Name: 고정의 이미지 Prometaphase 및 중기 감수 분열의 I위한 기술 초파리 난 모세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 배우세요 Drosophila 난모세포를 이용한 감수분열 I의 방추체 조립 및 염색체 배향 연구 방법을. 면역형광법으로 세포구조를 시각화하여 생식세포 분열 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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CENP-C 항체를 제공해 주신 Christian Lehner님과 FISH에 대한 권장 사항을 주신 Eric Joyce님께 감사드립니다. McKim 실험실의 연구는 NIH(GM101955)의 보조금으로 지원되었습니다.

주 : 달리 명시되지 않는 절차는 실온에서 수행된다. 온도 제어 창업 보육 센터는 비행 양육에 대한 온도를 유지하는 데 사용 달리 명시하지 않는 한 교차된다. 1. 준비 <ol><li> 파리를 준비합니다. <ol><li> 난자 수집을 Prometaphase 강화. <ol><li> 지우기 성인 건강, 젊은 주식 또는 상호 문화에서 파리. 25 ° C에서 이틀 동안 나이 병입니다. 참고 : 일반적으로이 건강한 병 충분합니다, 더 많은 일부 상호 문화에 대한 필요 수도있다. </li><li> 이일 후, 병에서 (이 시점에서 0 ~ 2 일 오래된) ~ 100 (300)에 여성를 수집합니다. 암컷은 처녀 일 필요는 없습니다. 유리 병의 측면에 효모 붙여 넣기의 명인을 추가하고 30 명의 여성과 yeasted 유리 병에 10 ~ 15 명의 남성을 각각 배치합니다. 25 ° C에서 이틀 동안 시대의 유리 병. </li></ol></li><li> 난자 컬렉션 중기는 강화. <ol><li> 주식 또는 크로스 cultur에서 100 ~ 300 명의 여성을 수집에스. 유리 병의 측면에 효모 붙여 넣기의 명인을 추가하고 30 명의 여성을 배치 할 yeasted 유리 병에 (추가없이 남성)와 각. 25 ℃에서 3 ~ 5 일 시대 유리 병. </li></ol></li></ol></li><li> 솔루션을 준비합니다. 주 : 달리 언급하지 않는 한 용액을 실온에서 무기한으로 저장 될 수있다. <ol><li> 롭의 버퍼를 수정를 준비 (5 배) : 500 mM의 HEPES, 500 mM의 수 크로스, 275 mM의 아세트산 나트륨, 200 mM의 아세트산 칼륨, 50 mM의 포도당 6 mM의 염화 마그네슘, 및 5mM의 염화칼슘. 7.4으로 산도를 가지고 수산화 칼륨 : 8 수산화 나트륨 : 10 N (11)를 사용합니다. 여과 소독; 오토 클레이브하지 않습니다. -20 ° C에서 보관하십시오. ~ 1 배 롭의 난자 당 준비 200 ㎖를 준비하기 위해 필요에 따라 해동. </li><li> 고정 솔루션. <ol><li> 옵션 # 1 : 포름 알데히드 / 헵탄 고정을 준비합니다. 고정 버퍼를 준비 : 1X 인산 완충 식염수 (PBS) 플러스 150 MM의 자당을. 사용하려면, 687.5 ㎕의 고정 버퍼 및 312.5 μL 16 % 포름 알데히드와 신선한 확인난자 준비 당. 주의 : 흄 후드에서 포름 알데히드 솔루션을 사용하는 동안 장갑을 착용 할 것. 제도적 지침에 따라 폐기물을 폐기하십시오. </li><li> 옵션 # 2 : 포름 알데히드 / cacodylate 고정을 준비합니다. 수정 혼합 준비 : 250 mM의 수 크로스, 100 mM 칼륨 아세테이트 (PH 7.5), 25 mM의 아세트산 나트륨 (PH 7.0), 25 mM의 EGTA (PH 8.0). 사용하려면, 400 μL와 신선한 믹스를 해결하기 위해선, 100 ㎕의 칼륨 cacodylate (1 M, pH를 7.2)와 난자 준비 당 500 ㎕의 16 % 포름 알데히드. 주의 : 칼륨 cacodylate는 비소가 포함되어 있습니다. </li></ol></li><li> 1X PBS 플러스 1 % 또는 0.05 % 트리톤 X-100 : PBS / 트리톤 X-100을 준비합니다. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 1X PBS (/ V w) 0.5 % BSA 및 0.1 % 트윈 20-PBS 트윈 20 - 소 혈청 알부민 (BSA) (PTB)을 준비한다. 일주일 동안 4 ° C에 저장 될 수있다. </li><li> 제자리 교잡 (FISH) 솔루션에서 형광. <ol><li> 준비 20X 염화나트륨 - 시트르산 나트륨 (SSC) 3 M 염화나트륨 및 0.3 M 시트르산 나트륨. </li><li> 준비 2 × SSC-트윈 -20 (SSCT) : 2 × SSC 플러스 0.1 % 트윈 -20. 난자 준비마다 신선한 ~ 20 ㎖를 확인합니다. </li><li> 포름 아미드 솔루션을 준비 : 배 SSC, 0.1 % 트윈 20, 플러스 포름 아미드를. 1 ml의 20 % 포름 아미드, 0.5 ml의 40 % 포름 아미드, 및 난자 사전에 2 ml의 50 % 포름 아미드, 신선한 만든다. 주의 : 흄 후드에서 포름 아미드 솔루션을 사용하는 동안 장갑을 착용 할 것. 제도적 지침에 따라 폐기물을 폐기하십시오. </li><li> (V / w) 2 × SSC, 50 % 포름 아미드, 10 % 덱스 트란 설페이트 : 혼성화 용액을 제조한다. 4 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> FISH 프로브. <ol><li> 주문 HPLC 정제와 올리고 뉴클레오티드 (서열 표 1 참조)는 5 &#39;형광 변형 (예를 Cy3 또는 Cy5에)를 원하는. 50 NG / μL에서 트리스 - EDTA (TE)에 재현 탁. 참고 : 항상 빛 노출 올리고를 보호합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 늦게 단계 초파리 난 모세포 2. 컬렉션 <ol><li> 같이 <em&gt; 플라스틱 및 유리에 충실합니다 양막 초파리 난자, 프리 코트 한 5 ML 튜브와 PTB와 난자 준비 당 하나의 파스퇴르 피펫의 내부. </li><li> 이산화탄소 모든 ~ 100 300 yeasted 파리를 마취하고 ~ 100 ml의 1 배 롭의 버퍼를 포함하는 믹서에 추가 할 수 있습니다. 펄스 세 번 (~ 1 초 각). 활성화를 방지하기 위해 &lt;20 분 롭의에서 난자를 유지합니다. 참고 : 또는 난자는 여성의 손으로 해부 할 수있다. 이 방법의 장점은 작은 여성이 필요하다는 것이다. 그러나,주의 7 저산소증과 연관된 아티팩트들을 피하기 위해 단지 몇 분으로 이산화탄소에 노출을 제한하기 위해 취해 져야한다. </li><li> 큰 신체 부위를 제거하기 위해 250 ml의 비이커에 큰 메쉬 (~ 1,500 μm의)를 통해 필터링합니다. 많은 그대로 복부 다시 메쉬, 재 분쇄 추가 롭의 버퍼 사용 재료 및 필터에 남아있는 경우. 다음 가능한 한 많은 신체 부위의 많은 제거, 상위 레이어를 대기음 ~ 2 분 정착하자. </li><li> 인터넷250 ml의 비이커에 작은 메쉬 (~ 300 μm의)를 통해 LTER. 추가 롭의 및 코팅 파스퇴르 피펫을 사용하여 첫 번째 비커 밖으로 남아있는 난자를 씻어. 정착이 ~ 3 분하자; 난자는 침전됩니다. 기음 오프를 제외한 모든 ~ 10ml를. </li><li> 코팅 5 ML 튜브에 맞는로 10 ㎖가 많이 붓는다. , 정착 액체를 제거하고 나머지를 반복 할 수 있습니다. 추가 롭의 및 코팅 파스퇴르 피펫을 사용하여 비커에서 남아있는 난자를 씻어. 3-5 분 ~ 5 ML 튜브에 정착하자. </li></ol> 3. 약물 치료 (선택 사항) <ol><li> 코트 각각의 난자 준비를위한 PTB와 두 번째 5 ML 튜브. 1 ml의 롭의 각각의 난자 준비를위한 각 (표 2)에 적당한 용매 (제어) 또는 약물을 추가합니다. </li><li> 두 번째 코팅 5 ML 튜브로 분할 난자. , 정착하자 액체를 제거하고, 하나의 튜브에 1 ㎖의 롭의 플러스 용매를 추가하고 1 ml의 롭의 플러스 약 2 튜브로. 약물 치료 (표 2) 시간의 적절한 금액 Nutate. 엘등이 정착. </li></ol> 4. 고정 <ol><li> 기음 떨어져 모든 액체 및 즉시 1 ml의 수정을 추가합니다. </li><li> 옵션 # 1 : 포름 알데히드 / 헵탄 고정 (고정 버퍼 플러스 5 %의 포름 알데히드). <ol><li> nutator에 2.5 분 수정. 1 ML의 헵탄 소용돌이 1 분을 추가합니다. 정착 ~ 1 분을 보자. </li><li> 모든 액체를 제거하고 PBS 1X 1ml를 추가합니다. 소용돌이 30 초. 정착 ~ 1 분을 보자. </li><li> 모든 액체를 제거하고 1X PBS로 튜브를 입력합니다. 주 : 난 모세포 즉시 사용 또는 실온에서 몇 시간 동안 nutator에 보관 될 수있다. </li></ol></li><li> 옵션 # 2 : 포름 알데히드 / cacodylate 고정은 (믹스 플러스 8 % 포름 알데히드와 100 밀리미터 cacodylate 수정). <ol><li> nutator에 6 분 수정. 2 분 정착하자. 액체를 제거하고 1X PBS로 튜브를 입력합니다. 주 : 난 모세포 즉시 사용 또는 실온에서 몇 시간 동안 nutator에 보관 될 수있다. </li></ol></li></ol> 5. 막 분리 ( &quot;롤링&quot;) <ol><li> 코팅 파스퇴르 피펫을 사용하여 유리 슬라이드의 프로스트 (샌드 블라스트) 부분에 ~ 500 1,000 난자를 추가합니다. 모든 신체 부위와 관계없는 재료를 사용하여 집게를 제거합니다. 난자가 건조하게하지 마십시오 필요에 따라 1X PBS를 추가합니다. </li><li> , 정기적으로 현미경으로 진행 상황을 확인 (. 가장 적합한 난자에 걸쳐 커버 슬립의 가장자리를 드래그) 제거 모든 세포막 때까지 난자 조심스럽게 &quot;롤&quot;난 모세포의 상단에 커버 슬립을 놓고 필요에 따라 더 1X PBS를 추가. 난자를 파괴 할 것이다 너무 많은 압력이주의하십시오. 참고 : 면역 형광 만, (면역 형광 유무에 관계없이) FISH를 들어 6 단계를 계속 들어, 7 단계를 계속합니다. </li></ol> 초파리 난 모세포의 6 항체 염색 <ol><li> 추출 및 차단 <ol><li> ~ 15 ml의 PBS / 1 % 트리톤 X-100을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 압연 난자를 씻어. 만큼이나 1.5 시간 동안이 용액과 2 개 이하의 시간에 Nutate 모세포.이 단계는 항체 침투 할 수 있습니다. </li><li> 난자가 ~ 2 분 정착하자. 가능한 한 많은 막과 함께 액체를 제거하고 PBS를 추가 / 0.05 % 트리톤 X-100. 참고 : 막 압연 난자보다 느리게 해결됩니다. </li><li> 난자가 ~ 2 분을 해결하자, 모든하지만 ~ 1 ml의 액체를 제거합니다. 로 전송 난자 1.5 ML 튜브를 졸업하고 남은 액체를 제거합니다. 1 시간 동안 차단 및 nutate 1 ml의 PTB를 추가합니다. </li></ol></li><li> 항체 염색 <ol><li> 배아에 대한 이차 항체의 사전 흡수. 참고 :이 단계는 초파리 단백질과 비 특이 항체의 상호 작용에서 배경 얼룩을 제거한다. <ol><li> 수집하고 일반적인 절차 (8) 당 초파리 배아 (~ 25 μl를) 수정. -20 ° C에서 메탄올 저장합니다. </li><li> 배아에서 메탄올을 제거 15 분 동안 800 ㎕의 메탄올 플러스 PBS 1 배 200 μL 및 nutate를 추가합니다. 상층 액 500 μl를 제거하고 PBS 1 배 500 μL로 교체. 그런 다음 15 분 동안 nutate. (세척의 ~ 1 시간 총)을 두 번 반복 한 다음 PTB에서 마무리합니다. 참고 : 배아는 즉시 사용 또는 실온에서 몇 시간에 대한 nutator에 보관 될 수있다. </li><li> 액체를 제거 난자 준비 당 200 μL에 PTB 채우기, 적절한 희석에 형광 표지 된 이차 항체를 추가 (최종 부피는 300 μL 될 것이라고 염두에두고,. 단계 7.4 참조) Nutate를 4 ° C에서 하룻밤 (바람직한) 또는 3 내지 4 시간 동안 실온에서 첨가 하였다. 참고 : 미리 흡수 항체 단계 6.2.4에서 사용됩니다. 참고 :만큼 가능한 형광 항체가 추가 된 후 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오. </li></ol></li><li> , 난 모세포에서 액체를 제거 300 μL에 PTB 채우기, 적절한 희석에 차 항체를 추가합니다. 4 ° C에서 Nutate 하룻밤 (바람직) 또는 3 ~ 4 시간 동안 실온에서. </li><li> 세척은 1 ml의 PTB 15 분마다 네 번 난자. </li><li> 없애다난자에서 액체, 배아 (보조 항체를 미리 흡수)에서 상층 액 200 μl를 추가합니다. 그 후 300 μL에 PTB와 함께 입력합니다. 3 ~ 4 시간 (바람직한) 또는 밤새 4 ° C의 실온에서 Nutate. </li><li> 1 ml의 PTB와 15 분 동안 한 번 난 모세포를 씻어 액체를 제거합니다. 그리고 7 분 0.5 μL의 Hoechst 33342 500 μL의 PTB와 nutate를 추가합니다. </li><li> 1 ml의 PTB와 15 분 각각 두 번 난자를 씻으십시오. 주 : 난자 즉시 슬라이드에 부착 될 수 있거나 또는 이미지를 위해 준비 될 때까지 39 ° C에서 PTB에 저장 될 수있다. </li></ol></li></ol> 7. FISH (위의 5 단계에서 계속) <ol><li> ~ 15 ml의 2 배 SSCT를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 압연 난자를 씻어. 난자가 ~ 2 분 정착하자. 0.5 ml의 액체 가능한 한 많은 막과 함께 모든하지만 ~를 제거합니다. 참고 : 막 압연 난자보다 느리게 해결됩니다. </li><li> 전송 0.5 ML 튜브에 난자 남아있는 액체를 제거합니다. 계속해서 추가하고 500 μl를 제거20 %, 40 %, 50 % 포름 아미드 용액은, 각각의 용액을 10 분 동안 하향 경사. 참고 : 난 모세포는 포름 아미드의 높은 비율로 느리게 해결됩니다. </li><li> 다음 1 내지 5 시간 동안 37 ℃에서 500 μL의 50 % 포름 아미드 용액 및 nutate 추가 액체를 제거한다. 참고 : 긴 배양 더 나은 프로브 침투 초래한다. </li><li> 더 이상 100 ~보다 μL 난자 남겨두고, 액체를 제거하고 36 μl의 하이브리드 솔루션 플러스 프로브의 2 μL (50 NG / μL), 물 2 μL 또는 2 차 프로브 (표 1)의 2 μl를 추가합니다. </li><li> 하룻밤 37 ° C 형 수조에서 배양 한 다음 3 분 (FISH 만 해당) 또는 20 분 (FISH 플러스 면역 형광) 80 ° C, 91 ° C에서 품어. 주의 :이 단계는 열 순환기에서 수행 될 수있다. </li><li> 액체를 제거하지 마십시오. 1 시간 동안 37 ° C에서 500 ㎕의 50 %에게 포름 아미드 용액 nutate을 추가합니다. </li><li> 액체를 제거, 정착하자 500 μL 50 % 포름 아미드 솔루션을 추가하십시오1 시간 동안 37 ° C에서 D의 nutate. </li><li> 액체를 제거 정착하자 10 분 동안 실온에서 500 ㎕의 20 % 포름 아미드 용액 및 nutate 추가. </li><li> (반복을 여러 번 반전, 다음 액체를 추가, 제거, 정착을 할 수 있습니다.) 500 ㎕의 2 배 SSCT 세 빠른 세척을 수행 정착하자, 액체를 제거하고 4 시간 동안 500 μL의 PTB와 nutate를 추가합니다. </li></ol> 8. 항체 염색 FISH 후 <ol><li> , 난 모세포에서 액체를 제거 300 μL에 PTB 채우기 및 FITC에 접합 10 μl를 방지 α-tubulin에 항체를 추가합니다. 또는, 다른 항체를 상기 프로토콜에 따라 사용될 수있다. 실온에서 밤새 Nutate. </li><li> 다음 7 분 0.5 μL의 Hoechst 33342 500 μL의 PTB와 nutate를 추가, 액체를 제거, 500 ㎕의 PTB와 15 분 동안 한 번 난자를 씻으십시오. </li><li> 500 μL PTB 15 분 각각 두 번 난자를 씻으십시오. 주 : 난 모세포 즉시 슬라이드에 부착 될 수 있거나 위해 준비 될 때까지 39 ° C에서 PTB에 저장 될 수있다영상. 많은 가능한 형광 항체가 추가 된 후 어둠 속에서 난자를 보관하십시오. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1in"> 반복 이름 </td><td fo:width="1in"> 염색체 </td><td> 올리고 순서 * </td></tr><tr><td> 359 </td><td> 엑스 </td><td> GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC </td></tr><tr><td> AACAC </td><td> 이 </td><td> AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC </td></tr><tr><td> 도데 카 </td><td> 삼 </td><td> CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT </td></tr><tr><td> 1.686 </td><td> 2 + 3 </td><td> AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG </td></tr><tr><td> AATAT </td><td> 4 (+ Y) </td><td> AATATAATATAATATAATATAATATAATAT </td></tr><tr><td colspan="3"> * 에릭 조이스, 개인 통신, 설리반 등의 다른 시퀀스에서 359 시퀀스입니다. (8) </td&gt; </tr></tbody></table> 표 1 : 초파리 센트로 미어 반복에 대한 FISH 프로브. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 약 </td><td> 용제 </td><td> 주식 농도 </td><td> 최종 농도 </td><td> 처리 시간 </td><td> 효과 </td></tr><tr><td> 콜히친 </td><td> 에탄올 </td><td> 125 밀리미터 </td><td> 150 μM </td><td> 10 분 또는 30 분 </td><td> 비 동원체 (10 분) (9) 또는 전부 (30 분) 미 세관 불안정 </td></tr><tr><td> 파클리탁셀 </td><td> DMSO </td><td> 10 mM의 </td><td> 10 μM </td><td> 10 분 </td><td> 마이크를 안정화rotubules </td></tr><tr><td> Binucleine 2 </td><td> DMSO </td><td> 25 mM의 </td><td> 25 μM </td><td> 20 분 </td><td> 오로라 B 키나제 (10)을 억제 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 약물 치료.

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<li>Colombié, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+Incenp+crucial+to+the+assembly+of+the+acentrosomal+metaphase+spindle+in+female+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis.</a> Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).</li>
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초파리 난 모세포를 준비 긴 karyosome 자주 중기의 난 모세포에서 prometaphase 구분하기 karyosome 모양을 사용하여, prometaphase 난자에서 볼 수 있지만 문제가 될 수 있습니다. prometaphase 동안 karyosome은 원형으로의 신장을 시작하고 난 모세포는 중기 정지에 접근 라운드 형상으로 후퇴. 이것은 많은 prometaphase 난자가 긴 karyosome이없는 것을 의미한다. 돌연변이 또는 약물 처리 된 난자가 조사하는 경우 또한, karyosome 모양 난자를 준비하기 위해이 방법을 사용 배제, 영향을받을 수 있습니다. 다른 마커 이러한 단계를 현재 사용할 수 없습니다 구분하기 때문에, 우리는 prometaphase 또는 중기에 하나 난자에 대해 풍부하게 초파리 암컷의 알을 낳는의 속도를 조작하는 상기 한 방법을 사용합니다. 이론적 근거는 그 난자는 prometap...

감수분열에 대한 연구는 때때로 "유전학의 유전학"으로 설명됩니다. 이는 염색체 유전과 독립적 구색의 기본 특성이 배우자 생산 중 염색체의 분리를 통해 수행되기 때문입니다. 유전의 염색체 이론에 대한 중요한 시연은 1916년 Drosophila melanogaster1에 있는 Calvin Bridges의 연구에서 나왔다. 초파리에 대한 이 연구와 다른 고전 유전학 연구는 유전학에 대한 우리의 이해에 크게 기여했습니다. 그러나 초파리 난모세포의 감수분열 염색체에 대한 세포학적 검사는 까다로웠습니다. 이는 주로 방추체가 조립되고 염색체가 분리 방향을 잡을 때 후기 초파리 난모세포의 면역 형광이 난모세포가 항체에 침투할 수 없도록 하는 막의 존재로 인해 방해를 받기 때문입니다.
이러한 어려움에도 불구하고 초파리 난모세포는 염색체 거동 및 방추체 조립 연구를 위한 매력적인 모델로 남아 있습니다. 이것은 초파리에서 사용할 수 있는 강력한 유전 도구 때문이기도 하지만, 염색체가 방향을 잡고 방추체가 완전히 형성되는 중기 I에서 난모세포가 정지하기 때문이기도 합니다. 이것은 세포 분열의 이 중요한 단계에서 많은 수의 난모세포를 수집하고 검사하는 것을 용이하게 합니다. 또한, 난모세포 염색체 분리 연구를 위해 유전자 조작이 가능한 간단한 모델 유기체는 인간의 생식 건강에 대한 우리의 이해에 중요한 기여를 할 수 있습니다. 염색체 수의 오류는 인간의 유산 및 선천적 기형의 주요 유전적 원인입니다2. 이러한 오류의 대부분은 난모세포에서 찾을 수 있으며 산모 연령 증가와 관련이 있습니다. 미국 내 산모의 평균 연령이 높아지고 있어 이는 주요 공중 보건 문제가 되고 있습니다.
여기서는 난모세포막을 제거하는 방법에 대한 시연을 포함하여 초파리 난모세포의 세포학적 검사 방법을 설명합니다. 이러한 방법은 Theurkauf 및 Hawley3, Zou et al.에 의해 처음 설명된 프로토콜의 변형입니다.4, 및 Dernburg et al.5. 우리는 또한 Gilliland et al.이 처음 설명한 프로토콜을 기반으로 난모세포의 여러 단계를 농축하는 방법을 포함합니다.6. 마지막으로 초파리 난모세포의 약물 치료에 대한 지침을 추가합니다. 이러한 방법을 함께 사용하면 초파리에서 난모세포 염색체 분리 및 방추체 조립에 대한 세포학적 조사를 수행할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>15ml 원뿔형 튜브</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% 포름알데히드</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td>위험; 한 번 개봉하면 1개월 후에 버리</td></tr>십시오 <tr><td>250ml 비커</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5ml 튜브</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>활성 건조 효모</td><td>물과 다양한</td><td></td><td>혼합하여 땅콩 버터</td></tr> 항 알파의 농도를 만듭니다. <tr><td>- 튜불린 항체는 FITC</td><td>Sigma</td><td>F2168</td><td>클론 DM1A</td></tr><tr><td>바이뉴클레인 2</td>에 접합됩니다.<td>Sigma</td><td>B1186</td><td>HAZARDOUS</td></tr><tr><td>블렌더</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>콜히친</td><td>Sigma</td><td>C-9754</td><td>HAZARDOUS</td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>No. 1 1/2</td></tr><tr><td>덱스트란 설페이트</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>각종</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>각종</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>각종</td><td></td><td></td></tr><tr><td>겸자</td><td>테드 펠라</td><td>5622</td><td>Dumont 핀셋 고정밀 등급 스타일 5</td></tr><tr><td>포름 아미드</td><td>Sigma</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>눈금 1.5ml 튜브</td><td>여러</td> 공급 업체에서 사용 가능한 다양한 <td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>EM-5330</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>대형 메쉬(~1,500 &마이크로; m)</td><td>VWR</td><td>AA43657-NK</td><td>다양한 형식 및 기타 공급 업체, 12 또는 14 메쉬</td></tr><tr><td>작은 메쉬 (~ 300 &micro; m)</td> <td>Spectrum labs</td><td>146 424</td><td>다양한 형식, 예 : , 146 422 또는 146 486</td></tr><tr><td>nutator</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세트산 칼륨</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카코딜산</td><td>시그마</td><td>C0125</td><td>위험; 대안적으로, sodium cacodylate는 칼륨으로 대체 될 수 있습니다.</td></tr><tr><td> 수산화물</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>구연산 나트륨</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수산화 나트륨</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>탁솔 (파클리탁셀)</td> <td>시그마</td><td>T1912</td><td>위험</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>피셔</td><td>PI-28314</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>피셔</td><td>PI-28320</td><td></td></tr><tr><td>볼텍스</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

고정의 이미지 prometaphase 및 중기 감수 분열의 i위한 기술<em&gt; 초파리</em&gt; 난 모세포

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

인간 난모세포의 염색체 분리는 오류가 발생하기 쉬워 유산 및 선천적 기형의 주요 유전적 원인인 이수성을 초래합니다. 모델 유기체의 난모세포에서 염색체 거동에 대한 연구는 인간 난모세포의 이수성에 대한 감수성의 분자적 기초를 밝힐 수 있는 많은 가능성을 가지고 있습니다. Drosophila melanogaster는 100년 이상의 연구, 커뮤니티 및 기술 개발을 통해 유전자 조작이 가능합니다. 그러나 초파리 난모세포에서 염색체 거동과 방추체 조립을 시각화하는 것은 주로 항체가 침투할 수 없는 난모세포를 둘러싼 막의 존재로 인해 특별한 어려움이 있습니다. 여기에서는 초파리 난모세포에서 감수분열 I 방추체 조립 및 염색체 거동의 수집, 준비 및 이미징을 위한 프로토콜에 대해 설명하며, 이를 통해 이 중요한 모델 유기체에서 염색체 분리의 분자 해부를 수행할 수 있습니다.

우리가 여기서 설명하는 한 방법은 감수 분열의 세 단계 (그림 1)를 나타내는 늦게 단계 초파리 난자의 컬렉션에 발생합니다. 의향에 난자가 karyosome (도 1A)을 둘러싸는 영역에서 튜 불린 신호의 부족에 의해 표시 핵막의 존재에 의해 구별된다. Prometaphase 핵 봉투 고장시 스핀들 조립 후 기간입니다. prometaphase 동안, karyosome는 독특한 형태를 가정 주 karyosome 질량 (그림 1B)에서 떨어져 4 번째 염색체 자주 연장되는 것을. Prometaphase는 초파리의 난자는 자연적으로 배란까지 체포하는 중기와칩니다. 중기 난자에서 karyosome는 둥근 모양 (그림 1C)로 후퇴했다. <p class="jove_content" fo:keep-tog...

우리는 성숙한 초파리 난모세포의 수집, 준비 및 이미징을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 방법을 사용하면 염색체 거동과 방추체 조립 및 감수분열 중 기능을 시각화할 수 있습니다.

고정의 이미지 Prometaphase 및 중기 감수 분열의 I위한 기술<em&gt; 초파리</em&gt; 난 모세포

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

이 절차의 전반적인 목표는 감수 분열 I기 동안의 방추사 조립 및 염색체 방향성을 세포학적으로 검사하기 위해 초파리 난모세포를 준비하는 것입니다. 이 방법은 방추사의 양극성이 어떻게 확립되는지, 그리고 중심립이 없는 상태에서 염색체가 어떻게 양방향으로 배열되는지와 같은 감수 분열 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 항체 침투를 방해하는 난모세포 막을 효과적으로 제거하여 면역형광 염색이 가능하다는 점입니다. 시작하기 전에, 난모세포가 표면에 달라붙는 것을 방지하기 위해 5mm 튜브와 파스퇴르 피펫 내부를 PTB로 사전 코팅하십시오.블렌더에 ROB 버퍼 100 milliliters를 넣고 마취된 파리 100~300마리를 추가한 후, 1초 동안 세 번 펄스 작동시킵니다. 생성된 슬러리를 구멍 크기가 약 1,500 micrometers인 큰 메쉬를 통해 250-milliliter 비커에 여과합니다. 여과액을 약 2분 동안 가라앉힌 다음 상층액을 흡입하여 큰 신체 부위를 최대한 제거합니다.슬러리를 공극 크기가 300 µm인 더 작은 메쉬를 통해 250 mL 비커에 다시 여과합니다. 코팅된 피펫으로 추가 버퍼를 사용하여 첫 번째 비커를 헹궈 남은 난자를 수집합니다. 슬러리를 3분 동안 침전시킨 후, 바닥의 10 mL만 남기고 모두 흡입하여 제거합니다.코팅된 5 mL 튜브에 10 mL 중 가능한 많은 양을 붓습니다. 슬러리가 약 2분 동안 가라앉도록 둔 다음 액체를 조심스럽게 제거합니다. 남은 10 mL의 슬러리를 추가하고, 다시 혼합물이 가라앉을 때까지 기다린 후 액체를 제거합니다.코팅된 피펫에 추가 버퍼를 사용하여 비커에 남아 있는 난자를 모두 헹궈 냅니다. 헹군 액체가 5 mL 튜브 내에서 3~5분 동안 가라앉도록 둡니다. 난소를 고정하려면, 먼저 조직에서 모든 액체를 흡입하여 제거한 후 즉시 1 mL의 Fix Mix를 첨가하십시오.조직을 너테이터(nutator)에 넣고 2 1/2분 동안 흔들어 줍니다. 다음으로, 헵탄 1 mL를 첨가하고 튜브를 1분 동안 볼텍싱한 후, 난모세포가 가라앉을 때까지 1분 더 기다립니다. 가라앉은 조직에서 모든 액체를 제거한 다음, 1x PBS 1 mL를 첨가합니다.튜브를 30초 동안 볼텍싱한 후, 난모세포가 가라앉을 때까지 1분간 기다립니다. 그 후, 튜브 내의 모든 액체를 제거하고 1x PBS 5mL를 채웁니다. 코팅된 피펫을 사용하여 약 5

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