Name: 본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리 전의 VIVO 생분해 성 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 마이크로 스피어를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 학습하세요 PLGA 마이크로스피어를 이용한 췌도 베타세포 증식 촉진 물질의 지속적 전달 방법입니다. 이 기술은 당뇨병 치료 연구에 활용 가능한 생분해성 고분자 기반 약물 전달 시스템을 제공합니다.

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저자는 이 원고를 비판적으로 읽어준 Bethany Carboneau(밴더빌트 대학교)에게 감사의 뜻을 전합니다. 또한 섬을 분리해 주신 Anastasia Coldren(Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core)과 원심분리기 및 조직 배양 시설을 사용해주신 Alvin C. Powers 박사(밴더빌트 대학 의료 센터)와 David Jacobson 박사(밴더빌트 대학)에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH 보조금 DK20593의 지원을 받는 밴더빌트 당뇨병 연구 및 교육 센터(Vanderbilt Diabetes Research and Training Center)의 섬 조달 및 분석 핵심(Islet Procurement and Analysis Core)의 사용과 관련이 있습니다. 이 연구는 R.C.P.에 대한 미국심장협회 박사후 연구원(14POST20380262)의 지원을 받았으며, M.A.G.에 대한 청소년 당뇨병 연구 재단(1-2011-592) 및 재향 군인회(1BX00090-01A1)의 보조금을 받았습니다.

모든 절차가 승인 밴더빌트 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행 하였다. 형광 1. 레이블 COI (선택 사항) <ol><li> 미세화물을 시각화와 같은 숙신 이미 딜 에스테르 또는 플루오 레세 인 유도체 (단백질에서 예) 자유 급 아민과 반응하여 형광 염료를 선택. 디메틸 술폭 시드 200 ㎕의 (DMSO)에 형광 물질 (COI의 몰에 대해) 8 배 몰 과량을 녹인다. </li><li> 재현 탁 차량 용액 800 μL의 최종 부피 (62.5 NG / μL의 최종 농도)까지 COI 50mg을. 차량 용액 COI의 소스에 따라 달라진다. 참고 : 일반 차량 솔루션은 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 또는 DMSO를 포함한다. </li><li> 단계 1.1에서 형광 / DMSO 용액을 모두 추가하고 COI를 재현 탁. 소용돌이 밤새 4 ° C에서. 대안 적으로, 반응 혼합물에 실온에서 와동4 시간 동안 (RT). </li><li> 라벨 반응에 따라, 탈염 컬럼을 사용하여 여분의 형광을 제거합니다. <ol><li> 탈염 칼럼으로부터 축적 버퍼 드레인 증류수 16 ㎖로 헹군다. 를 통해 모든 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 탈염 컬럼에 형광 표지 된 COI를 추가합니다. 탈 이온수 120 ㎖로 용출하고 통한 흐름을 수집한다. </li><li> 용출 단계를 반복하여 추가로 네 번마다 탈 이온수 1.2 ㎖에 첨가하고, 별도의 샘플 등을 통해 유동을 수집. </li><li> -80 ° C에서 샘플을 통해 수집 된 모든 흐름을 정지하고 24 시간 동안 제조업체의 지침에 따라 동결 건조. </li></ol></li></ol> 2. 물 -에 - 중유 에멀젼 용매 증발 방법을 통해 마이크로 스피어 준비 COI로드 <ol><li> 제 수상 (W1)을 형성 증류수 100 ㎕의 1 mg의 형광 표지 COI 추가. </li><li> 폴리 65 mg을 용해 (락트산 - 코 - 글리콜 ACI라) (50 : 50 락 티드 : 글리콜, 분자량 54,000 - 미세 원심 관에 디클로로 메탄 750 μL에서 69,000). 10 초음파 처리 - (160 W에서) 30 초 완전히 PLGA를 용해한다. 이 유상 (O)를 형성한다. </li><li> 드롭 현명한 방식으로 O 단계로 단계 2.1에서 생성 된 W1 단계의 모든를 추가합니다. W1 / O 상을 형성하기 위해 30 초 동안 20,000 rpm에서 휴대용 균질기를 사용하여 유화시킨다. </li><li> 30 초 동안 20,000 rpm에서 1 %의 15 ㎖ (중량 / 부피) 수성 폴리 (비닐 알콜) (PVA) 용액에 적가 방식으로 W1 / O상의 모든 추가 휴대용 균질화기를 사용하여 유화 . </li><li> 용매를 제거하고, 수성 상을 생성하기 위해 1 시간 동안 회전 증발기를 사용하여 635 mmHg의 진공을 200 ml의 둥근 바닥 플라스크 피사체 단계 2.4에서 생성 된 에멀젼의 모든 전송. </li><li> 수성 단계의 나누어지는 1 ml의 단계 2.5 열네에의 microcentrifuge 튜브에서 발생. 7500에서 마이크로 원심 튜브의 수용액을 원심8 분 XG. 주 :이 단계에서, 미소 나머지 수용액에 존재하고 microcentrifuge 관의 바닥에 집중된다. </li><li> microcentrifuge 관의 바닥에 미소를 방해하지 않도록 조심스럽게, 마이크로 피펫으로의 microcentrifuge 튜브에서 피펫을 수용액 900 μl를 제거합니다. <ol><li> 각 microcentrifuge 관에 물을 탈 1ml를 추가하여 초과 PVA의 미소를 씻으십시오. microcentrifuge 관의 바닥에 미소를 방해하지 않도록 8 분 동안 7,500 XG에 원심 분리기, 다시 조심스럽게, 마이크로 피펫으로의 microcentrifuge 튜브에서 피펫을 수용액 900 μl를 제거합니다. 참고 : 나머지 100 ㎕의 수용액이 생성 된 마이크로 스피어가 포함되어 있습니다. </li></ol></li><li> -80 ° C에서 270 단계에서 생성 된 미세 수성 용액을 동결. </li><li> 에 따른 동결 건조기를 사용하여 동결 건조 된 마이크로 스피어의 제조-20 ° C에서 지침 및 저장. 주 : 완전히 PLGA 미립자를 용해시키고 유리 단백질 (7)의 표준 곡선의 단백질 농도를 상대적으로 판단하여 COI의 적재 효율을 측정한다. </li><li> 네거티브 대조군으로서, (이하 제어 미립자라고도 함) &quot;빈&quot;미소의 배치를 생성한다. 주 : 제어 미립자의 생성 단계 1.2 비히클 용액 800 μL없이 COI 첨가 친수성 COI로드 미립자의 생성과 동일하다. β 세포 미토 겐 분석을위한 COI 로딩 된 PLGA 미립자에 PLGA의 질량 농도 대전 조정 입자. </li></ol> 작은 섬 문화 미디어와 사전 분석 미디어 3. 준비 <ol><li> 본래 마우스 아일렛의 배양에 200㎖의 용지를 준비 : RPMI 11 mM의 글루코오스, 10 % 말 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린 G, 100 μg의 보충 1640 미디어 것은 ml의 스트렙토 마이신 (이하이다라고 /) 문화 미디어를 할 수 있습니다. 주 1 : 소 태아 혈청 (FBS)과 달리, 말 혈청 태반 락토 겐, 증식 분석에서 분석을 교란 β 세포 증식의 유도 없다. 주 2 : PLGA 미립자가 사용 전에 멸균되어 있지 않으므로, 배양액을 항생제 첨가가 미생물 오염을 방지하기 위해 중요하다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브의 전자 피펫과 장소와 섬 문화 매체의 25ml를 제거합니다. 예비 분석 미디어를 생성하기 위해 0.2 mM의 EGTA의 최종 농도로 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 섬 배양 배지의 25 ㎖를 보완. 주 : EGTA의 추가는 약간 섬 아키텍처를 변경하지 않고 섬에서 세포 - 세포 연락처를 풀어. 이 섬의 내부 세포에 도달 할 수 COI을 보장하고 중앙 섬의 괴사를 방지하는 데 도움이됩니다. </li></ol> 본래 마우스 독도 4. 배양 <ol><li> 미리 선택된 균주, 성별, AG에 그대로 섬 격리췌장의 8,9의 일상 콜라게나 소화 다음 마우스의 전자 및 유전자형. 풀 함께 샘플 등으로부터 섬. </li><li> 분취 아일렛 배양액 200 μL의 96 웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 40 아일렛. 물론 당 시각적으로 크기 일치 섬 (샘플 사이의 섬 상당 (IEQ)의 정확한 평가는 필요하지 않습니다). 증발 버퍼를 제공하는 200 ㎕의 멸균 수와 섬에 우물 바로 옆에 빈 우물을 입력합니다. 배양은 95 % 공기 및 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 하룻밤 미디어 아일렛. </li></ol> COI로드 및 제어 PLGA 미소 구의 제 다시 현탁 <ol><li> 밤새 섬 복구 후 동결 건조 COI 로딩 된 PLGA 미립자의 하나의 분취 량을 사전에 분석 배지를 첨가하여 재현 탁 미립자 등의 microcentrifuge 튜브 COI의 최종 농도가 10 ng의 / μL (주어진 양 COI 존재 량이라고 생성 된 마이크로pheres 단계 2.9)에서 산출 된 것입니다. 4 ℃에서 10 초의 긴 펄스를 W (160)에서 10 분 동안 빙수 욕에서 재현 탁 COI로드 미세 초음파 처리. </li><li> 동결 건조 제어 PLGA 미립자의 동일한 질량을 사전에 분석 배지의 동일한 양을 첨가함으로써 재현 탁 제어 PLGA 미립자. 4 ℃에서 10 초의 긴 펄스를 W (160)에서 10 분 동안 빙수 욕에서 재 부유 제어 PLGA 미립자 초음파 처리. </li><li> 시각 미소가 두 커버 글라스 사이에 재현 탁 미소의 2 μl를 피펫 팅에 의해 분산 확인합니다. 표면 형광 또는 시야 현미경에 40X 목표를 사용하여 미소를 시각화합니다. </li><li> 미소 구체의 현저한 응집이 여전히 보이면 4 ° C에서 10 초의 긴 펄스 및 재 부유 미립자의 반복 시각화 W (160)에서 추가로 10 분 동안 빙수 조에서 초음파 처리. </li></ol> COI로드 또는 제어 PLGA 마이크로 스피어와 독도 6. 치료 &lt;/ P&gt; <ol><li> 각 웰은 COI로드 미세 처리 될 때까지 100 ㎕의 최종 부피 및 소정의 최종 농도 미리 분석 미디어 재현 탁 COI 미소 구의 10 NG / μL 희석 분석 매체를 준비한다. 참고 : 단백질의 최적의 최종 농도는이 분석에 사용되는 각각의 COI에 따라 다를 것입니다. 이상적으로는, 최종 농도 범위는 시험된다. </li><li> 웰 각각은 대조군으로 사용되기 위해서는, 단계 6.1에서 COI로드 미립자를 희석하기 위해 사용한 것과 동일한 희석 부피 단계 5.2에서 생성 된 재 부유 제어 PLGA 미립자를 희석하여 제어 분석 매체를 준비한다. 참고 : 제어 분석 매체로 처리 독도는 빈 미소가 실험 결과에 미칠 수있는 영향의 탐지를 가능하게하는 음성 대조군 될 것입니다. </li><li> 조심스럽게에는 독도가 우물에서 빠질 수없는되도록 마이크로 피펫으로 각 우물에서 섬 배양 배지 100 μl를 제거합니다. 조심스럽게 100 μ를 추가분석 매체 또는 각 웰에 제어 분석 배지 100 ㎕의 L. </li><li> 사흘 동안 95 % 공기 및 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 인큐베이션을 섬. </li></ol> 7. 현미경 슬라이드 상에 본래 독도 분산제 <ol><li> 삼일 후, 섬을 제거하지 않도록주의 깊게 우물에서 분석 미디어를 제거하고 폐기 마이크로 피펫을 사용합니다. 조심스럽게 분석 미디어 그들을 씻어 독도에 PBS μL (200)를 추가합니다. 조심스럽게 제거하고 마이크로 피펫으로 PBS를 무시하고 부드럽게 추가 200 μl의 PBS 다시 섬을 씻는다. </li><li> 제거하고 마이크로 피펫으로 PBS를 버리고 0.025 % 트립신 100 ㎕, 2 mM의 EDTA 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 3 분 동안 실온에서 품어. 피펫은 트립신 EDTA 용액 위로 독도가 육안으로 단일 세포로 분산 확인 될 때까지 아래로 매 2 분에 독도 광학 현미경을 사용하여 (세포의 일부 작은 덩어리가 여전히 존재할 수 있습니다). 각각의 웰에 개개의 전체 볼륨을 전송LY labeled-의 microcentrifuge 튜브로. </li><li> 트립신 매개 세포 분리를 중지 각 microcentrifuge 관에 섬 문화 매체의 400 μl를 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 100 XG에 5 분 원심 분리기 샘플의 microcentrifuge 튜브의 바닥에 작은 섬 세포 펠렛합니다. </li><li> 부드럽게 200 μL 신선한 섬 문화 매체에 마이크로 피펫을 이용하여 상층 액과에 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 사이토 원심 분리기를 사용하여, 원심 분리기 청구 현미경 슬라이드에 3 분 140 XG에 독도 해리. </li><li> 실온에서 공기 건조 슬라이드는 10 분 동안, 다음 소수성 마킹 펜으로 해리 섬 주위에 상자를 그립니다. </li><li> 실온에서 10 분 동안 75 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 세포를 고정한다. 4 % PFA를 제거하고 부드럽게 PBS 75 μL에 두 번 세포를 씻으십시오. 세정 후, 75 ㎕의 0.2 % 트리톤 X-100의 PBS에서 10 분간 세포와 Permeabilize 하시려면. 그런 다음, 75 μl의 PBS로 세포를 씻어. 주의 : PFA는 알레르기 발암 및 독성 것으로 알려져있다. </li></올&gt; 8. 면역 형광 인슐린에 대한 해리 독도 라벨링 및 세포 증식 마커, 사료된다 <ol><li> 100 슬라이드 용량 현미경 슬라이드 상자의 바닥이 젖은 종이 타월을 배치하여 습기 챔버를 준비합니다. </li><li> 장소는 습기 챔버에서 아래로 평면 (위를 향 세포)를 슬라이드. 마이크로 피펫을 이용하여 이전의 세척 단계에서 PBS를 흡입 및 차단 용액 75 μl를 첨가하여 표지 용 시료 준비 (5 % 정상 당나귀 혈청 PBS에서 (NDS)) 시료에 대한 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위해 각 슬라이드. RT에서 1 시간 동안 차단 용액에 슬라이드를 부화. </li><li> 부드럽게 흡 마이크로 피펫을 사용하여 기니아 피그 인슐린과 항 토끼 항 사료된다 항체를 포함하는 차 항체 용액 75 μL를 추가 차단 용액, PBS에서 5 % 1 μg의 NDS / mL로 희석 하였다. 1 시간 동안 실온에서 품어. 참고 : 세포 증식의 대안 마커는 세포 핵 항원 (PCNA)과 phosph 증식 포함ohistone H3 (PH3), </li><li> 부드럽게 마이크로 피펫 차 항체 용액을 흡인하고 75 ㎕의 PBS로 세포를 헹군다. 대기음 PBS는 마이크로 피펫을 사용하여 세포를 두 번 이상, 75 μL PBS와 각 시간을 씻어. 실온에서 1 시간 동안 차단 솔루션 2 μg의 / ㎖로 희석 75 μl를 방지 기니 돼지 Cy5에 차 항체 및 항 - 토끼를 Cy3 차 항체와 각 샘플을 품어. 참고 : 이미 미소를 라벨에 사용 된 동일하거나 스펙트럼 중복 형광으로 표지 된 이차 항체를 사용하지 마십시오. </li><li> 마이크로 피펫을 사용하여 실온에서 3 분 동안 PBS에서 300 nm의 DAPI의 75 μL에 품어 대기음 이차 항체 솔루션입니다. 대기음 DAPI는 마이크로 피펫을 사용하여 5 분 동안 탈 이온수로 헹군다. </li><li> 조심스럽게 마이크로 피펫을 사용하여 샘플에서 물을 대기음. 드롭 유리 커버 슬립에 antifade 시약을 포함하는 빠른 건조 장착 용액 (약 100 μl를) 발견. 오, 아래 현미경 슬라이드 샘플 측 전환장착 솔루션 NTO. 부드럽게 거품을 제거하고 부드럽고 깨끗한 티슈로 물기를 닦아 피펫 팁을 사용하여 슬라이드에 대해 커버 슬립을 누릅니다. 커버 슬립 실온에서 하룻밤 건조하도록 허용합니다. </li></ol> 9. 이미지 수집 및 분석 <ol><li> 이미지 획득을위한 부착 된 카메라와 함께 표면 형광 현미경을 사용합니다. 각 형광의 경우, 최적의 노출 시간 (- 사료된다 인슐린 80 밀리, 250 밀리 초 DAPI에 대한 일반적으로 20 밀리 초 40)을 결정한다. 이미지 수집 매개 변수를 모든 샘플에 대해 동일해야합니다. </li><li> 각 샘플의 경우, 수동으로 3,000 인슐린 양성 세포 수를 계산하고 그의 또한 사료된다 양성 얼마나 많은 계산합니다. 만 잘 정의하고 명확하게 보이는 핵이 인슐린 양성 세포를 계산합니다. 인슐린 양성 세포의 총 수에 의해 사료된다 양성 / 인슐린 양성 세포의 수를 나누고 100을 곱하여 샘플마다 β 세포 증식의 비율을 계산한다. </li><li> D 후,β 세포의 증식에 유의 한 차이는 제어 및 일방향 ANOVA 시판 통계 소프트웨어를 사용과 결과를 분석함으로써 실험 샘플 사이에 존재하는 경우, 각 샘플은 β 세포 증식의 비율 etermining 결정. </li></ol>

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문화의 β 세포 증식의 연구는 일반적으로 여러 가지 어려움에 의해 방해된다. 우선, β 불멸화 세포주 라이브 아일렛 내인성 β 세포에서 발견 된 것보다 더 높은 정도의 증식을 특징으로한다. 또한 이러한 불멸화 세포주 정상 β 세포 기능에 중요한 일반 아키텍처 부족하다. 이 두 가지 사실이 결과는 생체 내에서 또는 전체 섬에서 시험했을 때 성립됩니다 불후의 β 세포 라인을 사용하여 얻은 경우 어려운 결정 할 수 있습니다. 작은 섬 구조가 유지 β 세포 증식이 생체 내에서 발견되는 것과 비교할 바와 같이 갓 절연 그대로 마우스 아일렛을 사용하는 우리의 설명 프로토콜은 이러한 문제를 회피. 그대로 독도를 배양 한 가지 중요한 관심사는 섬 코어 내에서 세포가 저산소증에 의한 괴사를 받게 될 것이다 또는 rhCTGF에 노출되지 않습니다 가능성이다. 이 때문에, 최종0.1 밀리미터 EGTA의 농도는 섬 아키텍처를 방해하지 않고 세포 - 세포 연락처를 풀어...

췌장 β 세포는 몸의 유일한 인슐린 생산 세포이며 혈당 항상성을 유지하는 것이 중요하다. 건강한 사람이 충분한 β 세포 질량을 적절히 혈당을 조절하는 역할을하지만, 당뇨병을 가진 개인이 불충분 β 세포 질량 및 / 또는 1,2- 기능을 특징으로한다. 이 β 세포 증식을 유도하여 궁극적으로 β 세포 질량을 증가시키고 당뇨병 3 개인 글루코스 항상성을 복원 할 수 있도록 제안되어있다. 효과적인 치료법이 개발되기 전에 그러나, 평가, 그대로 섬에 잠재적 인 β 세포 증식 화합물의 확인이 필요합니다. 당뇨병을 가진 개인에 사체 인간의 독도의 이식은 몇 시간 동안 혈당 항상성을 복원되지만 가용성이 실험 절차의 성공은 섬의 후방에 이식 가능한 인간 섬의 부족에 의해 베타 세포 사멸에 의해 방해된다어 이식 4. 에도 인슐린 생성 세포의 증식을 유도하는 인자를 발견하여, 주요 문제는 여전히 생체 관련 사이트에 이들 인자를 전달 존재한다. β 세포 증식 화합물의 지속 로컬 배달을 위해 하나의 전략은 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜) 산 (PLGA)입니다. PLGA는 FDA에서 사용의 역사는 높은 안전성, 생분해 성 및 확장 릴리스 역학 5 때문에 약물 전달 제품을 승인했다. 즉, PLGA는 생체 내에서 자연적으로 또는 체내에서 대사를 발생하는 젖산 및 글리콜 산으로 배양 중 물로 가수 분해를 통해 락 타이드와 글리콜 라이드의 공중 합체이다. 캡슐화 된 약물 화합물의 확산 및 / 또는 변형 - 방출 조절기구 모두 주위 환경에 방출 될 수있다. COI의 캡슐화 unencapsula 비교 시약의 생체 이용률을 개선 효소 분해에 대한 보호를 제공테드 COI 5. 우리는 PLGA 미세 문화에 그대로 섬에 후보 화합물을 관리하는 데 사용 될 수 있으며, 궁극적으로 생체 내에서하는 것이 좋습니다. 이식 프로토콜을 탐험하기 전에 생체을 섬에 β 세포 분열 촉진 물질을 관리하는 PLGA의 효능을 테스트하는 것은 매우 중요하다. 현재 살아있는 동물의 β 세포 증식을 측정하는 기술도 없다. 실험 따라서 immunolabeling에 대한 pancreata의 다음 해부 및 가공과, 동물을 사는 이들 화합물의 투여를 필요로 생체 내에서 잠재적 인 증식 성 화합물의 효과를 평가합니다. 이러한 프로토콜은 비싸고 힘들고, 그리고 그들이 아일렛 도달 할 어떤 보장없이 전신적으로 투여되는 화합물을 필요로한다. 반대로, 여러 β 불멸화 세포주 배양 인슐린 생성 세포의 연구에 사용할 수 있지만, 이들 세포주는 섬 구조와 environmen 부족t는 유기체 (6) 생활에서 발견. β 불멸화 세포주는, 따라서, 생체 내에서 내인성 β 세포 복제보다 훨씬 높은 수준을 갖는 증식을 유도하는 화합물의 분석이 복잡 특징으로한다. 이 연구에서 우리는 성인 쥐에서 분리 된 그대로 독도를 사용하는 프로토콜을 설명합니다. β 세포주 달리 그대로 섬 정상 섬 구조를 유지한다. 마찬가지로, 직접 배양 그대로 섬에 증식 화합물을 투여하는, 생체 내에서 실시한 실험 달리 상당히 정확하게 β 세포 증식을 측정하기 위해 필요한 시약의 양을 감소시킨다. 현재의 연구는이 예에서는, COI를 관리 할 PLGA를 활용, 재조합 인간의 결합 조직 성장 인자 (rhCTGF). 이 일에 화합물의 지속적인 방출을 허용 여기에 기술 된 방법은 배양 섬에 원료 화합물의 관리를 통해 상당한 이점을 부여E 매질. 특히,이 시험은 단백질이 그대로 섬에 관심 항체의 다양한 관리하도록 변형 될 수있다. α 세포를 포함하는 다른 내분비 세포 유형에 효과가 또한 분석 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td> 형광단 DMSO 디메틸 설폭사이드<td>로 COI 라벨링용</td></tr><tr><td></td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>1단계에서 형광단 용해용</td></tr><tr><td>일회용 PD-10 탈염 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>1</td></tr><tr><td>단계에서 사용되는 탈염 컬럼Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), 에스테르 말단, 분자량 54,000 - 69,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>739960</td><td>2단계에서 미세구 생성에 사용</td></tr><tr><td>폴리(비닐 알코올) 분자량 89,000 - 98,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td>2단계에서 미세구 생성에 사용</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879-020</td><td>무수 포도</td></tr><tr><td>당 배양용</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>섬 매체 보충제</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>섬 매체용 항생제</td></tr><tr><td>Normal horse serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>섬 매체</td></tr><tr><td>보충제 96-웰 조직 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>섬</td></tr> <tr><td>배양용에틸렌 글리코-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',-테트라아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>사전 분석 섬 매체용 보충제</td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>현미경 슬라이드에 세포 회전용</td></tr><tr><td>EZ Single Cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710020</td><td>현미경 슬라이드</td></tr><tr><td>에 세포 회전용에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td> 섬<td>을 해리하는 데 사용</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>세포 고정용</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>세포 투과용</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td> 면역형광<td>용 차단 시약</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 항체</td><td>abcam</td><td>ab15580</td><td>Ki67 면역</td></tr>형광용 <tr><td>Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>인슐린 면역형광</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Ki67 면역형광</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>인슐린 면역형광</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td> 면역형광 <td></td></tr><tr><td>Aqua-Mount</td><td>의 핵 시각화용Lerner Laboratories</td><td>13800</td><td>속건성 마운팅 미디어</td></tr><tr><td>FreeZone -105 &deg; C 4.5 리터 캐스케이드 벤치탑 동결 건조 시스템</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>미세구의 동결 건조를 위해</td></tr></tbody></table>

본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리<em&gt; 전의 vivo</em&gt; 생분해 성 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 마이크로 스피어를 사용하여

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

생체 재료의 개발은 췌장 β 세포를 포함한 세포 및 조직 유형의 다양한 표적 약물 전달의 가능성을 증가 현저했다. 또한, 생체 재료 입자, 하이드로 겔 및 비계는 독특한 기회를 제공하는 것은 유지 관리하려면 제어 약물 전달은 β 세포를하는 문화와 이식 조직 모델에서. 이러한 기술은 본래 섬과 병진 관련 시스템을 이용하여 후보 β 세포 증식 인자에 대한 연구를 허용한다. 또한, 배양 시스템에서 β 세포 증식을 자극 후보 인자의 효과 및 타당성을 결정하는 것은 생체 내 모델 전진 전에 중요하다. 여기서 우리가 관심있는 생분해 성 화합물 (COI) -loaded 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 인 시츄 이형 O에서 유지의 효과를 평가하기위한 목적으로 (PLGA) 마이크로 스피어와 본래 마우스 아일렛 배양 공동하는 방법을 서술β 세포 증식에 ​​F 분열 촉진 인자. 이 기술은 상업적으로 입수 가능한 시약을 사용하여 원하는화물을 함유하는 PLGA 미립자를 생성하는 방법에 대해 상세히 설명한다. 설명 된 기술은 예를 들어 재조합 인간 결합 조직 성장 인자 (rhCTGF)를 사용하지만, COI 다양한 용이하게 사용될 수있다. 또한,이 방법은 β 세포 증식을 평가하는 데 필요한 시약의 양을 최소화하기 위하여 96 웰 플레이트를 사용한다. 이 프로토콜은 용이하게 다른 생체 물질 및 세포 생존 및 분화 상태와 같은 다른 내분비 세포의 특성을 이용하도록 구성 될 수있다.

도 1은 위의 프로토콜을 사용하여 생성 된 마이크로 스피어의 시각적 표현이다. 여기에 설명 된 프로토콜은 다양한 크기의 rhCTGF로드 미소를 산출한다. 약간의 미소가 더 큰 (그림 2)있을 수 있지만 마이크로의 가장 큰 부분은 직경이 1 ㎛ 내지 10이됩니다. 원하는 경우, 미세 크기 조정 및 균질화 속도 및 시간, 사용되는 계면 활성제의 농도는, 각각 물 / 오일 / 물 (10)의 상대적인 위상 볼륨으로 제조 파라미터에 기초하여 최적화 될 수있다. PLGA 미세 및 후속 immunolabeling으로 처리 그대로 섬의 분산에 따라, 세포 (그림 3) 사이에있는 라벨없는 샘플의 영역을 참조하는 것이 일반적입니다. 배양 ...

여기에서는 β세포 증식에 대한 후속 면역형광 분석을 통해 배양에서 온전한 마우스 섬에 관심 부하가 있는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 미세구의 화합물을 생성하고 관리하는 방법론을 제시합니다. 이 방법은 후보 β세포 유사분열제의 효능을 측정하는 데 적합합니다.

본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 생분해 성 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 마이크로 스피어를 사용하여

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 Poly(lactic-co-glycolic Acid) 또는 PLGA 미세구체를 사용하여 배양된 온전한 췌도에 관심 화합물을 전달함으로써, 개별 화합물이 성인 췌장 베타 세포 증식에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이 방법은 온전한 췌도에 국소적으로 서서히 방출되는 방식으로 전달되는 다양한 화합물을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 본 방법의 주요 장점은 다른 전달용 생체 재료, 관심 화합물 및 엔드포인트 분석법에 쉽게 적용할 수 있다는 점입니다.이 방법은 생체 내(in vivo)에서 채택된 췌도 이식과 함께 관심 화합물을 전달할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. PLGA 미세구체를 만드는 방법은 제 실험실의 대학원생인 Taylor Kavanaugh가 시연하겠습니다. 우선, 100 µL의 탈이온수에 1 mg의 형광 표지된 관심 화합물을 첨가하여 첫 번째 수상(water phase)을 형성하는 것으로 시작하십시오.다음으로, 신틸레이션 바이알(scintillation vial)에 PLGA 65 milligrams를 dichloromethane 750 microliters에 녹인 후, PLGA를 완전히 용해시키기 위해 혼합물을 160 watts에서 10 내지 30초 동안 초음파 처리합니다. 이렇게 하여 오일상을 형성합니다. 첫 번째 수상 전체를 오일상에 한 방울씩 천천히 첨가합니다.그 다음 핸드헬드 호모게나이저를 사용하여 20,000 rpm에서 30초 동안 용액을 유화시켜 첫 번째 수-오일 상을 형성합니다. 이어서 첫 번째 수-오일 상 전체를 15 milliliters의 1% PVA 용액에 한 방울씩 첨가하고 앞서 시연한 것과 같이 유화시킵니다. 다음으로, 유화액 전체 부피를 200 milliliter 둥근 바닥 플라스크로 옮기고 회전 증발기를 사용하여 635 millimeters of mercury 진공 상태에서 1시간 동안 용매를 제거하여 수성 상을 생성합니다.수성 상 1 mL를 14개의 마이크로원심분리 튜브에 각각 분주하고, 원심분리를 통해 마이크로스피어를 펠렛화합니다. 원심분리가 끝난 후, 마이크로피펫을 사용하여 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 각 튜브에서 900 µL의 수성 용액을 제거합니다. 탈이온수 1 mL로 마이크로스피어를 세척한 후, 상층액 900 µL를 조심스럽게 제거합니다.그런 다음 남은 100 µL의 상청액에 900 µL의 탈이온수를 추가합니다. 이어서 짧게 볼텍싱하고 초음파 처리하여 펠렛을 재현탁합니다. 관심 있는 실험 동물로부터 섬을 분리한 후, 육안으로 크기가 일치하는 40개의 섬을 200 µL의 섬 배양이 담긴 96-well 조직 배양 플레이트의 한 웰에 접종합니다.다음 날 아침, 관심 화합물의 최종 농도가 튜브 내에서 10 nanograms per microliter가 되도록 마이크로스피어 한 aliquot을 사전 분석 배지에 재현탁하고, 4 °C의 얼음물 배스에서 160 watts로 10초 간격의 펄스를 사용하여 10분 동안 마이크로스피어를 초음파 처리합니다. 그다음, islet을 건드리지 않고 각 웰에서 islet 배양액 100 microliters를 조심스럽게 제거하고, 마이크로스피어가 포함된 분석 배지 100 microliters를 넣어 배양합니다. 3일 후, islet을 방해하지 않고 모든 웰에서 분석 배지를 조심스럽게 버리고, 200 microliters의 PBS로 islet을 두 번 부드럽게 세척합니다.췌도(Islets)는 96-웰 플레이트에 느슨하게 부착됩니다. 따라서 췌도가 실수로 떨어져 나가 버려지지 않도록 각 웰에서 배지와 PBS를 조심스럽게 제거하는 것이 중요합니다. 두 번째 세척 후, 실온에서 100 µL의 trypsin EDTA 용액에 췌도를 3분 동안 조심스럽게 침전시키며, 2분이 지난 후 가볍게 파이펫팅합니다.각 웰의 전체 부피를 개별 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 각 튜브에 400 µL의 islet 배양 배지를 추가하여 해리를 중단시킵니다. 원심분리를 통해 마이크로스피어로 처리된 islet을 수집한 후, 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 200 µL의 신선한 islet 배양 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 사이토원심분리기를 사용하여 해리된 islet을 전하 처리된 현미경 슬라이드 위에 스핀 다운합니다.공기 건조 후, 소수성 마킹 펜으로 islet 주변에 상자를 그리고, 실온에서 4% 파라포름알데히드 75 µL로 10분 동안 세포를 고정한 다음, 75 µL의 PBS로 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, PBS에 희석된 0.2% Triton X-100 75 µL를 사용하여 10분 동안 세포를 투과화하고, 마지막으로 75 µL의 PBS만으로 세척합니다. islet을 면역 라벨링하려면, 먼저 슬라이드의 세포 면이 위로 향하게 하여 습윤 챔버에 넣고 PBS를 제거하십시오.다음으로, 상온에서 75 µL의 normal donkey serum을 사용하여 비특이적 결합을 차단합니다. 1시간 후, 혈청을 제거하고 목적의 1차 항체 75 µL로 교체하여 상온에서 다시 1시간 동안 반응시킵니다. 배양이 끝나면 1차 항체 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 375 µL의 PBS로 샘플을 세척합니다.그런 다음, 해당 면역형광 표지 2차 항체 75 µL를 섬(islet)과 함께 처리하여 빛이 차단된 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면, 2차 항체 용액을 Dappy 75 µL로 교체하여 3분간 처리한 후, 탈이온수로 5분 동안 세척합니다. 세척이 끝나면, 항퇴색 시약이 포함된 속건성 봉입제(mounting solution) 100 µL 한 방울을 유리 커버슬립 위에 떨어뜨리고, 현미경 슬라이드의 시료 면이 봉입제를 향하도록 뒤집어 덮습니다.마이크로스피어의 가장 큰 비율은 직경 1-10 µm 사이가 되겠지만, 일부 마이크로스피어는 더 클 수도 있습니다. 손상되지 않은 PLGA 마이크로스피어로 처리된 Islet을 분산시킨 후 면역표지법을 수행하면, 세척 단계에서 완전히 제거되지 않은 온전한 마이크로스피어로 인해 세포 사이에 표지가 없는 샘플 영역이 관찰되는 경우가 흔히 발생합니다. 이미지 획득 후, Ki67 및 인슐린 양성 세포의 비율은 소프트웨어 이미지 분석을 통해 정량화하거나, 표지된 세포의 총 수를 수동으로 계수하여 측정할 수 있습니다.앞서 시연한 것과 같이 온전한 islet을 재조합 인간 결합조직 성장인자 PLGA 미세구체로 3일 동안 처리하면 베타 세포 증식이 증가하며, 이는 미세구체 생성 과정에서 단백질의 기능이 상실되지 않았음을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 1주일 이내에 결과를 얻을 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때, 실험에서 베타 세포 증식에 미치는 영향은 관심 화합물과 생성된 미세구체의 정확한 방출 동역학에 따라 달라질 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차를 마친 후, 특정 화합물이 생체 내에서 베타 세포 증식을 유도할 수 있는지와 같은 다른 질문을 해결하기 위해 화합물이 적재된 미세구체를 온전한 췌도와 함께 공동 이식하는 등의 다른 방법을 수행할 수 있습니다. PLGA는 FDA 승인을 받은 장치 및 약물 전달 시스템에 사용된 이력이 있으므로, 특정 조직에 치료 화물을 장기간 전달하려는 연구자와 임상의에게 적합한 선택지입니다. 이 영상을 시청한 후에는 화합물이 적재된 PLGA 미세구체를 제조하고 이를 배양된 온전한 췌도에 투여하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 적절한 개인 보호 장구를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

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생명공학

우리는 여기에서 제2형 당뇨병의 마우스 모델, Leprdb에서 섬을 분리하기 위한 프로토콜과 2개의 광자 현미경을 사용하는 온전한 섬에서 인슐린 분비를 측정하기 위한 라이브 셀 분석의 세부 정보를 제시합니다.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

이 프로토콜은 murine islet isolation과 decellularized scaffold상의 seeding을 증명합니다. Scaffold-supported 랑게질을 streptozotocin (STZ) 유도 당뇨병 생쥐의 부고환 지방 패드에 이식 하였다. 아일 레트는 이식 부위에서 생존하고 고혈당 상태를 역전시켰다.

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

마우스에 독도의 omental 이식 하는 방법을 소개 합니다. 격리 된 독도 히드로와 혼합 하 고 혼합 당뇨 마우스의 omental 주머니에 배치 됩니다. 그리고, 혈액 포도 당 감시 면역 조직화 학적인 분석을 수행 합니다.

마우스에 Omentum 작은 섬 이식 하는 방법

췌 장 섬 이식 타입-1 당뇨병에 normoglycemia를 달성 하는 방법입니다. 이 문서는 당뇨병 쥐의 정상적인 포도 당 수준을 유지 하는 intraportal 경로 통해 이식 기술에 초점을 맞추고.

Intraportal 이식 마우스 모델에서 췌 장 독도의

여기, 우리는 히드로 기반 세포 치료, 섬 이식의 예에 의해 그림의 vivo에서 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 제시. h Omental 매트릭스 섬 작성 (귀환) 이식 혈관, 적절 한 변화 환경에서 engraftment를 극대화 하기 위해 가까이 omental 레이어 사이 셀 하이드로 겔 혼합물의 주입 수 있습니다.

내부 Omental 작은 섬이 식을 사용 하 여 h Omental 매트릭스 섬 작성 (유도)

이 프로토콜에서, 뮤린 아일렛 분리 및 인추니얼 피하 백색 지방 조직내로이식하는 방법이 기재되어 있다. 분리된 합성 뮤린 섬은 지하 막 하이드로겔을 사용하여 뮤린 수용자로 이식된다. 수령인의 혈당 수준을 모니터링하고, 아일렛 이식의 학력 분석이 수행됩니다.

뮤린 아일렛의 인과 피하 백색 지방 조직 (ISWAT) 이식 모형

여기서 우리는 마우스에서 임상적으로 관련이 있지만 기술적으로 도전적인 수술 절차 인 포털 내 섬 이식을 성공적으로 수행하는 세련된 수술 절차를 제시합니다.

마우스에서 간내 섬 이식 중 주입 후 포털 정맥 출혈 최소화

이 연구는 마우스 췌장에서 기능성 원차 섬과 선반세포를 효율적으로 추출하는 단순화된 방법을 개발하여, 급성 췌장염 유발 당뇨병의 발병 기전에서 세포 간 소통을 연구하는 귀중한 도구를 제공하였습니다.

마우스에서 1차 섬과 1차 췌장 아시나세포를 동시에 분리하는 간단하고 신속한 방법

우리는 인간 줄기세포에서 유래한 췌장 줄기세포 섬을 면역결핍 쥐에 근육 내 이식하여 생체 내 이식과 후속 분석을 위한 최소 침습 프로토콜을 제공합니다.

쥐에서 인간 다능성 줄기세포 유래 췌장 내분비세포의 근육 내 이식

학습하세요 PLGA 마이크로스피어를 이용한 췌도 베타세포 증식 촉진 물질의 지속적 전달 방법입니다. 이 기술은 당뇨병 치료 연구에 활용 가능한 생분해성 고분자 기반 약물 전달 시스템을 제공합니다.

본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리

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