소형 동물 모델에서의 동정맥 (AV) 루프는 혈관 신생과 혈관을 조성한 조직 공학을 공부하기

이 미세수술 접근법의 전반적인 목표는 혈관화되고 이식이 가능한 조직을 공학적으로 제작하고, 생체 내 및 분리되어 특성이 잘 규명된 환경에서 혈관 형성을 분석하기 위한 동정맥 루프를 생성하는 것입니다. 이 방법을 통해 우리는 개별 환자의 요구 사항에 맞춘 다양한 종류의 혈관화 조직을 생성하기 위해 우리 자신의 신체를 살아있는 바이오 리액터로 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생성된 조직이 혈관 통로와 함께 이식될 수 있으며, 수혜자의 국소 혈관과 연결되어 산소와 영양분을 즉각적으로 공급받을 수 있다는 점입니다.

조직 공학 연구 외에도, 이 방법은 살아있는 생물체 내의 혈관 협착 과정에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 암 혈관 신생과 같은 병리적 상황에도 적용이 가능합니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 서브밀리미터 혈관의 미세 문합술과 같이 수술의 복잡도가 높기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

우리는 먼저 상당한 공여부 이환을 초래하는 자가 혈관화 조직의 이식이 필요한 광범위한 조직 결손의 임상 사례들에 직면했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 적절한 마취 상태를 확인한 후, 쥐의 무게를 측정하여 약물 투여량을 계산하십시오. 그 다음, 마취 중 건조증을 방지하기 위해 안연고를 도포하십시오.

진통제와 항생제를 투여한 후, 쥐를 가열 패드 위에 놓고 이소플루란을 지속적으로 투여합니다. 그런 다음, 발가락 꼬집기 테스트를 통해 마취 수준을 다시 확인합니다. 가능하다면 펄스 옥시미터(pulse oximetry)를 사용하여 쥐의 마취 수준을 함께 확인하십시오.

뒷다리 안쪽을 면도한 후, 베타딘과 알코올을 교대로 사용하여 수술 부위를 소독합니다. 그다음, 뒷다리를 벌려 접착 테이프로 고정합니다.

마지막으로, 쥐를 수술 현미경 아래에 배치하고 소독포를 덮습니다. 멸균 절차에 따라 수술을 진행합니다. 메스를 사용하여 왼쪽 허벅지 중앙의 무릎 윗부분부터 서혜부까지 세로로 절개하여 피부를 엽니다.

다음으로, 해부 가위와 미세 핀셋을 사용하여 피하 조직과 근막을 약 3cm 길이로 층별로 절개합니다. 서혜부의 골반 동맥부터 무릎까지 대퇴 혈관다발이 노출될 때까지 진행합니다. 그 다음, 조직 가위와 미세 핀셋을 사용하여 혈관을 분리하고 주변 조직을 제거합니다.

필요에 따라 전기 응고법을 사용하여 측분지들을 응고시킵니다. 완료되면 수술 부위를 젖은 거즈로 덮고 쥐의 오른쪽에서도 동일한 절차를 반복합니다. 이제 첫 번째 절차가 대칭적으로 완료되었으므로, 정맥 이식편 채취를 시작합니다.

먼저, 전기 응고법을 사용하여 오른쪽 대퇴정맥의 근위단과 원위단을 결찰함으로써 약 1~1.5 cm 길이의 이식편을 얻습니다. 다음으로, 미세 핀셋을 사용하여 정맥 이식편을 제거합니다. 정맥 이식편의 개구부를 확장하기 위해 혈관 확장기를 사용합니다.

그런 다음, 관류 캐뉼라를 사용하여 정맥 이식편을 헤파린 용액으로 세척합니다. 세척된 이식편을 왼쪽 허벅지로 옮기고 오른쪽 부위를 젖은 거즈로 덮습니다. 다음으로, 미세혈관 클램프를 사용하여 왼쪽 서혜부 근위측의 대퇴정맥을 결찰합니다.

그 후 분지 전 무릎 상단 부위의 대퇴정맥 원위부를 응고시킵니다. 문합을 위해 정맥 이식편의 근위단과 정맥의 근위단을 11-0 봉합사를 사용하여 단단 문합법으로 연결합니다. 12시 방향과 6시 방향에 처음 두 개의 봉합사를 배치하는 것으로 시작하십시오.

그 다음, 앞면의 이 지점들 사이에 두 세 개의 봉합사를 더 넣습니다. 그런 다음 뒷면에 두 세 개의 봉합사를 더 넣습니다. 루프 혈관의 문합은 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다.

루프 혈관의 폐쇄 위험을 줄이기 위해 봉합을 가능한 한 정확하게 수행하는 것이 중요합니다. 다음으로, 대퇴정맥을 결찰한 것과 마찬가지로 미세 혈관 클램프로 대퇴동맥을 집어 전기 응고술을 사용하여 결찰합니다. 계속 진행하기 전에 루프 혈관이 꼬이지 않았는지 확인하십시오.

그 다음, 이전에 시연한 것과 동일한 봉합 기술을 사용하여 정맥 이식편의 원위단과 동맥의 근위단을 문합합니다. 두 번째 문합이 완료되면, heparan 25 iu를 정맥 투여합니다. 이제 루프 혈관이 꼬이지 않았는지 다시 한번 확인한 후 클램프를 제거합니다.

약 5분 동안 루프를 관찰하여 누출 여부와 개통성을 확인하십시오. 개통성이 있다면 루프가 확장되고 동맥의 맥동이 보일 것입니다. 관찰하는 동안 혈관 경련을 방지하기 위해 혈관에 파파베린(papaverine)을 소량 떨어뜨리십시오.

다음으로, 매트릭스 혼합물의 첫 번째 절반 분량인 약 0.5 mL를 이식 챔버에 미리 채웁니다. 그런 다음 루프를 이식 챔버 내에 매립합니다. 피브린 덩어리 두 개로 챔버 입구를 막고, 매트릭스 혼합물의 나머지 절반을 채워 총 부피를 1 mL로 맞춥니다.

이제 허벅지에 챔버를 고정하고, 뚜껑으로 챔버를 밀봉한 뒤 비흡수성 6-0 봉합사로 뚜껑을 고정합니다. 그 다음, 추가적인 비흡수성 6-0 봉합사를 사용하여 이식 챔버를 허벅지에 고정합니다. 전기 응고법을 사용하여 출혈을 지혈합니다.

마지막으로, 흡수성 4-0 봉합사로 피부를 봉합하고 상처 부위를 알루미늄 스프레이로 덮습니다. 골 조직 공학 목적으로, 다양한 종류의 골 대체재를 소동물 쥐 A-V 루프 모델에 이식하였습니다. 혈관 형성 여부는 3D 마이크로 컴퓨터 단층촬영을 통해 관찰하였습니다.

가공된 소 해면골 매트릭스를 6주 동안 사전 혈관화한 결과, 주입된 조골세포의 생존율이 향상되었습니다. 루프를 수확하여 이식 후 다양한 시점에서 절편을 제작하고 염색하였습니다. 예를 들어, H and E 염색 결과, 중간엽 줄기세포와 함께 베타 인산삼칼슘 하이드록시아파타이트 골 대체물을 사용했을 때 6주 이내에 많은 혈관 연결이 형성된 것으로 나타났습니다.

이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 5~6시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 따르면, 광범위한 조건을 연구하기 위해 매우 다양한 세포 인자 또는 항체를 이식할 수 있습니다. 이 기술은 대동물인 양의 정맥 루프 모델에서도 적용 가능합니다.

따라서 연구자들이 임상적으로 유의미한 대량의 혈관화 조직을 생성할 수 있게 될 것입니다. 이 모델은 병리적 조건 하에서의 혈관 형성을 연구할 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 예를 들어, 종양 혈관 네트워크 형성 과정에서 다양한 성장 인자와 세포들의 영향에 대해 조사할 수 있을 것입니다.