE 사용m (IVIS)는, 그것을 시각화 생체 발광 및 생체 형광 이미징 전이 현상을 정량화 할 수있다. 또한, 확산 발광 이미징 단층 촬영 (DLIT)는 생체 내에서 간 전이의 3 차원 분포를 제공한다. 수확 간의 전 생체 내 형광 이미징은 개인 간 전이성 식민지의 정량적 측정을 제공, 간 식민지의 주파수의 평가와 성장 속도론을 허용 전이. 모델 임상 관찰 간전이 비슷하기 때문에, 간 전이와 연관된 유전자를 검출하기위한 간 전이성 질환 전위 융제 또는 보조제 치료를 시험하는 양상이 될 수있다.

이 실험의 목표는. 생체 전이성 종양 부담 직렬 정량화하고 식민 주파수 간 전이 현상의 성장 동역학의 추정의 가능성과 일관된 쉽게 재현 동물 모델을 확립 하였다 2-6도 전설로, 크리에이티브 커먼즈 CC-BY 라이센스 (10)에 따라 이전 출판물에서 제공됩니다. 더블 표지 종양 세포 단일 클론의 생성 첫째, 발광 및 형광 표지 된 모노클로 날 세포주의 패널은 서로 다른 전이 능력을 생성 하였다. 부모의 HCT116의 대장 암 세포에서 성공 발광의 형질 (Luc2) 및 형광 (tdTomato) 단백질에 이어, 16 번 표지 단일 클론은 부모의 HCT1을 희석하여 생성 된1 세포 / 96 웰 플...

전이성 클론이 먼 곳에 군체를 형성할 수 있는 능력은 증식 능력 및/또는 숙주 미세환경에서 상당한 증식 없이 생존할 수 있는 능력에 달려 있습니다. 여기에서는 전이성 클론에 의한 두 가지 유형의 간 집락화를 정량적으로 시각화할 수 있는 동물 모델을 제시합니다.

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

이 접근법의 전반적인 목표는 결장직장암에 의해 생성된 전이성 종양 클론에 의한 간 집락화를 모델링하고 이 모델을 사용하여 간 전이의 진단 및 치료를 개선하는 것입니다. 임상적 관찰은 전이성 질환의 이질성을 나타냅니다. 우리의 모델은 이러한 이질성을 포착하여 올리고전이성 및 다발전이성 질환과 관련된 유전자를 검출할 수 있는 기능을 제공합니다.그리고 이 지식을 전이의 조기 발견 및 치료를 개선하기 위해 사용합니다. 우리 기술의 주요 장점은 결장직장암 환자에서 유래한 이중 표지된 단클론 세포주를 사용하고 생체 내 및 생체 외 모두에서 간 전이의 발달을 관찰할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 전이성 질환 치료로 확장됩니다.이를 통해 전이성 병변의 수와 각 병변의 성장 동역학에 대한 정량적 추정을 통해 모든 잠재적 약물을 테스트할 수 있는 능력을 제공합니다. 루시퍼라제 tdTomato 표지된 HCT116 세포를 생성하고 배지, 시약 및 기기를 준비한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 transspect된 세포를 웰당 다음 밀도로 96웰 플레이트에 3회씩 플레이트화합니다. 5시간 동안 세포를 배양한 후 데스크탑에서 이미지 소프트웨어를 시작하여 IVIS 시스템을 사용하여 tdTomato 형광 강도를 정량화합니다.초기화 버튼을 클릭하여 이미징 시간, 중간 비닝, F/Stop에 대해 2개, 여기 필터에 대해 535, 방출 필터에 대해 580을 초기화합니다. 96웰 플레이트를 이미징 스테이션에 놓고 Acquire를 클릭하여 이미징을 시작합니다. 이미지를 획득한 후 Tool Palette에서 ROI tools를 클릭하고 슬릿 아이콘에서 12x8을 선택합니다.96웰 플레이트의 이미지에서 신호 영역을 커버하는 12x8 슬릿을 만들고 Measurements 탭을 클릭합니다. 초당 광자, 스테라디안당, 제곱센티미터당 광자 단위가 있는 ROI 측정 테이블이 있는 창을 관찰합니다. 비장 주사 약 1시간 전에 세포가 70-80%의 포화도에 도달하면 세포에 0.05%의 트립신과 0.53밀리몰의 EDTA를 추가하여 세포를 해리합니다.세포를 3-5분 동안 배양한 후 동일한 부피의 C-DMEM을 사용하여 트립신을 중화합니다. 뭉침을 방지하기 위해 배양물을 철저히 피펫팅한 다음 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다. 1x DBPS의 부유 세포를 1.2 - 2 x 10의 농도로 100 마이크로리터당 6개 세포로 동결하고 응집을 방지하기 위해 철저히 피펫팅합니다.그런 다음 주입할 때까지 세포를 얼음 위에 두고, 때때로 튜브에 다시 매달아 놓습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 6-8주 된 암컷 흉선 누드 마우스에 진통제를 투여하고 마취한 후, 비장을 왼쪽 옆구리의 피부를 통해 외부에서 보이는 보라색 부위로 확인하고 장기 바로 위의 피부에 8mm 왼쪽 옆구리를 절개합니다. 그런 다음 복벽을 들어 올려 작게 절개합니다.복강으로 공기를 넣어 내부 장기가 절개 부위에서 멀어지도록 합니다. 그런 다음 복벽 절개 부위를 약 5mm로 확대합니다. 주사에 대해 입증된 단계는 절차에 매우 중요합니다.주사 중 종양 세포의 누출은 간 외 전이로 이어질 수 있습니다. 주사는 문맥 혈전증을 예방하기 위해 30-60초 이상 천천히 진행해야 하며, 150만 개 이하의 세포를 사용해야 합니다. 면봉을 사용하여 절개 부위 주위를 부드럽게 눌러 비장을 노출시킵니다.필요한 경우 췌장 지방을 부드럽게 조작하여 노출을 돕고 비장을 손상시키지 않도록 할 수 있습니다. 27게이지 바늘이 달린 1밀리리터 주사기를 사용하여 30-60초 동안 노출된 비장 끝에 100마이크로리터의 세포를 주입합니다. 주사가 끝나면 주사를 제거하기 전에 비장에 마이크로 클립을 삽입하여 주입된 세포 현탁액의 누출을 방지하고 5분 동안 그대로 둡니다.주사 후 5분 후에 휴대용 소작 장치를 사용하여 지혈을 위한 비장 절제술을 시행합니다. 혈관의 근위부를 인접한 지방 조직과 사전 응고하여 앞쪽의 비장 문턱부터 시작합니다. 주사 부위에서 비장 출혈이 발생할 수 있습니다.마이크로 클립은 비장에 적용되어 종양 세포 누출을 방지하고 비장 출혈을 제어합니다. 지혈 방법에는 소작, 3-5분 동안 압력 유지, 필요한 경우 봉합 결찰이 포함될 수 있습니다. 5.0 흡수성 꼰 봉합사와 단일 수평 스티치를 사용하여 복벽을 닫습니다.그런 다음 4.0 비흡수성 모노 필라멘트 봉합사를 사용하여 단일 수평 스티치로 피부를 닫습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 수술 후 동물을 모니터링합니다. 생물 발광 이미징을 수행하려면 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 마취한 후 미리 준비된 반딧불이 루시페린 150마이크로리터를 동물에게 복강내 주사합니다.IVIS에 있는 마우스를 누운 자세로 놓고 동물 사이에 스페이서를 배치하여 인접한 마우스에 대한 신호를 최소화합니다. 루시페린 주입 3분 후, IVIS를 초기화한 후 발광, 1초 노출 시간 및 중간 비닝을 선택합니다. Acquire 버튼을 클릭하여 이미징을 시작하고, 루시페린 주입 후 3분 후에 이미징이 일관되게 수행되도록 합니다.이미지가 획득되고 이미지 창과 도구 팔레트가 나타나면 ROI 도구를 클릭하고 이미징된 마우스의 수에 해당하는 원 아이콘에서 1에서 5 사이의 숫자를 선택합니다. ROI를 정의하려면 마우스의 복강에서 발광 신호의 신호 영역에 원을 친 다음 ROI 측정값을 임의의 방사 단위로 클릭합니다. 배경에 대한 추가 ROI 원을 포함합니다.IVIS를 초기화한 후 확산 발광 영상 단층촬영(DLIT)을 수행하려면 주입 후 4주가 지나면 이미징 마법사, 생물 발광을 선택하고 다음을 클릭합니다. DLIT를 선택하고 다음을 클릭합니다. Firefly 프로브를 선택하고 다음을 클릭합니다.이미지 피사체에 대해 마우스를 선택하고, 시야각에 대해 노출 매개변수 C-13 cm에 대해 자동을 선택하고, 피사체 유형으로 0.5 cm를 선택한 후 다음을 클릭합니다. 그런 다음 Acquire 버튼을 클릭하여 이미징을 시작합니다. 이미지를 획득한 후 분석 탭에서 DLIT 3D 재구성 탭을 선택하고 재구성을 클릭하여 3D 재구성 이미지를 생성합니다.Tools and 3D Animation(도구 및 3D 애니메이션)을 클릭합니다. 그런 다음 3D 애니메이션 창에서 Y축에서 CCW 스핀을 선택합니다. Record and Save(기록 및 저장)를 클릭하여 파일을 mov 형식 파일로 저장합니다.생체 외 형광 이미징을 수행하려면 텍스트 프로토콜에 따라 마우스에서 간을 채취하고 해부한 후 IVIS를 사용하여 각 종양 군체의 형광 강도를 측정합니다. 형광을 선택하면 4초 노출 시간, 중간 비닝, F/Stop에 2, 여기 필터에 535, 방출 필터에 580을 선택할 수 있습니다. Acquire 버튼을 클릭하여 이미징을 시작합니다.이미지를 가져온 후 도구 팔레트에서 이미지 창을 찾습니다. ROI Tools를 클릭하고 원 아이콘에서 1을 선택합니다. ROI를 정의하려면 영상에서 개별 종양 군집체의 신호 영역에 원을 그리십시오.배경의 추가 ROI 원을 얻은 다음 Measurements of the ROI를 임의의 방사 단위로 클릭합니다. 배경의 추가 ROI 원을 확보합니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 따라 계산을 수행합니다.생물 발광(bioluminescence)에서 볼 수 있듯이, 비장 주사 3주 후 HCT116 L2T 클론 P1 및 P2는 클론 O1 및 O2에 비해 종양 부담이 더 컸습니다. 이러한 데이터는 클론 O1 및 O2가 올리고전이성 질환을 모방할 수 있는 반면, P1 및 P2는 간의 공격적이고 광범위한 전이성 집락화를 나타낼 수 있음을 나타냅니다. 비장 주사 후 4주 현재 간의 생체 외 형광을 정량화한 결과, P1 및 P2가 O1 및 O2 간에 비해 형광 강도가 더 높다는 것이 확인되었습니다. 종양 클론의 형광 표지는 간에 있는 개별 전이성 집락의 수와 크기를 식별했습니다.전반적으로 생체 외 형광 이미지는 거시적 결과와 일치했지만 표면 아래에 숨겨진 작은 군체는 형광 이미징으로 더 잘 감지되었습니다. 여기에 묘사된 바와 같이, 전이성 콜로니의 수와 크기는 각 간에서 계수 및 측정되었으며, 각 모노클론에 대해 각 전이성 콜로니에서 생체 외 형광 이미징이 수행되었습니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이 P1의 총 전이 수는 P2, O1 및 O2에 비해 더 높았으며, 개별 집락의 평균 크기는 P1, O1 및 O2보다 P2에서 더 컸습니다. 우리의 모델은 전이의 분자 이질성과 관련된 새로운 설득 유전자를 식별하는 접근 방식을 제공합니다.이러한 유전자는 전이 치료에 대한 새로운 접근 방식의 표적으로 사용될 수 있습니다. 우리의 모델은 또한 현재의 대규모 임상 데이터베이스에서 나오지만 전이성 질환의 맥락에서 아직 기능적으로 정의되지 않은 다양한 단백질 코딩 및 비코딩 유전자의 검증에 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 동물 수술의 섬세함 때문에 어려움을 겪을 것입니다.그러나 연습을 통해 짧은 시간에 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 동물 수술 지침을 따르고, 출혈을 주의 깊게 조절하고, 종양 세포 현탁액의 누출을 방지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

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연구

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Cancer Research

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이게 맹장에 피하 종양의 조각의 cecal 벽이나 이식으로 암 세포 현탁액의 주입 : 두 기술이 모델을 확립하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모델은 대장암의 자연 진행을 공부하고 대장암에 대한 새로운 치료 요원을 테스트하는 데 유용합니다.

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동물 모델은 자주 뼈에 암 전이를 공부하는 활용하고 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 뼈 전이 연구에 대한 종양 접종의 일반적인 두 가지 방법을 설명하고 간략하게이 모델을 모니터링하고 정량화하기 위해 이용 분석의 일부를 설명합니다.

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자발적 전이 마우스 모델: 정소적으로 주입된 대장암 세포의 전이 가능성을 연구하는 플랫폼

간 전이 전임상, 뮤린 모델 hemispleen 주입 기법을 통해 수행 하였다.

간 전이의 전임상 쥐과 모델

문맥 주사를 통해 유선종양 세포를 쥐 간으로 전달하는 수술이 개발되었습니다. 이 모델을 사용하면 간의 종양 세포 유출, 파종, 생존 및 전이성 성장을 포함하여 완전히 면역이 있는 숙주에서 간 전이의 후기 단계를 조사할 수 있습니다.

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

우리는 마우스의 맹장에 종양 세포 또는 유기체를 주입하고이 모델에서 순환하는 종양 세포 (CTCs)를 분리하여 정형 적 대장 직장 종양의 형성을 기술합니다.

대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

이 프로토콜은 환자 유래 정형외 이종이식 모델의 생성을 중급 요뇨세포 암종 세포 또는 직장 내 대장암 세포를 비만 당뇨병/중증 복합으로 주입하여 생성하는 것을 설명합니다. 면역 결핍 (NOD /SCID) 림프절 기질 세포의 영향하에 1 차적인 종양 성장 및 자발적인 전이를 위한 마우스, 이는 인간 전이성 질병의 진행을 모방합니다.

인간 비뇨기과 세포 암 및 대장암 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 환자 유래 직교 이종이식 모델

우리는 임상적으로 관련된 대장암 간 전이(CRLM) 종양 모델과 종양 성장 및 전이에서 간 허혈 재관류(I/R)의 영향을 상세히 기술한다. 이 모델은 간 전이성 성장의 수술 유발 승진의 근본적인 기계장치를 더 잘 이해하는 것을 도울 수 있습니다.

허혈 재관류 손상의 설정에서 전이성 간 종양의 뮤린 모델

기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

결장직장암(CRC) 오가노이드의 포털 정맥 주사는 스트로마가 풍부한 간 전이를 일으킨다. CRC 간 전이의 이러한 마우스 모델은 종양-스트로마 상호작용을 연구하고 아데노-관련 바이러스-매개 유전자 요법과 같은 신규한 스트로마-지시 치료제를 개발하는데 유용한 도구를 나타낸다.

간 전이 스트로마를 연구하기 위해 대장암 오가노이드의 포털 정맥 주사

학습하세요 대장암 간 전이 모델링 방법으로 이중 표지 단일 클론 세포주를 활용하여 전이성 질병의 이질성을 정량적 이미징으로 분석하고 조기 진단 및 치료 전략 개선을 위한 유전자를 식별하는 기술입니다.

고급 동물의 간에서 대장 전이의 모델 : 이미징 기술 및 전이성 클론의 특성

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