본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리

본 프로토콜의 전반적인 목표는 Poly(lactic-co-glycolic Acid) 또는 PLGA 미세구체를 사용하여 배양된 온전한 췌도에 관심 화합물을 전달함으로써, 개별 화합물이 성인 췌장 베타 세포 증식에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이 방법은 온전한 췌도에 국소적으로 서서히 방출되는 방식으로 전달되는 다양한 화합물을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 본 방법의 주요 장점은 다른 전달용 생체 재료, 관심 화합물 및 엔드포인트 분석법에 쉽게 적용할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 생체 내(in vivo)에서 채택된 췌도 이식과 함께 관심 화합물을 전달할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. PLGA 미세구체를 만드는 방법은 제 실험실의 대학원생인 Taylor Kavanaugh가 시연하겠습니다. 우선, 100 µL의 탈이온수에 1 mg의 형광 표지된 관심 화합물을 첨가하여 첫 번째 수상(water phase)을 형성하는 것으로 시작하십시오.

다음으로, 신틸레이션 바이알(scintillation vial)에 PLGA 65 milligrams를 dichloromethane 750 microliters에 녹인 후, PLGA를 완전히 용해시키기 위해 혼합물을 160 watts에서 10 내지 30초 동안 초음파 처리합니다. 이렇게 하여 오일상을 형성합니다. 첫 번째 수상 전체를 오일상에 한 방울씩 천천히 첨가합니다.

그 다음 핸드헬드 호모게나이저를 사용하여 20,000 rpm에서 30초 동안 용액을 유화시켜 첫 번째 수-오일 상을 형성합니다. 이어서 첫 번째 수-오일 상 전체를 15 milliliters의 1% PVA 용액에 한 방울씩 첨가하고 앞서 시연한 것과 같이 유화시킵니다. 다음으로, 유화액 전체 부피를 200 milliliter 둥근 바닥 플라스크로 옮기고 회전 증발기를 사용하여 635 millimeters of mercury 진공 상태에서 1시간 동안 용매를 제거하여 수성 상을 생성합니다.

수성 상 1 mL를 14개의 마이크로원심분리 튜브에 각각 분주하고, 원심분리를 통해 마이크로스피어를 펠렛화합니다. 원심분리가 끝난 후, 마이크로피펫을 사용하여 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 각 튜브에서 900 µL의 수성 용액을 제거합니다. 탈이온수 1 mL로 마이크로스피어를 세척한 후, 상층액 900 µL를 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 남은 100 µL의 상청액에 900 µL의 탈이온수를 추가합니다. 이어서 짧게 볼텍싱하고 초음파 처리하여 펠렛을 재현탁합니다. 관심 있는 실험 동물로부터 섬을 분리한 후, 육안으로 크기가 일치하는 40개의 섬을 200 µL의 섬 배양이 담긴 96-well 조직 배양 플레이트의 한 웰에 접종합니다.

다음 날 아침, 관심 화합물의 최종 농도가 튜브 내에서 10 nanograms per microliter가 되도록 마이크로스피어 한 aliquot을 사전 분석 배지에 재현탁하고, 4 °C의 얼음물 배스에서 160 watts로 10초 간격의 펄스를 사용하여 10분 동안 마이크로스피어를 초음파 처리합니다. 그다음, islet을 건드리지 않고 각 웰에서 islet 배양액 100 microliters를 조심스럽게 제거하고, 마이크로스피어가 포함된 분석 배지 100 microliters를 넣어 배양합니다. 3일 후, islet을 방해하지 않고 모든 웰에서 분석 배지를 조심스럽게 버리고, 200 microliters의 PBS로 islet을 두 번 부드럽게 세척합니다.

췌도(Islets)는 96-웰 플레이트에 느슨하게 부착됩니다. 따라서 췌도가 실수로 떨어져 나가 버려지지 않도록 각 웰에서 배지와 PBS를 조심스럽게 제거하는 것이 중요합니다. 두 번째 세척 후, 실온에서 100 µL의 trypsin EDTA 용액에 췌도를 3분 동안 조심스럽게 침전시키며, 2분이 지난 후 가볍게 파이펫팅합니다.

각 웰의 전체 부피를 개별 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 각 튜브에 400 µL의 islet 배양 배지를 추가하여 해리를 중단시킵니다. 원심분리를 통해 마이크로스피어로 처리된 islet을 수집한 후, 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 200 µL의 신선한 islet 배양 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 사이토원심분리기를 사용하여 해리된 islet을 전하 처리된 현미경 슬라이드 위에 스핀 다운합니다.

공기 건조 후, 소수성 마킹 펜으로 islet 주변에 상자를 그리고, 실온에서 4% 파라포름알데히드 75 µL로 10분 동안 세포를 고정한 다음, 75 µL의 PBS로 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, PBS에 희석된 0.2% Triton X-100 75 µL를 사용하여 10분 동안 세포를 투과화하고, 마지막으로 75 µL의 PBS만으로 세척합니다. islet을 면역 라벨링하려면, 먼저 슬라이드의 세포 면이 위로 향하게 하여 습윤 챔버에 넣고 PBS를 제거하십시오.

다음으로, 상온에서 75 µL의 normal donkey serum을 사용하여 비특이적 결합을 차단합니다. 1시간 후, 혈청을 제거하고 목적의 1차 항체 75 µL로 교체하여 상온에서 다시 1시간 동안 반응시킵니다. 배양이 끝나면 1차 항체 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 375 µL의 PBS로 샘플을 세척합니다.

그런 다음, 해당 면역형광 표지 2차 항체 75 µL를 섬(islet)과 함께 처리하여 빛이 차단된 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면, 2차 항체 용액을 Dappy 75 µL로 교체하여 3분간 처리한 후, 탈이온수로 5분 동안 세척합니다. 세척이 끝나면, 항퇴색 시약이 포함된 속건성 봉입제(mounting solution) 100 µL 한 방울을 유리 커버슬립 위에 떨어뜨리고, 현미경 슬라이드의 시료 면이 봉입제를 향하도록 뒤집어 덮습니다.

마이크로스피어의 가장 큰 비율은 직경 1-10 µm 사이가 되겠지만, 일부 마이크로스피어는 더 클 수도 있습니다. 손상되지 않은 PLGA 마이크로스피어로 처리된 Islet을 분산시킨 후 면역표지법을 수행하면, 세척 단계에서 완전히 제거되지 않은 온전한 마이크로스피어로 인해 세포 사이에 표지가 없는 샘플 영역이 관찰되는 경우가 흔히 발생합니다. 이미지 획득 후, Ki67 및 인슐린 양성 세포의 비율은 소프트웨어 이미지 분석을 통해 정량화하거나, 표지된 세포의 총 수를 수동으로 계수하여 측정할 수 있습니다.

앞서 시연한 것과 같이 온전한 islet을 재조합 인간 결합조직 성장인자 PLGA 미세구체로 3일 동안 처리하면 베타 세포 증식이 증가하며, 이는 미세구체 생성 과정에서 단백질의 기능이 상실되지 않았음을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 1주일 이내에 결과를 얻을 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때, 실험에서 베타 세포 증식에 미치는 영향은 관심 화합물과 생성된 미세구체의 정확한 방출 동역학에 따라 달라질 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차를 마친 후, 특정 화합물이 생체 내에서 베타 세포 증식을 유도할 수 있는지와 같은 다른 질문을 해결하기 위해 화합물이 적재된 미세구체를 온전한 췌도와 함께 공동 이식하는 등의 다른 방법을 수행할 수 있습니다. PLGA는 FDA 승인을 받은 장치 및 약물 전달 시스템에 사용된 이력이 있으므로, 특정 조직에 치료 화물을 장기간 전달하려는 연구자와 임상의에게 적합한 선택지입니다. 이 영상을 시청한 후에는 화합물이 적재된 PLGA 미세구체를 제조하고 이를 배양된 온전한 췌도에 투여하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 적절한 개인 보호 장구를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.