RNA 측정 방법

수정된 노던 블로팅(northern blotting) 기법의 전반적인 목표는 RNA 내의 N6-메틸아데노신, n6A 수정을 측정하고 다양한 RNA에서의 수정을 검출하는 것입니다. 이 방법은 N6-메틸아데노신 수정과 같은 RNA 후성유전학의 역할에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기법의 주요 장점은 RNA의 효과적인 분리를 제공하고, 실험 설계에 대한 더 나은 표준화를 가능하게 하며, RNA 내의 n6A 수정을 명확하게 묘사할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 RNA의 n6A 수식화에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 서로 다른 검출 항체를 사용하여 다른 RNA 수식화에도 적용할 수 있습니다. 실험을 시작하기 위해, 리보핵산분해효소(ribonuclease) 제염 용액을 페이퍼 타월에 뿌려 피펫과 실험대 표면을 닦아냅니다. 그다음 nuclease free water를 페이퍼 타월에 적셔 피펫과 실험대 표면을 다시 한번 닦아냅니다.

4°C로 유지된 RNA 분리 용액을 준비하고, 약 75 mg의 생쥐 조직에 용액 1 mL를 첨가합니다. 오버헤드 교반기를 사용하여 조직을 균질화합니다. 그다음, 시료 균질액 1 mL당 100 µL의 1-Bromo-3-chloropropane(BCP)을 첨가합니다.

튜브를 15초 동안 강하게 흔든 후 총 RNA 분리를 진행합니다. 분광광도계를 사용하여 260 nm 및 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 RNA 농도를 결정합니다. 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 RNA 샘플의 품질을 확인합니다.

모든 전기영동 장비를 diethylpyrocarbonate 또는 DEPC 처리수로 헹굽니다. 삼각 플라스크에 2.5 g의 agarose와 215 mL의 DEPC 처리수를 넣고 마이크로웨이브를 사용하여 혼합물을 완전히 녹입니다. 용액이 녹은 후, 12.5 mL의 10X MOPS 완충액을 추가합니다.

그리고 22.5 mL의 37% formaldehyde를 플라스크에 넣습니다. 그다음 1.5 mm 두께의 콤이 장착된 전기영동 장치에 용액을 붓습니다. 깨끗한 콤을 사용하여 겔의 가장자리로 기포를 밀어냅니다.

겔을 상온에서 응고시킵니다. 다음으로, 미리 준비한 1X MOPS 전기영동 버퍼를 사용하여 겔의 웰을 헹구고 겔을 사전 작동시킵니다. RNA 샘플을 겔의 웰에 로딩한 후, 전기영동을 수행합니다.

다음 날, UV 램프 아래에서 젤을 관찰하고 사진을 촬영합니다. 전이를 준비하기 위해 젤을 자르고 불필요한 부분을 제거합니다. 10X saline sodium citrate 또는 SSC 버퍼 500 milliliters를 준비합니다.

10X SSC 버퍼로 겔을 두 번 세척합니다. 겔을 충분히 덮을 수 있는 크기로 필터 페이퍼 한 장을 자릅니다. 겔과 동일한 크기로 필터 페이퍼 네 장을 자릅니다.

다음으로, 양전하 나일론 멤브레인 한 장을 겔과 동일한 크기로 자릅니다. 올바른 방향을 확인할 수 있도록 겔과 멤브레인에 표식으로 홈을 냅니다. 멤브레인을 2X SSC 버퍼에 담가 적십니다.

전송 트레이에 10X SSC 완충액 500 milliliters를 붓습니다. 커다란 필터 페이퍼 시트를 유리판 위에 놓고 전송 완충액으로 필터 페이퍼를 적십니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 기포를 밀어내어 제거합니다.

미리 잘라둔 여과지 두 장을 전사 버퍼에 적신 후, 여과지 중앙에 놓습니다. 기포를 모두 제거합니다. 그다음 겔의 윗면이 여과지를 향하도록 겹쳐 놓은 뒤, 겔과 멤브레인의 홈 위치를 정확히 맞추어 겔 위에 멤브레인을 올립니다.

다음으로, 미리 잘라둔 필터 페이퍼 두 장을 멤브레인 위에 올립니다. 층 사이의 기포를 모두 제거합니다. 젤 주변을 플라스틱 랩으로 감싸서 수건이 젤과 멤브레인을 통과하는 완충액만 흡수하도록 합니다.

그 다음 필터 페이퍼 위에 종이 타월을 겹쳐 쌓습니다. 타월 위에 크기가 큰 유리판을 올리고, 그 위에 무게추를 놓아 RNA가 겔에서 멤브레인으로 하룻밤 동안 전이되도록 합니다. 전이 후에는 멤브레인을 2X SSC 버퍼에 적셔 습한 상태로 유지하십시오.

두 장의 필터 페이퍼를 10X SSC 버퍼에 적신 후, UV 교차결합기(cross linker)에 넣습니다. RNA가 흡수된 면이 위를 향하게 한 다음, 필터 페이퍼 위에 멤브레인을 올립니다. 자동 교차결합(auto cross link) 모드를 선택하고 시작 버튼을 눌러 조사를 시작합니다.

UV 젤 이미지 캡처기를 사용하여 멤브레인과 젤을 검사하여 젤에서 멤브레인으로 RNA가 전이되었는지 확인합니다. 실온에서 1시간 동안 TBST 버퍼 내의 5% 무지방 우유로 멤브레인을 블로킹합니다. 4°C에서 m6A 항체 용액에 멤브레인을 넣고 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, TBST 버퍼로 멤브레인을 15분 동안 세 번 세척합니다. 그다음, HRP가 접합된 donkey anti-rabbit 항체 용액에 멤브레인을 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, TBST 버퍼로 멤브레인을 15분 동안 세 번 세척합니다.

강화 화학발광 기질을 처리합니다. 디지털 이미저를 사용하여 화학발광을 캡처합니다. 마지막으로 m6A 정량 단계로 넘어가 Image J를 이용해 상대적인 m6A 화학발광 강도를 측정합니다. 마우스 간 RNA를 4시간 간격으로 샘플링하여 수정된 노던 블로팅 기술로 분석하였습니다.

rRNA, mRNA 및 small RNA의 메틸화가 명확하게 검출되었습니다. 야생형 생쥐 간에서 추출한 전체 RNA 및 rRNA가 제거된 RNA를 대상으로 대표적인 m6A 블롯을 수행하였습니다. 이 기술에 익숙해지면 적절한 절차에 따라 4일 이내에 완료할 수 있습니다.

이 기술의 개발 이후, RNA 후성유전학 분야의 연구자들은 일주기 리듬 및 비만과 관련된 인체 생리학적 영향력을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.