Name: RNA 측정 방법 N 6 -methyladenosine 수정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 학습하세요 수정된 노던 블로팅 기법으로 RNA의 N6-메틸아데노신(m6A) 변형을 측정하는 방법을. 마우스 조직에서 RNA를 분리하고 전기영동 및 항체 검출을 통해 rRNA, mRNA, 소형 RNA에서 m6A 변형을 효과적으로 분석할 수 있습니다.

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C.Y.W.는 국립보건연구원(NHRI-EX101-9925SC), 국가과학위원회(101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009), 장궁기념병원(CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091, CMRPG3C1763)의 지원을 받았습니다.

참고 : 6 수준은 rRNA의, mRNA를, 및 기타 소형의 RNA를 포함 총 RNA의 m. 리보솜 RNA 풍부한 m 6 수정,도 6a 레벨이 사실을 고려할 필요가 m의 측정을 가지고 있기 때문이다. 1. RNA 분리 <ol><li> (종이 타월에 분사)가 리보 뉴 클레아 제의 오염 제거 용액을 사용하여, 피펫 및 실험실 벤치의 표면을 닦으십시오. 젖은 종이 클레아없는 물과 수건을 다시 피펫 및 실험실 벤치 표면을 닦아. </li><li> RNA 추출 <ol><li> 총 RNA 분리 <ol><li> 오버 헤드 교반기를 사용하여, 조직을 50 내지 100 mg을 4 ℃에서 유지 RNA 분리 액 1ml에 5 내지 10 × 106 세포를 균질화시킨다. 주 : 자세한 조직 (100-150 mg)을하기 때문에 내부 하부 RNA 농도 생쥐 지방 조직 샘플에 대해 요구 될 수있다. 샘플은 마우스 심장, 간, 골격근, 폐, 뇌에서 공급하고, 대 식세포는 이전에 4 사용되어왔다. </li><li> 에서실온에서 5 분 동안 샘플을 균질화 cubate. </li><li> 샘플 파쇄 1 ㎖ 당 1- 브로 모 -3- 클로로 프로판 (BCP) 100 μL를 추가한다. 15 초 동안 적극적으로 튜브를 흔들 제조업체의 지침 (24)에 따라 총 RNA를 분리로 진행합니다. </li></ol></li><li> 격리 된 총 RNA에서 폴리아 데 닐화 mRNA의 정제 <ol><li> 사용 가능한 키트 또는 프로토콜을 사용하여 폴리아 데 닐화의 mRNA를 정화. <ol><li> 다음 솔루션의 각을 다시 중단 철저하게 흔들어 : 배 결합 솔루션, 올리고 (DT) 폴리스티렌 구슬 및 세척 솔루션을. 올리고 (DT)를 사용하기 전에 실온에 따뜻한 비즈 있는지 확인합니다. </li><li> 가열 블럭에서 70 ℃로 튜브 열로 제조 당 용출 용액 120 μL를 옮긴다. </li><li> 미세 원심 관에 총 RNA의 500 μg의 최대 피펫. 클레아없는 물로, 250 μL에 볼륨을 조정합니다. </li><li> 총 RNA에 2 배 결합 액 250 μL를 추가하기 때문에lution와 소용돌이 짧게 내용을 혼합합니다. </li><li> 올리고 15 μL를 추가 (DT) 구슬과 소용돌이는 철저하게 혼합합니다. </li><li> 3 분 동안 70 ℃에서 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 가열 블록의 샘플을 제거하고 10 분 동안 실온에서 서하자. </li><li> 2 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 뒤 약 50 μL를 떠나, 뜨는을 제거합니다. </li><li> 피펫으로 펠렛을 다시 중단 세척 용액 500 μL를 추가합니다. </li><li> 스핀 필터 / 수집 튜브 세트로 현탁액을 피펫. </li><li> 2 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기. 포집 관에서 열을 제거하고 흐름을 통해 폐기하십시오. 수집 튜브에 열을 돌려줍니다. </li><li> 스핀 필터 상에 세척 용액의 피펫 500 μL. </li><li> 15,000 X 원심 분리기 2 분 동안 g. </li><li> 신선한 수집 관에 스핀 필터를 전송합니다. </li><li> 용출 용액의 피펫 50 μL 가열70 ° C 스핀 필터의 중심 상. </li><li> 70 ℃에서 2-5 분 동안 품어. 1 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 스핀 필터의 중심에 70 ° C로 가열 용출 용액의 추가 50 μL 피펫. </li><li> 단계를 반복 1.2.2.1.18. </li></ol></li><li> 100 μg의 / ㎖ 글리코겐, 3 M 아세트산 나트륨 완충액 (pH 5.2), 및 무수 에탄올 2.5 부피 0.1 볼륨. -80 ° C에서 하룻밤 침전. </li><li> 4 ℃에서 25 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. </li><li> 75 % 에탄올 1 mL로 펠렛을 씻으십시오. 4 ℃에서 15 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기. 조심스럽게 에탄올을 제거합니다. </li><li> 3-5 분 동안 공기 건조. </li><li> 펠렛을 용해 뉴 클레아없는 물 10 μL를 추가합니다. </li><li> -70 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> RNA 자격 및 정량화 <ol><li> 분광 광도계를 사용하여, NotI에 의해 RNA의 농도를 결정260 nm 내지 280 nm에서의 흡광도 겨. 다음은 260 / A 280 비율은 1.8-2.2해야합니다. </li><li> 0.8 % 아가 로스 겔 전기 영동 (25)를 사용하여 RNA 샘플 품질을 확인합니다. 참고 :이 그대로 진핵 총 RNA는 강렬한 28S와 18S rRNA의 밴드를 표시해야합니다. 좋은 RNA 준비를위한 18S rRNA의 밴드 강도를 비교 28S의 비율은 1 ~ 2이다. </li></ol></li></ol> 2. 젤 전기 영동 및 전송 참고 : 버퍼 준비 프로토콜은 표 1에 제시되어있다. <ol><li> 포름 알데히드 젤 준비 (1 %) <ol><li> 디 에틸 피로 카보 (DEPC) 물과 모든 전기 장비를 씻어. </li><li> 완전히 전자 레인지 DEPC 물 215 ㎖의 2.5 g 아가 용융. </li><li> 10 배 3- (N- 모르 폴리 노) 프로판 술폰산 (MOPS)의 12.5 mL의 버퍼와 37 %의 포름 알데히드 22.5 mL를 넣고. </li><li> 1.5 mm 두께의 빗 전기 영동 장치에 그것을 따르십시오. </li><li> t 거품을 제거 또는 푸시깨끗한 빗과 젤의 가장자리에 밑단. </li><li> 겔은 실온에서 응고 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 샘플 준비 <ol><li> 샘플 버퍼의 총 RNA의 1-10 μg의 11.3 μL를 섞는다. </li><li> 샘플 버퍼의 11.3 μL와 RNA 마커 (1 μg의 / μL) 2 μg의 혼합. </li><li> 16 μL의 총 볼륨 2.2.1과 2.2.2에서 샘플 뉴 클레아없는 물을 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 60 ℃에서 가열 한 후 얼음에 진정. </li><li> 얼음 / μL 에티 디움 브로마이드 0.1 μg의를 포함 추적 염료의 4 μL와 2.2.3에서 샘플 16 μL를 섞는다. 주의 : 흡입하면 에티 디움 브로마이드 가능성이 기형 독성이다. 에티 디움 브로마이드 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li></ol></li><li> 전기 영동 <ol><li> 10 배 MOPS의 200 ㎖가 1 배 MOPS 실행 버퍼를 만들기 위해 DDH 2 O의 1,800 mL의 버퍼에 추가합니다. </li><li> 젤의 우물을 씻어하기 위해 1 배 MOPS 실행 버퍼를 사용합니다. </li><li> 사전 실행 t그는 5 분 동안 20 V에서 젤. </li><li> 겔의 우물에 RNA 샘플을로드합니다. </li><li> 빛의 노출을 방지하기 위해 호일로 커버. (야간) 약 17 시간 동안 35 V에서 실행 </li><li> 검사 및 자외선 아래에서 젤을 촬영. </li></ol></li><li> 이전 <ol><li> 사용되지 않는 부분을 제거하는 젤을 잘라. </li><li> 10 배 SSC 버퍼 (20 배 SSC 버퍼의 250 mL의 DEPC 물 250 mL)을 500 ㎖를 준비합니다. </li><li> 50 rpm으로 진탕 20 분 동안 10 배 SSC 버퍼로 두 번 젤을 씻으십시오. </li><li> 반송 트레이 (도 1)로부터 전송 버퍼를 흡수 심지 종이의 역할을하기에 충분히 큰 1 필터 종이 낱장. </li><li> 젤과 같은 크기로 종이 필터 4 조각을 잘라. </li><li> 겔과 같은 크기로 양전하 나일론 막 중 1 매를 잘랐다. </li><li> 겔의 노치와 올바른 방향을 보장하기 위해 마커로 막을 표시합니다. </li><li> 15 분 동안 2 × SSC 완충액에서 막을 담근다. </li><li> 500 mL의 O를 붓고F 10 배 SSC 전송 트레이에 버퍼. </li><li> 유리판을 가로 지르는 큰 필터 종이 시트를 놓고 전송 버퍼 여과지 젖은. </li><li> 피펫있는 모든 거품을 굴립니다. </li><li> 전송 버퍼에 미리 차단 필터 종이의 2 개를 적시 단계 2.4.5에서 여과지의 중앙에 배치합니다. 모든 거품을 제거합니다. </li><li> 아래 필터 종이에 젤 상단 측을 놓습니다. </li><li> 겔의 상단에 막을 놓습니다. 겔과 멤브레인의 노치에 맞 춥니 다. </li><li> 멤브레인 위에 프리 컷 여과지의 2 개를 배치하고 전송 버퍼 여과지 젖은. </li><li> 층 사이의 거품을 제거합니다. </li><li> 수건은 겔 멤브레인을 통과 버퍼를 흡수되도록하여 겔 주위에 랩을 적용합니다. </li><li> 필터 종이 위에 종이 타월 스택. </li><li> 수건 위에 대형 유리 접시를 놓습니다. </li><li> 스택의 상단에 무게를 둡니다. </li><li>RNA가 막에 겔로부터 전송할 수 밤새 유지. </li></ol></li></ol> N 6 -methyladenosine 3. 검출 <ol><li> 막 가교 <ol><li> 배 SSC 버퍼에 젖은 멤브레인을 유지합니다. </li><li> UV 가교제에 10 배 SSC 버퍼에 몰입 필터 종이 2 장을 놓습니다. </li><li> RNA의 흡착면이 위를 향하도록, 여과지 위에 멤브레인을 놓습니다. </li><li> &quot;autocrosslink 모드&quot;(12 μJ)를 선택하고 조사를 시작하기 위해 &quot;시작&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 멤브레인을 겔에서 RNA의 전사를 확인하기 위해 UV 겔 화상 포수 막 겔을 조사한다. </li></ol></li><li> 면역 <ol><li> 실온에서 1 시간 동안 트윈 -20 (TBST) 완충액 TBS 버퍼에서 5 % 무 지방 우유 막을 차단. </li><li> 15 분 동안 TBST 완충액으로 세 번 씻으십시오. </li><li> 밤새 m (6) A (에 멤브레인을 품어 &lt;EM&gt; N 6 -methyladenosine) 항체 용액 (1 : 1,000 5 % 무 지방 우유 TBST 버퍼) 4 ° C에서. </li><li> 15 분 동안 TBST 완충액으로 세 번 멤브레인을 씻으십시오. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 (5 % 무 지방 우유 TBST 버퍼 2000 1) HRP 접합 된 당나귀 항 - 토끼 항체 용액의 막을 인큐베이션. </li><li> 15 분 동안 TBST 완충액으로 세 번 멤브레인을 씻으십시오. </li><li> 강화 된 화학 발광 기판 (막 cm 2 당 0.125 ml)에 적용합니다. </li><li> 제조자의 지시 (26)에있어서, 상기 디지털 영상 기의 최적 설정으로 화학 발광 캡처. </li></ol></li><li> m 6 정량화 <ol><li> ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 상대 m 6 화학 발광 강도를 측정한다. <ol><li> ImageJ에 소프트웨어 메뉴 아래에서 해당 파일을 열 수있는 &quot;파일&quot;옵션을 선택합니다. </li><li> ImageJ에에서 &quot;직사각형&quot;도구를 선택하고 주변에 프레임을 그립니다신호. </li><li> 리보솜 RNA는 실험의 초점없는 경우 계산을위한 18S 및 28S 리보솜 RNA m도 6A 대역을 피한다. </li><li> 선택한 차선을 확인하는 &quot;명령&quot;과 &quot;1&quot;을 클릭합니다. </li><li> 보도는 &quot;명령&quot;과 &quot;3&quot;선택한 플롯을 표시합니다. </li><li> 가 &quot;STRAIGHT&quot;도구를 클릭하고 분할 영역을 구분하는 선을 그립니다. </li><li> 측정 값을 기록하기 위해 &quot;지팡이&quot;도구를 클릭합니다. </li><li> 데이터를 내 보냅니다. </li><li> 에티 디움 브로마이드 염색 중 18S 리보솜 RNA 밴드 m (6) (A)의 레벨을 정규화한다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

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RNA의 변형은 세포 기능과 생리학에서 중요한 역할을 합니다. 이러한 변형의 조절, 기능 및 항상성에 대한 현재 이해는 여전히 탐구되고 확장되고 있습니다8. 따라서 RNA의 변형을 평가하기 위한 정확하고 표준적인 방법이 필요합니다. 수정된 노던 블로팅 방법은 RNA 변형의 정확한 정량화와 다양한 RNA의 변형을 명확하게 묘사합니다. 이 방법은 최소 3일이 필요하지만 표준화될 수 있으며 다양한 실험 설계에 사용할 수 있습니다. 또한, 다른 항체를 사용하여 다른 RNA 변형을 검출할 수 있습니다27.
RNA 변형을 분석할 때 서로 다른 RNA를 분리하는 것이 중요합니다. 리보솜 RNA는 RNA28,29의 총량의 상당 부분을 포함한다. 전체 RNA에서만 RNA 변형을 분석한 결과는 대부분 rRNA의 변화를 나타냅니다. rRNA의 메틸화 및 기타 변형은 잠재적으로 다른 RNA의 변화를 가릴 수 있습니다. 겔 분리 절차를 통해 mRNA 및 기타 작은 RNA의 변형을 보다 정확하게 분석할 수 있습니다.
m6A 면역침전 및 시퀀싱을 통한 전사체 전체 매핑은 각 유형의 RNA22의 변형에 대한 자세한 통찰력을 제공합니다. 특정 RNA에 대한 정보와 약 80-120bp의 분해능을 제공합니다. m6A-Seq는 서로 다른 실험 조건 간의 수정을 비교할 수 있지만 이러한 실험을 위한 적절한 표준과 대조군을 선택하는 것은 어렵습니다18. 면역침전은 재현하기 어렵고 종종 반복 간에 상당한 차이를 나타냅니다. 또한, m6A-Seq는 면역침전 및 시퀀싱30 전에 RNA 샘플의 단편화를 필요로 한다. 단편화 과정은 잠재적으로 원래 RNA 변형에 과도한 영향을 미칠 수 있습니다. 실험에 특정 유전자의 정보가 필요하지 않지만 비교를 위해 다른 조건이 필요한 경우 현재 방법은 다양한 실험 설정에 대해 더 나은 시각화 및 제어를 제공합니다. 
RNA의 변형은 전사 조절을 조절하는 중요한 단계입니다31. 그러나 다양한 생리학적 영역에서 다양한 RNA 변형의 항상성과 조절 메커니즘은 아직 불분명합니다. 현재의 변형된 노던 블로팅 방법을 사용하여 다양한 RNA 변형을 정량화하고 비교할 수 있습니다. 또한, RNA 변형의 변화와 규제를 더 자세히 조사할 수 있습니다. 미래에는 고전적인 노던 블로팅과 수정된 노던 블로팅 프로토콜의 실험 데이터를 결합하여 RNA 생물학에 대한 더 큰 통찰력을 제공할 수도 있습니다.
수정된 노던 블로팅 프로토콜의 성공을 결정하는 가장 중요한 요소는 RNA 샘플의 무결성입니다. 어느 정도 분해된 RNA는 좋은 고전적 노던 블로팅 결과를 생성할 수 있지만 이는 잠재적으로 수정된 노던 블로팅 결과에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 다른 조직이나 세포주에서 RNA의 변형도 크게 다를 수 있습니다. 최종 실험을 수행하기 전에 다양한 조직에 적합한 RNA 샘플 부하를 테스트하는 것이 중요합니다.
블로팅 절차는 전통적으로 Dr. Southern과 다양한 지리적 방향의 이름을 따서 명명되었기 때문에 현재 기술에 대해 "북동부" 블로팅이라는 이름을 제안합니다.

역동적이고 가역적인 RNA 변형은 RNA 항상성에 중요한 역할을 합니다. 40년 전, N6-메틸아데노신(m6A) 변형이 진핵생물 전사체에서 풍부한 것으로 밝혀졌습니다1. 이들은 메신저 RNA(messenger RNA, mRNA), 리보솜 RNA(ribosomal RNA, rRNA), 소핵 RNA(small nucleolar RNA), 전달 RNA(transfer RNA), 마이크로RNA2(microRNA)에서 다양한 기능을 합니다. mRNA의 m 6 A 변형은 스플라이싱(splicing)3, 번역(translation)4, 분해(degradation)5, 국소화(localization)2에 영향을 미친다. 또한 리보솜 생물 발생 및 microRNA 기능에 영향을 미칩니다6. m6RNA의 변형은 단세포 박테리아에서 다세포 인간에 대한 진화적 보존이 관찰됩니다7. m6A 수정의 역할에 대한 묘사는 현재 광범위한 연구가 진행 중입니다. 이러한 노력은 전사 제어에 대한 새로운 통찰력을 제공할 것으로 기대됩니다. 최근 연구에 따르면 mRNA8의 다른 화학적 변형도 RNA 대사에 중요한 역할을 합니다. 
일주기 리듬9, 줄기세포 다능성10, 트리글리세리드 대사4, 섬유증11, 비만12, 주요 우울증13은 m6A 변형이 결과를 조절하는 것으로 알려진 과정의 몇 가지 예입니다. 많은 생체 시계 유전자 전사체는 m6A 부위14를 가지고 있습니다. m6A 메틸 라제 또는 탈 메틸 라아제의 조절은 일주기 변화를 유도합니다15. m6A 전이효소인 Mettl3는 줄기세포 다능성의 조절제입니다. Mettl3의 결핍은 조기 배아 치사율과 착상 후단계 10에서 비정상적인 혈통 프라이밍으로 이어집니다. 지방세포에서 지방량 및 비만 관련(FTO), m6A demethylase의 결핍은 Angptl44의 전사 후 조절을 통해 지방산 동원과 체중에 영향을 미칩니다. 이러한 연구는 m6A가 mRNA 처리를 제어 할뿐만 아니라 발생 학적 발달 및 병태 생리학에서 중요한 역할을한다는 것을 밝혔습니다. m6 A 변형의 기능은 향후 치료적 고려에 대한 함의를 갖는다.
RNA16-18의 m6A 변형을 측정하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 전통적으로 박층 크로마토 그래피 (TLC) 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)는 여러 RNA19,20에서 m6A의 분포를 연구하는 데 사용됩니다. 질량분석법은 RNA에서 m6A 변형을 검출하기 위한 민감한 도구입니다. 그러나 RNA는 질량 분석법21에 의한 분석 전에 RNase에 의해 짧은 단편으로 절단되어야 합니다. 메틸-RNA 면역침전 및 염기서열분석(m6A-Seq)22 면역침전은m6A 특이적 항체로 단편화된 RNA를 분석하고 병렬 RNA 염기서열분석을 수행합니다. 이 방법은 전사체 너비의 m6A 랜드스케이프를 생성합니다. m6 A 개별 뉴클레오티드 해상도 가교 및 면역침전(miCLIP)의 고해상도 매핑은 단일 뉴클레오티드 해상도23에서m6A 변형을 추가로 매핑합니다. 두 방법 모두 특정 유전자 정보와 함께 전체 전사체에 걸쳐 m6A 변형에 대한 세부 정보를 제공합니다. 그러나 실험에서 여러 조건의 비교가 필요한 경우 두 방법 모두에서 정량화 및 표준화가 어렵습니다. 더욱이,m6A-Seq에 대한 RNA의 단편화는 원래의 RNA 구조를 변화시켜 본래의m6A 수치에 영향을 미칠 수 있습니다. 다양한 실험 조건에서의 RNA의 글로벌 m6A 변형 및 그 변화를 검출하기 위해 당사는 변형된 노던 블로팅 프로토콜을 사용하는 방법을 보고합니다. 이 방법은 겔 전기영동18을 사용하여 분자량으로 RNA를 분해합니다. 이 절차는 여러 조건 또는 샘플과 관련된 실험에 대해 더 나은 표준화 및 정량화를 제공합니다. 또한 rRNA, mRNA 또는 microRNA와 같은 다양한 RNA에 대한 특정 m6A 변형 정보를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>RNaseZap 솔루션</td><td>Ambion</td><td>AM9782</td><td>프로토콜 1.1</td></tr><tr><td>TRI 시약 솔루션</td><td>Ambion</td><td>AM9738</td><td>프로토콜 1.2.1.1</td></tr><tr><td>1-브로모-3-클로로프로판(BCP)</td><td>시그마</td><td>B9673</td><td>프로토콜 1.2.1.3</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>JTbaker</td><td>8006</td><td>프로토콜 1.2.1.3</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>시그마</td><td>I9516</td><td>프로토콜 1.2.1.3</td></tr><tr><td>GenElute mRNA Miniprep Kit</td><td>Sigma</td><td>MRN70</td><td>프로토콜 1.2.2.1</td></tr><tr><td>글리코겐</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td>프로토콜 1.2.2.2</td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>Fluka</td><td>71183</td><td>프로토콜 1.2.2.2</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Ambion</td><td>AM9930</td><td>프로토콜 1.2.2.6</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>프로토콜 2.1.1</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>JT Baker</td><td>A426</td><td>프로토콜 2.1.2</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>시그마</td><td>M1254</td><td>프로토콜 2.1.3</td></tr><tr><td>37% 포름알데히드 용액</td><td>시그마</td><td>F8775</td><td>프로토콜 2.1.3</td></tr><tr><td>EDTA, 디소듐 솔</td>트 <td>JT Baker</td><td>8993</td><td>프로토콜 2.1.3 10x MOPS 완충액</td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>시그마</td><td>F7503</td><td>프로토콜 2.2.1</td></tr><tr><td>RNA 밀레니엄 마커</td><td>Ambion</td><td>AM7150</td><td>프로토콜 2.2.2</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Amresco</td><td>X328</td><td>프로토콜 2.2.5</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td>프로토콜 2.2.5 추적 염료</td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>시그마</td><td>114391</td><td>프로토콜 2.2.5 추적 염료</td></tr><tr><td>Xylene Cyanol FF</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td>프로토콜 2.2.5 추적 염료</td></tr> 염화<tr><td>나트륨 이수화물</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>프로토콜 2.4.2 20x SSC 버퍼</td></tr><tr><td>구연산 삼나트륨</td><td>시그마</td><td>S1804</td><td>프로토콜 2.4.2 20x SSC 버퍼</td></tr><tr><td>Hybond 블로팅 페이</td>퍼 <td>GE 헬스케어</td><td>RPN6101M</td><td>프로토콜 2.4.4</td></tr><tr><td>GE Hybond-N+ 멤브레인</td><td>GE 헬스케어</td><td>RPN303B</td><td>프로토콜 2.4.6</td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td>프로토콜 3.1.2</td></tr><tr><td>Gel Catcher 1500</td><td>ANT Technology</td><td>Gel Catcher 1500</td><td>프로토콜 3.1.5</td></tr><tr><td>Anti-m6A (N6-methyladenosine)</td><td>Synaptic Systems</td><td>202003</td><td>Protocol 3.2.3</td></tr><tr><td>Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP linkd whole Ab</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td><td>프로토콜 3.2.5</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP 시스템</td><td>BIO-RAD</td><td>1708280</td><td>프로토콜 3.2.8</td></tr></tbody></table>

rna 측정 방법<em&gt; n</em<sup&gt; 6</sup세포와 조직에서&gt; -methyladenosine 수정

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N 6-Methyladenosine (m6A) RNA의 변형은 진핵생물 사이에서 다양하고 어디에나 있습니다. mRNA, rRNA, tRNA 및 microRNA에서 발생합니다. 최근 연구에 따르면 이러한 가역적 RNA 변형은 RNA 접합, 번역, 분해 및 국소화에 영향을 미친다고 합니다. 일주기 리듬, 줄기 세포 다능성, 섬유증, 트리글리세리드 대사 및 비만과 같은 여러 생리학적 과정도m6A 변형에 의해 제어됩니다. 면역침전/염기서열분석법, 질량분석법 및 변형된 노던 블로팅은m6A 변형을 측정하기 위해 일반적으로 사용되는 방법 중 일부입니다. 여기서, 우리는m6A 변형을 측정하기 위한 북동 블로팅 기술을 제시한다. 현재 프로토콜은 RNA의 우수한 크기 분리, 다양한 실험 설계를 위한 더 나은 수용 및 표준화, 다양한 RNA 소스에서 m6A 변형의 명확한 묘사를 제공합니다. m6A 변형은 일주기 리듬 및 비만과 관련하여 인간 생리학에 결정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있지만, 다른 (병리적) 생리학적 상태에서의 역할은 불분명합니다. 따라서 m6A 변형에 대한 연구는 분자 생리학에 대한 핵심 통찰력을 제공할 수 있는 엄청난 가능성을 가지고 있습니다.

정상 명암 주기성 단계 14 일 후에 야생형 마우스 상수 어둠 속에 넣었다. 간에서 RNA를 4 시간 간격으로 샘플링 및 수정 북부 블로 팅으로 연구 하였다. rRNAs, mRNA를, 작은 RNA를의 메틸화는 명확하게 (그림 2) 검출되었다. 상이한 주기성 시간 사이의 비교 (CT)을 정확하게 18S rRNA의 기준을 산출 할 수있다. rRNA의, mRNA를, 작은 RNA를에서 m 6 수준의 강력한 일중 진동이 있었다. rRNA의 proffered 의해 간섭을 방지하기 위해, 폴리아 데 닐화 RNA를 단계 1.2.2와 같이 정제 될 수있다. 정제 후, rRNA의 크게 다른 RNA를 (도 3)의보다 나은 시각화를 허용하도록 제거 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig1.jpg" /> <stron<html> g&gt;도 1 : 오 이송 유닛 조립. 멤브레인에 블 롯팅을위한 RNA를 모세관 반송 유니트가 도시되어있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig2.jpg" /> 그림 2 : C57BL / 6J 마우스의 m 6 수준의 활동 일주기. 이 그림은 m 6 야생형 생쥐의 간에서 총 RNA의 얼룩은 4 시간 간격으로 정상 명암 단계 14 일 이후에 어두운 어두운 단계의 첫 번째 날에 희생 보여줍니다. 정량화는 6 m 18S와 28S rRNA의 사이의 화상 농도의 차이를 사용하여 수행 하였다. m 개의 6 풍요 로움은 맨 아래에있는 포름 알데히드 겔에서 18S rRNA의 대역으로 표준화되었다.등 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig3.jpg" /> 그림 3 : 또는 rRNA의없는 m 6의 말. 대표 m는 총 RNA와 야생형 생쥐의 간에서 폴리아 데 닐화 RNA의 6 롯이 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="3"> 10 배 MOPS 완충액 (pH 7.0, 빛으로부터 보호) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> MOPS </td><td> 41.85 </td><td> 지 </td><td> 0.2 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 아세트산 나트륨 </td><td> 4.1 </td><td> 지 </td><td>0.05 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> EDTA,이 나트륨 소금 </td><td> 3.7 </td><td> 지 </td><td> 0.01 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC 물 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 합계 </td><td> 1 </td><td> 엘 </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 실온에서 교반 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 이 </td><td colspan="3"> 20 배의 SSC 완충액 (pH 7.0) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 염화나트륨 </td><td> 175.3 </td><td> 지 </td><td> 3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 트리 소듐 시트 레이트 </td><td> 88.3 </td><td> 지 </td><td> 0.3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC 물 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 합계 </td><td> 1 </td><td> 엘 </td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td colspan="3"> 실온에서 교반 한 후, 오토 클레이브 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 삼 </td><td colspan="3"> 추적 염료 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 10 배 MOPS 버퍼 </td><td> (500) </td><td> μL </td><td> 1 배 </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 피콜 (400) </td><td> 0.75 </td><td> 지 </td><td> 15 % </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 블루 브로 모 페놀 </td><td> 0.01 </td><td> 지 </td><td> 0.2 % </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 크실렌 Cyanol </td><td> 0.01 </td><td> 지 </td><td> 0.2 % </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC 물 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 합계 </td><td> (5) </td><td> mL의 </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 스토어 -20 ° C에서 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="3"> DEPC 물 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 1 비율로 희석 : DEPC의 1,000 DDH 2 O에 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 실온에서 밤새 교반 한 후, 오토 클레이브 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> (5) </td><td colspan="3"> 샘플 버퍼 (빛으로부터 보호) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 10 배 MOPS 버퍼 </td><td> (200) </td><td> μL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 37 % 포름 알데히드 </td><td> (270) </td><td> μL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 포름 아미드 </td><td> (660) </td><td> μL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 스토어 -20 ° C에서 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tboDY&gt; </table> 표 1 : 버퍼 및 솔루션을 제공합니다.

RNA에 N 6 -methyladenosine (m 6 A) 변형을 측정하기위한 수정 북부 블로 팅 방법을 설명한다. 현재의 방법은 여러 가지 실험 설계에 따라 다양한 RNA를에서 수정 및 컨트롤을 감지 할 수 있습니다.

RNA 측정 방법<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup세포와 조직에서&gt; -methyladenosine 수정

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

수정된 노던 블로팅(northern blotting) 기법의 전반적인 목표는 RNA 내의 N6-메틸아데노신, n6A 수정을 측정하고 다양한 RNA에서의 수정을 검출하는 것입니다. 이 방법은 N6-메틸아데노신 수정과 같은 RNA 후성유전학의 역할에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기법의 주요 장점은 RNA의 효과적인 분리를 제공하고, 실험 설계에 대한 더 나은 표준화를 가능하게 하며, RNA 내의 n6A 수정을 명확하게 묘사할 수 있다는 점입니다.이 방법은 RNA의 n6A 수식화에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 서로 다른 검출 항체를 사용하여 다른 RNA 수식화에도 적용할 수 있습니다. 실험을 시작하기 위해, 리보핵산분해효소(ribonuclease) 제염 용액을 페이퍼 타월에 뿌려 피펫과 실험대 표면을 닦아냅니다. 그다음 nuclease free water를 페이퍼 타월에 적셔 피펫과 실험대 표면을 다시 한번 닦아냅니다.4°C로 유지된 RNA 분리 용액을 준비하고, 약 75 mg의 생쥐 조직에 용액 1 mL를 첨가합니다. 오버헤드 교반기를 사용하여 조직을 균질화합니다. 그다음, 시료 균질액 1 mL당 100 µL의 1-Bromo-3-chloropropane(BCP)을 첨가합니다.튜브를 15초 동안 강하게 흔든 후 총 RNA 분리를 진행합니다. 분광광도계를 사용하여 260 nm 및 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 RNA 농도를 결정합니다. 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 RNA 샘플의 품질을 확인합니다.모든 전기영동 장비를 diethylpyrocarbonate 또는 DEPC 처리수로 헹굽니다. 삼각 플라스크에 2.5 g의 agarose와 215 mL의 DEPC 처리수를 넣고 마이크로웨이브를 사용하여 혼합물을 완전히 녹입니다. 용액이 녹은 후, 12.5 mL의 10X MOPS 완충액을 추가합니다.그리고 22.5 mL의 37% formaldehyde를 플라스크에 넣습니다. 그다음 1.5 mm 두께의 콤이 장착된 전기영동 장치에 용액을 붓습니다. 깨끗한 콤을 사용하여 겔의 가장자리로 기포를 밀어냅니다.겔을 상온에서 응고시킵니다. 다음으로, 미리 준비한 1X MOPS 전기영동 버퍼를 사용하여 겔의 웰을 헹구고 겔을 사전 작동시킵니다. RNA 샘플을 겔의 웰에 로딩한 후, 전기영동을 수행합니다.다음 날, UV 램프 아래에서 젤을 관찰하고 사진을 촬영합니다. 전이를 준비하기 위해 젤을 자르고 불필요한 부분을 제거합니다. 10X saline sodium citrate 또는 SSC 버퍼 500 milliliters를 준비합니다.10X SSC 버퍼로 겔을 두 번 세척합니다. 겔을 충분히 덮을 수 있는 크기로 필터 페이퍼 한 장을 자릅니다. 겔과 동일한 크기로 필터 페이퍼 네 장을 자릅니다.다음으로, 양전하 나일론 멤브레인 한 장을 겔과 동일한 크기로 자릅니다. 올바른 방향을 확인할 수 있도록 겔과 멤브레인에 표식으로 홈을 냅니다. 멤브레인을 2X SSC 버퍼에 담가 적십니다.전송 트레이에 10X SSC 완충액 500 milliliters를 붓습니다. 커다란 필터 페이퍼 시트를 유리판 위에 놓고 전송 완충액으로 필터 페이퍼를 적십니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 기포를 밀어내어 제거합니다.미리 잘라둔 여과지 두 장을 전사 버퍼에 적신 후, 여과지 중앙에 놓습니다. 기포를 모두 제거합니다. 그다음 겔의 윗면이 여과지를 향하도록 겹쳐 놓은 뒤, 겔과 멤브레인의 홈 위치를 정확히 맞추어 겔 위에 멤브레인을 올립니다.다음으로, 미리 잘라둔 필터 페이퍼 두 장을 멤브레인 위에 올립니다. 층 사이의 기포를 모두 제거합니다. 젤 주변을 플라스틱 랩으로 감싸서 수건이 젤과 멤브레인을 통과하는 완충액만 흡수하도록 합니다.그 다음 필터 페이퍼 위에 종이 타월을 겹쳐 쌓습니다. 타월 위에 크기가 큰 유리판을 올리고, 그 위에 무게추를 놓아 RNA가 겔에서 멤브레인으로 하룻밤 동안 전이되도록 합니다. 전이 후에는 멤브레인을 2X SSC 버퍼에 적셔 습한 상태로 유지하십시오.두 장의 필터 페이퍼를 10X SSC 버퍼에 적신 후, UV 교차결합기(cross linker)에 넣습니다. RNA가 흡수된 면이 위를 향하게 한 다음, 필터 페이퍼 위에 멤브레인을 올립니다. 자동 교차결합(auto cross link) 모드를 선택하고 시작 버튼을 눌러 조사를 시작합니다.UV 젤 이미지 캡처기를 사용하여 멤브레인과 젤을 검사하여 젤에서 멤브레인으로 RNA가 전이되었는지 확인합니다. 실온에서 1시간 동안 TBST 버퍼 내의 5% 무지방 우유로 멤브레인을 블로킹합니다. 4°C에서 m6A 항체 용액에 멤브레인을 넣고 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, TBST 버퍼로 멤브레인을 15분 동안 세 번 세척합니다. 그다음, HRP가 접합된 donkey anti-rabbit 항체 용액에 멤브레인을 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, TBST 버퍼로 멤브레인을 15분 동안 세 번 세척합니다.강화 화학발광 기질을 처리합니다. 디지털 이미저를 사용하여 화학발광을 캡처합니다. 마지막으로 m6A 정량 단계로 넘어가 Image J를 이용해 상대적인 m6A 화학발광 강도를 측정합니다. 마우스 간 RNA를 4시간 간격으로 샘플링하여 수정된 노던 블로팅 기술로 분석하였습니다.rRNA, mRNA 및 small RNA의 메틸화가 명확하게 검출되었습니다. 야생형 생쥐 간에서 추출한 전체 RNA 및 rRNA가 제거된 RNA를 대상으로 대표적인 m6A 블롯을 수행하였습니다. 이 기술에 익숙해지면 적절한 절차에 따라 4일 이내에 완료할 수 있습니다.이 기술의 개발 이후, RNA 후성유전학 분야의 연구자들은 일주기 리듬 및 비만과 관련된 인체 생리학적 영향력을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.

a-method-for-measuring-rna-n6-methyladenosine-modifications-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리가 효 모 RNA 수정 효소, Mod5, 생 화 확 적인 특성에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기,이 프로토콜 다른 RNA 수정 효소 적용할 수 토론.

TRNA Isopentenyl 전이 효소 활동을 감지 하는 체 외에서 분석 결과

여기에서 우리는 RNA의 DNAzyme 의존적인 절단을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이를 통해 RNA 2'-O-메틸화의 신속하고 현장 의존적인 분석을 가능하게 합니다. 이러한 접근법은 스노RNA 활성의 예비 또는 주요 평가를 위해 사용될 수 있다.

RRNA 2'-O-메틸화의 DNAzyme 의존분석

여기서, 합성 또는 시험관내 전사 RNA에 대한 메틸트랜스퍼라제 활성의 직접 분석을 위한 항체-무체질 시험관내 분석이 기재되어 있다.

RNA 메틸 트랜스퍼라제 활성 분석을 위한 항체 무첨가 분석

메틸화 RNA 면역 침전 분석법은 메틸화 RNA 단편을 농축하는 데 사용되는 항체 기반 방법입니다. 깊은 시퀀싱과 결합하여 m5C수정을 운반하는 성적 증명서를 식별합니다.

메틸화 RNA 면역 침전 분석연구 m5C 변형에 대한 애비독증

식물에서 생체 내 뉴클레오시드/뉴클레오티드 정량화를 위한 정밀하고 재현 가능한 방법은 여기에 설명된다. 이 방법은 HPLC-MS/MS를 사용합니다.

HPLC-MS/MS를 사용하여 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량 측정을 위한 식물 샘플 준비

본 프로토콜은 1H-NMR 분광법에 의한 유리 및 단백질 결합 아르기닌 및 메틸 아르기닌의 제조 및 정량 측정을 설명합니다.

핵자기공명분광법에 의한 아르기닌 메틸롬 탐구

RNA의 전사 후 변형은 최근에 중추 신경계 가소성과 관련이있는 번역 조절의 과소 연구 된 층을 나타냅니다. 여기에서, 샘플 준비 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광법 접근법은 단일 뉴런에서 수많은 RNA 변형의 동시 특성화를 위해 기술된다.

질량 분광법을 사용하여 단일 뉴런의 RNA 변형 특성화

이 프로토콜은 돌연변이 프로파일링 실험을 위해 디메틸 설페이트로 RNA를 변형하기 위한 지침을 제공합니다. 여기에는 두 가지 대체 라이브러리 준비 방법을 사용한 시험관 내 및 생체 내 프로빙이 포함됩니다.

디메틸 설페이트를 사용한 RNA 구조 프로빙 시험관 내 및 세포에서 시퀀싱을 사용한 돌연변이 프로파일링

여기서는 도트 블롯을 이용해 전반 m⁶A 수치를 반정량적으로 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 총 RNA를 추출, 변성, 나일론 막에 점상화하고, 항-m⁶A 항체로 탐침하며, 화학발광으로 시각화합니다. ImageJ 그레이스케일 분석으로 정량화된 신호 강도는 상대적인 메틸화 풍부도를 반영하여 연구에 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다.

글로벌 N6-메틸라데노신 RNA 변형 수준을 검출하기 위한 도트 블롯 분석

이 프로토콜은 MeRIP-qPCR을 사용하여 특정 RNA의m6A 변형 수준을 상세히 평가하는 접근법을 제공합니다.

골육종 세포에서 특정 RNA의 m6A 변형 수준을 검출하기 위한 MeRIP-qPCR 분석법

학습하세요 수정된 노던 블로팅 기법으로 RNA의 N6-메틸아데노신(m6A) 변형을 측정하는 방법을. 마우스 조직에서 RNA를 분리하고 전기영동 및 항체 검출을 통해 rRNA, mRNA, 소형 RNA에서 m6A 변형을 효과적으로 분석할 수 있습니다.

RNA 측정 방법

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