인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정
2016년 11월 11일
여기에서는 생체 일주기 발광과 인간 섬 세포 및 일차 근관의 분비 활동을 병렬로 모니터링하기 위한 설정에 대해 설명합니다. 이를 위해 루시페라제 코어 클럭 리포터의 렌티바이러스 유전자 전달을 사용한 후, 연속적인 세포 주혈에 의한 유출 매질의 체외 동기화 및 수집을 수행했습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 생체 일주기 발광과 체외에서 배양 및 동기화된 인간 1차 내분비 세포의 분비 활성을 병렬적으로 평가하는 것입니다. 이 방법은 세포 분비의 시간적 패턴과 세포 자율 생체 시계에 의해 어떻게 조절될 수 있는지 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 리포터 활동으로 일주기 루시페린을 모니터링하고 동시에 분비 호르몬 및 마이오카인 수치를 측정하기 위한 유출 매체를 수집할 수 있다는 것입니다. 렌티바이러스 형질도입을 통해 일주기 생물발광 리포터를 일차 세포에 도입하기 위해, 먼저 30%에서 50%의 포화도에서 인간 근아세포를 포함하는 3.5cm 페트리 접시를 층류 캐비닛으로 전달합니다. 인간 근아세포 배지를 2mL의 성장 배지로 교체합니다. 그런 다음 렌티바이러스 용액을 접시에 피펫팅하여 1차 세포 배양을 transduction하여 3과 같은 감염 다중도를 얻습니다. 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다. 다음날 매체를 변경합니다. 체외 동기화를 달성하려면 이전에 transfection된 primary cells를 포함하는 3.5cm 페트리 접시당 배지 2mL에 10마이크로몰 adenylyl cyclase activator를 추가합니다. 37도에서 60분 동안 세포를 배양합니다.
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개요
본 연구에서는 인간 췌도 세포와 일차 근관 세포의 분비 활성과 더불어 서카디안 생체 발광을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 루시페라제 핵심 시계 리포터의 렌티바이러스 유전자 전달 후, 인비트로 동기화 및 배지 수집을 위한 지속적인 세포 관류 과정을 포함합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 시간 생물학
배경
- 서카디언 리듬은 세포 기능에서 결정적인 역할을 합니다.
- 생물 발광 모니터링을 통해 세포 활동에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.
- 인간 췌도 세포는 인슐린 분비에 필수적입니다.
- 1차 근관은 근육 생리학 연구에 중요합니다.
연구 목적
- circadian rhythms과 분비 활동 사이의 관계를 조사한다.
- 세포 기능의 실시간 모니터링을 위한 방법을 개발한다.
- 인체 세포 내 대사 과정에 대한 이해를 증진한다.
사용된 방법
- 루시퍼레이스 리포터 발현을 위한 렌티바이러스 유전자 전달.
- 세포 배양의 인 비트로(in vitro) 동기화.
- 배지 수집을 위한 연속 관류.
- 생체 리듬 평가를 위한 생물 발광 측정.
주요 결과
- 인간 췌도 세포에서 서카디안 생체 발광 모니터링 성공.
- 일차 근관 세포의 분비 활성 입증.
- 세포 리듬 연구를 위한 신뢰할 수 있는 방법 확립.
- 서카디안 생물학과 세포 기능 간의 상호작용에 대한 통찰 제공.
결론
- 본 연구는 세포 활동을 실시간으로 모니터링하는 새로운 접근 방식을 제시합니다.
- 연구 결과는 대사에 미치는 일주기 리듬의 영향에 대한 이해에 기여합니다.
- 당뇨병 연구 및 근육 생리학 분야에서의 잠재적 응용 가능성을 보여줍니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
인간 일차 세포 배양에서 서카디언 리듬 유전자 발현과 호르몬 분비를 동시에 측정하면, 인간 내분비 및 근육 체계의 시간적 조절 기전을 직접적으로 조사할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 분자 서카디언 오실레이터를 기능적 분비 출력물과 연결함으로써 타겟 검증의 예측 신뢰도를 높여줍니다. 발굴 단계에서 이러한 측정치를 통합하는 것은 포트폴리오 전반의 대사 및 시간생물학 프로그램의 리스크 조정 기반 추진을 지원합니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 일차 배양 인간 세포에서 시계 유전자 활성과 호르몬 및 마이오카인 분비 간의 상관관계를 분석하여 기전적 리스크 제거(de-risking)가 가능합니다.
- 핵심 시계 유전자를 억제하고 하위 분비 효과를 정량화함으로써 기능적 타겟 검증을 지원합니다.
- 대사 및 내분비 타겟에 대한 경로 선택 시 예측 신뢰도를 높여줍니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 강력한 분석법 개발을 위해 검증되고 동기화된 일차 세포 시스템을 구축합니다.
- 유전자 발현과 분비 활성 모두에 대해 정량적이고 시간 분해능이 있는 판독 값을 제공합니다.
- 생체 시계로 조절되는 출력물에 미치는 화합물 또는 유전적 섭동 효과에 대한 재현성 있는 평가를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 1차 췌도 및 근육 세포를 사용하여 in vitro 연구 결과를 질환 관련 인간 생리학과 연계합니다.
- 분자 시계의 교란을 기능적 분비 표현형과 연결함으로써 중개 바이오마커 발굴을 지원합니다.
- 대사 및 시간생물학 연구에서 기초 발견부터 전임상 검증까지의 연속성을 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 방법은 인간 일차 세포에서 일주기 조절에 대한 가설 검증을 가능하게 함으로써 초기 발견과 전임상 연구 사이의 가교 역할을 하며, 타겟 검증과 중개 연구의 연속성을 모두 지원합니다.
- 발견 생물학: 서카디안 유전자 기능과 그것이 분비 경로에 미치는 영향에 대한 직접적인 테스트가 가능합니다.
- 스크리닝: 화합물 평가를 위해 정량적 결과물을 도출하는 동기화된 분석 준비 완료 1차 세포 모델을 제공합니다.
- 분석: 조건 간의 강력한 통계적 비교를 위해 시간 분해 생물 발광 및 분비 데이터를 생성합니다.
- 중개 연구: 분자 시계 교란을 인간 세포의 질병 관련 분비 표현형과 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 1차 세포 유형과 표적에 걸쳐 서카디안 조절을 평가할 수 있는 재사용 가능한 플랫폼을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 타겟 검증 시 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 일차 인간 세포에서의 장기 병렬 측정 워크플로우를 표준화합니다.
- 전략적 가치: 질병 관련 시스템에서 분자적 출력과 기능적 출력을 연결함으로써 go/no-go 결정 능력을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 대사 및 시간생물학 프로그램의 위험 조정 우선순위 선정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 렌티바이러스 형질도입, 일차 세포 배양 및 생물 발광 측정에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 동기화된 주변 융합 시스템(perifusion systems)과 고감도 호르몬/마이오카인 분석법에 대한 접근 권한이 필요합니다.
- 재현 가능한 시계열 데이터 수집을 위해 팀 간의 표준화가 요구됩니다.
- 서로 다른 일차 세포 유형이나 분비 종점(secretory endpoints)에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 각 응용 분야에 대해 장기 배양 및 리포터 안정성을 검증해야 합니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
2:24
Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
5:33
Conclusion
