나노 입자 신경 독성을 결정하는 대리 바이오 센서로 미세 아교 세포

이 프로토콜의 전반적인 목표는 나노 입자에 대한 미세아교세포 반응을 테스트하기 위한 체외 대리 바이오센서를 설명하는 것입니다. 그런 다음 나노 입자로 자극된 미세아교세포에서 조절된 매체에 노출된 후 신경독성을 결정할 것입니다. 이 방법은 신경 독성에 대한 나노 입자를 얼마나 적극적으로 스크리닝하는지와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 우리 모델이 미세아교세포를 직접 활성화하고 값비싼 장기 설치류 연구를 사용하지 않고도 비밀 요인이 신경독인지 확인할 수 있는 기능을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 미세입자 노출 후 미세아교세포 유도 세포 사멸에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 잠재적인 신경독성 환경 오염 물질을 테스트하는 맥락에서 신경퇴행성 질환의 다른 모델에도 적용할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 상태 매체 여과 단계에서 어려움을 겪을 것입니다. 여과 효율은 나노 입자의 크기, 모양 및 농도에 따라 다를 수 있기 때문입니다. 준비 과정에서 10% FBS와 1% PSN이 보충된 DMEM을 섭씨 37도까지 예열합니다.

그런 다음 18, 25 계대에서 얻은 동결 BV2 미세아교세포를 취하여 섭씨 37도에서 빠르게 해동합니다. 다음으로, 해동된 세포를 10ml의 배지가 들어 있는 75제곱센티미터 벤트 플라스크로 부드럽게 옮기고 플라스크를 배양합니다. 24 시간 후, 배지를 교체하고 70-80 %의 농도에 도달 할 때까지 세포를 계속 성장시킵니다.이 시점에서 배지를 흡인하고 따뜻한 1 ex trypsin EDTA 용액 500 마이크로 리터를 추가합니다.

플라스크를 몇 분 더 배양한 후 스크레이퍼를 사용하여 세포를 5ml의 따뜻한 DMEM으로 모읍니다. 그런 다음 70미크론 스트레이너를 사용하여 플라스크에서 세포를 필터링합니다. 동일한 여과기를 사용하여 이 여과를 세 번 반복하고 50ml 튜브에 세포를 수집합니다.

필터링이 완료되면 세포를 세고 200마이크로리터의 보충된 DMEM에 웰당 8000개의 세포가 있는 검은색 벽의 투명한 바닥 플레이트를 시드합니다. 24시간 배양 후 웰의 배지를 혈청이 없는 DMEM으로 교체하여 미세아교세포를 굶주리게 합니다. 24시간 더 배양한 후 미세아교세포를 활성화한다.

이를 위해 먼저 무혈청 DMEM에서 은 나노 입자를 원하는 작업 농도로 희석합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 배지를 처리 화합물로 교체하십시오. 나노 입자가 없는 희석된 차량 용액의 음성 대조군을 포함해야 합니다.

이제 24 시간 동안 배양을 계속하고 분석을 계속하십시오. 시작하려면 각 플레이트 웰에서 200마이크로리터의 상등액 매체를 수집하고 마이크로 원심분리기 튜브 위에 놓인 나노 입자를 제거하는 필터에 로드합니다. 나노 입자를 여과할 때 나노 입자의 크기, 모양 및 농도가 핵융합 효율의 요인이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

따라서 사전에 여과를 테스트하는 것이 좋습니다. 이제 튜브를 14000g으로 실온에서 15분 동안 회전시킵니다. 그런 다음 나노 입자가 포함된 플로우 스루를 버리고 필터를 새 수집 튜브에 거꾸로 놓습니다.

1000g에서 2분 동안 필터를 거꾸로 돌려 사이토카인을 함유한 농축된 컨디셔닝 배지를 수집합니다. 다음으로, 갓 만든 보충 DMEM을 사용하여 수집량의 부피를 400마이크로리터로 늘리고 튜브를 얼음에 보관합니다. 여과된 매체에서 잔류 황 나노 입자를 제거하려면 무혈청 DMEM에서 블랭크에서 밀리리터당 0.2마이크로그램까지의 농도 범위에서 여과되지 않은 나노 입자 표준물질을 준비합니다.

그런 다음 여과된 샘플 50ml와 각 표준물질을 검은색 벽의 투명한 바닥 플레이트에 분취하고 390 - 410나노미터의 흡광도를 측정합니다. 샘플에서 TNF-알파의 농도를 측정하려면 시판되는 키트에서 남은 부피의 절반을 사용하십시오. 이 분석을 위해 얼어붙은 어류에서 시상하부 세포를 확립합니다.

미세아교세포 배양을 확립하기 위해 설명된 것과 동일한 방법을 사용합니다. 궁극적으로 이를 사용하여 200마이크로리터의 보충된 DMEM에 웰당 5000개의 세포가 있는 검은색 벽의 투명한 바닥 플레이트를 시딩하는 데 사용합니다. 배양 24시간 후, 100마이크로리터의 배지를 제거하고 활성화된 미세아교세포 배양에서 수집된 100마이크로리터의 여과 및 농축 배지로 교체한 다음 표준 조건에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.

다음 날 각 웰에 22마이크로리터의 레사주린 시약을 추가하고 20분 동안 배양을 계속합니다. 그런 다음 다중 모드 분광 광도계를 사용하여 형광 측정을 수행하여 상대 형광 단위 측면에서 세포의 생존 능력을 추정합니다. 개략적인 프로토콜을 통해 microglia 기능은 nanoparticles에 대한 두뇌의 반응을 위한 대리 biosensor로 이용될 수 있습니다.

미세아교세포에 의한 TNF-알파 분비는 은색 나노입자 노출 후 유의하게 증가하였다. 시상하부 뉴런이 은 나노입자 활성화 미세아교세포의 조건화된 매질에 노출되었을 때, 뉴런의 생존율이 현저히 감소했습니다. 원칙적으로은 나노 입자에 노출되면 미세 아교 세포가 M1 전 염증 상태로 활성화되었습니다.

그런 다음 방출된 전염증성 사이토카인은 주변 세포 사멸에 기여합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 나노 입자에 대한 반응을 테스트하기 위한 대리 바이오센서로 미세아교세포를 사용하는 방법과 이 반응이 신경독성인지 여부를 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 3-4일 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라, 미세아교세포 활성화 상태를 표현형화하기 위해 미세아교세포 활성화 후 다른 분비된 사이토카인을 프로파일링하는 것과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.