Name: 도구로 에틸렌 방출 화합물, 2- 클로로 에틸 산을 활용하여 박테리아의 에틸렌 응답을 공부하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 배우세요 CEPA를 이용한 박테리아 에틸렌 응답 연구 방법으로 식물-미생물 상호작용을 탐구하세요. 이 기술은 가스 형태의 에틸렌을 다루지 않고도 안전하게 세포외 다당류 생산과 박테리아 부착을 분석할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 애기장대 탈리아나 종자를 제공하고 삼중 반응 분석과 관련하여 기술 지원을 해준 Dario Bonetta 박사와 FT-IR에 도움을 준 Simone Quaranta에게 감사를 표합니다. 이 작업은 JLS에 대한 캐나다 디스커버리 그랜트의 자연 과학 및 공학 연구 위원회(NSERC-DG), RVA에 대한 온타리오 대학원 장학금(OGS), AJV에 대한 과학 및 기술 분야의 엘리자베스 2세 여왕 대학원 장학금(QEII-GSST)의 지원을 받았습니다.

1. 화학 <ol><li> 500 밀리미터의 NaH 2 PO 4 · 산성화의 H 2 O (137.99 g / mol)의 (PH 500 mM의 CEPA (144.49 g / 몰)의 용액에, 두 500 mM의 염화나트륨 (58.44 g / 몰)로 이루어진 용액을 준비 2.5) 초순수 0.1 N 염산. 솔루션 분명히 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다. </li><li> 직렬 5 mM 내지 50 mM의 축적량을 획득하기 위해 동일한 용매 (10 배), 500 mM의 용액을 희석. </li><li> 초순수의 1-aminocyclopropane 카르 복실 산 (101.1 g / 몰 ACC)의 10 mM의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 살균 필터 -20 ° C에서 원액 저장할 분취한다. </li><li> 필터 - 소독 셀룰라아제를. 4 ° C에서 보관 씩. </li></ol> 2- 클로로 에틸 산 분해 2. 확인 에틸렌 생산 : 트리플 응답 분석 <ol><li> 기상 방법을 사용하여 생태형 컬럼비아 씨앗 장대 애기 장대를 표면 소독 : 주의 : 다음 단계는 t을 생산호기 염소 가스. 흄 후드에서 종자 소독을 실시한다. <ol><li> 종자 살균을위한 250 ml의 유리 비커를 수용하고 흄 후드에 배치 깊은 충분히 밀폐 용기를 얻습니다. </li><li> A. 추가 장대 미세 원심 관에 씨와는 랙에 튜브를 배치합니다. 밀봉 가능한 용기에 오픈 튜브를 포함하는 선반을 두십시오. 참고 : 염소 가스가 낮은 씨앗을 통과 할 수 있도록 반 전체에 걸쳐 개별 튜브를 기입하지 마십시오. </li><li> 밀봉 가능한 용기에 상업 표백제 100 ㎖를 포함하는 250 ㎖의 비커를 놓습니다. 조심스럽게 표백제에 진한 염산 3 ㎖를 추가하고 즉시 뚜껑이있는 용기를 밀봉. 주의 : 표백제 HCl을 씨앗 표면 살균 작용 독성 염소 가스를 생성하는 반응. </li><li> fumehood 4 시간 동안 염소 가스의 존재하에 씨를 부화. 참고 : 긴 살균 시간은 발아 효율을 감소시킬 것이다. </li><li> 멸균 후, C 허용hlorine 가스는 적어도 1 시간 동안 흄 후드 벤트 microcentrifuge 관을 밀봉합니다. 폐기하기 전에 최소 24 시간의 fumehood에 표백제 및 염산의 혼합물을 둡니다. 주 : 소독 종자 즉시 사용을 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> 장기 저장을 위해 4 ° C에서 씨앗을 보관하십시오. 응축을 방지하기 위해 microcentrifuge 관을 열기 전에 실온 씨앗을 가지고. 어둠에 보관 씨앗. </li></ol></li><li> 4 부문 페트리 접시 (90 X 15mm)에 한천 플레이트를 준비합니다 : <ol><li> A. 성장 배지 110 mL로 준비 장대 모종 : 1X 무라 시게 및 1 % 함유 스쿡 (MS) 기본 배지 (15) (4.33 g / L) (w / v)를 수크로오스 0.8 % (W / V) 한천. NaOH로 pH를 6으로 MS 매체를 조정합니다. </li><li> CEPA의 분해 박테리아 성장 배지 100㎖를 준비한다 슈람 및 Hestrin 16 1.5 %를 함유하는 (SH) 매체 (W / V) 한천. NaOH로 pH를 7로 SH 매체를 조정합니다. </li><li> 고압 증기 멸균 및 템피에 의해 미디어를 소독55 ° C의 물을 욕조에 연구. </li><li> MS는 한천이 강화되면, 멸균 플라스크에 40ml를 추가합니다. A.에 대한 양성 대조군 성장 배지를 제조 장대 모종 10 μM ACC의 최종 농도를 얻기 위해 10mM의 ACC 40 μL와 MS 한천의 40 ml의 분취 량을 보완. </li><li> 섹터 배양 접시 (그림 1)의 해당 사분면에 매체의 5 ML을 추가하고, 한천이 응고 할 수 있습니다. 세중의 모든 접시를 준비합니다. 주 : CEPA 나중에 프로토콜까지 성장 배지에 첨가되지 않는다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig1.jpg" /> 그림 1 :. CEPA와 트리플 응답 분석에 사용 한천 플레이트의 설치 개략도합니다 (음성 대조군 (A), 양성 대조군 (B)에 대한 특정 사분면, 실험 판을 보여줍니다C). 이 그림은 Augimeri과 스트랩 (9)에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="3"><li> 계층화 된 A. 장대 씨앗 동기 발아를 확인합니다 : <ol><li> 약 오십 A. 추가 MS 또는 MS + ACC 한천을 포함하는 각 사분면 상 장대 씨앗. 확인 씨가 균일하게 종묘 제거 및 분석을 용이하게하기 위해 배포됩니다. </li><li> 판 4에서 어둠 속에서 씨앗을 포함 품어 3~4일에 대한 C를 °. </li></ol></li><li> 트리플 응답 분석을 세균 성장 ​​중간에 CEPA (SH)를 분해 수행 <ol><li> 층화 한 후, 2 시간 동안 형광등에 씨앗을 노출. </li><li> SH 한천 함유 실험 판의 사분면에 500 mM의 CEPA 스톡 용액 10 μl를 확산 (PH 7;도 1) CEPA 최종 농도를 수득1 mm의. </li><li> 실험실 필름과 판을 밀봉하고 종자 어두운 환경을 만들기 위해 호일로 다룹니다. </li><li> 아래 한천 측면로 3 일 동안 23 ° C에서 어둠 속에서 판을 배양하여 씨앗을 발아. 주 : 매 적층 될 수 있지만, 에틸렌이 공기보다 가볍기 때문에 네거티브 컨트롤 아래쪽에 배치되어야한다. </li></ol></li><li> 트리플 응답 분석 데이터 분석 : <ol><li> 화염 소독 집게로, 해부 또는 디지털 USB 현미경으로 각 처리 및보기에 해당하는 플레이트에서 하나의 모종을 제거합니다. 상기 모종의 하단에 정렬 및 사진을 확인합니다. </li><li> 각 사분면에서 30 모종 (생물 복제 60 모종 및 치료 당 180 모종)를 제거합니다. 통치자와 검은 색 배경 사진으로 표면에 맞 춥니 다. </li><li> ImageJ에 소프트웨어 (17)를 사용하여 복제 모종의 배축 길이 (mm)를 측정한다. 클릭하고 * 스트레이트를 드래그하여 크기를 설정 *도구 10 mm의 길이를 선택합니다. 은 &quot;분석&quot;탭에서 &quot;설정 규모&quot;를 선택하고 * * 분단 된 도구를 사용하여 (10)로 알려진 거리를 설정, 클릭 및 드래그 거리를 측정하기 위해 배축를 눌러 M의 길이를 선택할 수 있습니다. Tukey의 다중 비 교 검정으로 일방 ANOVA를 사용하여 생물학적 복제 수단을 비교한다. 차이는 &lt;0.05 중요한 경우 페이지 간주됩니다. </li></ol></li></ol> 세균의 성장을 통해 pH를 3. 분석 <ol><li> 세중 xylinus 스타터 문화를 성장 및 정량화 Komagataeibacter : <ol><li> K.의 단일 콜로니를 접종 xylinus 0.2 % (v / v)의 필터 살균 셀룰라아제 보충 SH 배지 5 ㎖ (pH를 5)로. 0.4-0.3 (600)에 도달하는 OD (약 72 시간)까지 150 rpm으로 교반하면서 30 ℃에서 배양 물을 인큐베이션. </li><li> 원심 분리하여 수확 스타터 문화 (2,000 XG, 4 ° C, 10 분). 5 ㎖의 멸균 된 0.85 %와 NAC (/ V w)L 용액, 세포를 두 번 세척하고 세포 펠렛을 재현 탁. 얼음에 세포를 유지합니다. </li><li> Petroff-Hausser 계산 실을 사용하여 세포를 정량화. </li></ol></li><li> 산도의 분석을위한 문화 접종 : <ol><li> 호일 뚜껑 열두 500 ml의 플라스크에 0.2 % (v / v)의 필터 살균 셀룰라아제 보충 SH 국물 (PH 7) 150 ㎖를 추가합니다. K.와 플라스크를 접종 105 세포 / ml의 농도로 xylinus 종자 배양. 세 스타터 문화를 사용, 처리 당 세 생물학적 복제를 준비합니다. </li><li> 5, 50, 500 mM의 CEPA의 원액 300 μL와 보충 문화는 각각 1.0 mM의 0.01, 0.1의 최종 CEPA 농도를 획득하고있다. CEPA를 용해하는데 사용되는 용매 300 μL로 처리되지 않은 대조군 배양액을 보완. </li><li> 단단히 플라스크에 호일 뚜껑을 테이핑하여 플라스크를 밀봉하고 150 rpm으로 교반하면서 30 ℃에서 14 일 동안 문화를 품어. </li></ol></li><li> 매일 aseptica에서야 베드로 (10 분, 4 ° C 2,000 XG) 원심 분리하여 각각의 플라스크 및 펠릿 세포 5 ml의 샘플을 제거합니다. 깨끗한 튜브로 상청액을 옮기고 pH 미터를 이용하여 각 생체 복제의 pH를 측정한다. </li><li> 생물 복제의 평균 pH는 그래프에 의해 시간 코스 데이터를 분석 할 수 있습니다. 참고 : 문화의 pH가 3.5 이하로 떨어지지 않도록하는 것이 중요하다; (5)의 문화 pH는 크게 CEPA에서 에틸렌 방출을 감소시키고, 3.5 이하의 pH는 완전히 에틸렌 방출을 억제한다. </li><li> 염소 인산염 레벨 제어, 0.01, 0.1를 이용하여 동일한 실험을 수행하고, 각각 5, 50, 및 500 mM의 축적량을 이용하여 염화나트륨-의 NaH 2 PO 4 수용액 1.0 mm로. </li></ol> 4. 식민지 형태학 <ol><li> K. 성장 세중 xylinus 스타터 문화 : <ol><li> K.의 단일 콜로니를 접종 xylinus 0.2 % (v / v)의 필터 살균 셀룰라아제 보충 SH 배지 5 ㎖ (pH를 5)로. Incuba0.4-0.3의 OD 600까지 150 rpm으로 교반하면서 30 ℃에서 TE 배양 (약 72 시간)에 도달한다. </li><li> 원심 분리하여 수확 스타터 문화 (2,000 XG, 4 ° C, 10 분). 멸균 생리 식염수 5 mL로 세포를 세척 한 다음 세포 펠렛을 재현 탁. 얼음에 세포를 유지합니다. </li></ol></li><li> 1.5 %의 SH 25 ml에 포함 된 24 한천 플레이트 (PH 7) 매체를 준비 (W / V) 한천. </li><li> 한천은 고형화되면, 각각 0.01, 0.1, 1.0 mM의 최종 CEPA 농도를 얻기 위해 5, 50 μL의 50 및 500 mM의 한천 CEPA 스톡 솔루션 확산. No 변경 구성하고, 용매를 50 μL 확산 설정 미처리 용매 제어 플레이트는, 시험 화합물을 용해시키기 위해 사용된다. </li><li> K.의 루프 전체 (~ 5 μL) 절연 식민지에 대한 킬 판 xylinus 스타터 문화와 파라핀 필름을 밀봉. 세중의 모든 판을 접종한다. 30 ° C에서 5 일 동안 번호판을 품어. </li><li> 포트질적으로 디지털 USB 현미경을 사용하여 20X 배율에서 ograph 식민지는 고체 배지에 식민지 형태와 셀룰로오스 생산을 평가합니다. 참고 : 셀룰로오스는 식민지의 여백을 따라 불투명 한 물질로 나타납니다. </li><li> 염소 인산염 레벨 제어, 0.01, 0.1를 이용하여 동일한 실험을 수행하고, 각각 5, 50, 및 500 mM의 축적량을 이용하여 염화나트륨-의 NaH 2 PO 4 수용액 1.0 mm로. </li></ol> 5. 펠리클 분석 실험 <ol><li> 성장 및 정량화 K. 세중 xylinus 스타터 문화 : <ol><li> 세중에서, K.의 단일 콜로니를 접종 xylinus 0.2 % (v / v)의 필터 살균 셀룰라아제 보충 SH 배지 5 ㎖ (pH를 5)로. 0.4-0.3 (600)에 도달하는 OD (약 72 시간)까지 150 rpm으로 교반하면서 30 ℃에서 배양 물을 인큐베이션. </li><li> 원심 분리하여 수확 스타터 문화 (2,000 XG, 4 ° C, 10 분). 멸균 생리 식염수 5 mL로, t 씻어그 세포를 두번 세포 펠렛을 재현 탁. 얼음에 세포를 유지합니다. </li><li> Petroff-Hausser 계산 실을 사용하여 세포를 정량화. </li></ol></li><li> 24 웰 플레이트에 접종하는 마스터 믹스를 준비합니다 : <ol><li> 각각 0.01, 0.1, 1.0 mM의 최종 CEPA 농도를 얻기 위해 5 50 120 μL, 500 mM의 CEPA 축적량 SH 배지 60 ㎖ (pH가 7)를 보완. CEPA를 용해하는 데 사용되는 용매의 120 μL와 SH 매체 (PH 7)의 또 다른 60 ml의 보충. 소용돌이는 혼합한다. </li><li> 사 14 ml의 분취 량으로 CEPA 함유 매체의 각 60ml를 나눈다. 105 세포 / ml의 농도로 배양 스타터 생물학적 복제와 14 ml의 분취 량 세 접종. 셀룰로오스 생산을 방지하기 위해 얼음에 세포와 튜브를 유지합니다. 주 : 나머지 14 mL를 분취 멸균 대조군 웰에 대해 사용된다. </li></ol></li><li> 24 웰 플레이트에 접종 : <ol><li> 세 생물 복제의 행과 함께 자신의 접시에 각각의 처리를 테스트멸균 컨트롤의 행 (그림 2). </li></ol></li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig2.jpg" /> 그림 2 :. 펠리클 분석 및 분석 주식 CEPA 보충 된 pH가 7 SH 매체 (60 ㎖)에 사용되는 프로토콜을 나타낸 플로우 차트는 세 개의 분리 된 생물학적 복제 예방 접종 및 살균 제어 (14 씩으로)을 위해 분주합니다. 이러한 배양 물은 24 웰 플레이트 여섯 기술 복제 (2 mL)에 분주 한 후 파라핀 필름으로 밀봉된다. 30 ℃에서 7 일간 배양 한 후, 펠리클은 수확 및 FT-IR에 의해 습 중량, 두께, 건조 중량 및 결정 성을 결정하는 것이 특징. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> 14 ml의 마스터 믹스를 사용하여, EAC로 2를 가하여멸균 24 웰 플레이트의 여섯 우물의 시간. 세 가지 생물학적 복제 및 살균 제어 (그림 2)에 대한 완료합니다. 각 치료를 반복합니다. </li><li> 파라핀 필름 인감 접시와 30 ℃에서 7 일간 정적을 품다. </li></ol><ol start="4"><li> 수확 및 측정 펠리클 젖은 무게, 두께, 건조 중량 (셀룰로오스 수율) 및 결정화도 (그림 2) <ol><li> 대향 펠리클 에지 올리고 집게 개별 펠리클을 제거하는 펠리클의 일측 우울. 그립을 유지하면서, 자신의 젖은 가중치를 결정하기 위해 무게 전에 초과 매체를 제거하기 위해 3 초 동안 신선한 종이 타월에 배치. </li><li> 고해상도 디지털 카메라를 사용하여 측면에서 통치자와 사진에 인접 펠리클을 맞 춥니 다. </li><li> ImageJ에 소프트웨어 (17)를 사용하여, 왼쪽 어깨, 오른쪽 어깨와 각 펠리클의 중심 펠리클의 두께를 측정한다. 각 생물 replicat에 대한 모든 기술 복제 평균이자형. </li><li> 개별적 6- 웰 플레이트의 웰에 펠리클을 전송. 20 분 세포 용균을 위해 80 ℃에서 0.1 N의 NaOH 12 ㎖로 펠리클 치료. </li><li> 의 NaOH를 제거하고 교반과 함께 24 시간 동안 초순수로 세척하여 펠리클을 중화. 물마다 6 시간을 변경합니다. 주 : 펠리클이 세정 공정 완료시 백색이어야한다. </li><li> 장소 실리콘 매트에 펠리클과 일정 중량으로 48 시간 동안 50 ° C에서 건조. 건조되면, 박테리아 셀룰로오스 수율을 결정하기 위해 분석 규모의 페리 클 가중치를 매트에서 제거하고 측정한다. </li><li> 4000 ~ 650 cm의 범위에있는 적외선 분광기 (FT-IR) 32 스캔을 사용하여 4 cm의 해상도 -1 푸리에 변환을 이용하여 펠리클 결정 분석 -1. 1437 / A (895) 사용의 결정 지수 CI (IR)를 계산하게하고; 은 &quot;결정 밴드&quot;와 &quot;비정질 밴드&quot;의 흡광도 비는 앞서 설명한 18. </li></올&gt; </li><li> 염소 인산염 레벨 제어, 0.01, 0.1를 이용하여 동일한 실험을 수행하고, 각각 5, 50, 및 500 mM의 축적량을 이용하여 염화나트륨-의 NaH 2 PO 4 수용액 1.0 mm로. </li><li> 펠리클 데이터 분석 : <ol><li> 펠리클 습윤 중량 및 건조 중량 사이의 차이를 결정하여 펠리클 수화를 계산한다. </li><li> 통계적 분석을 위해 각각의 생물학적 복제에 대한 단일 값을 얻기 위해 모든 기술 복제의 값을 평균. Tukey에의 다중 비교 시험으로 일방 ANOVA를 사용하여 치료를 비교한다. 차이는 P의 경우 &lt;0.05 중요하다. </li><li> 처리되지 않은 컨트롤의 비율로 데이터를 정상화 생물 복제의 수단을 플롯. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Guzmán, P., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+triple+response+of+Arabidopsis+to+identify+ethylene-related+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants.</a> Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).</li>
<li>Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+research+on+the+plant+hormone+ethylene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Growth+Regul%22%5BJournal%5D)">History of research on the plant hormone ethylene.</a> J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).</li>
<li>Schaller, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+and+the+regulation+of+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Ethylene and the regulation of plant development.</a> BMC Biol. 10 (1), (2012).</li>
<li>Hua, J., Sakai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EIN4+and+ERS2+are+members+of+the+putative+ethylene+receptor+gene+family+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).</li>
<li>Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insensitivity+to+ethylene+conferred+by+a+dominant+Mutation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana.</a> Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).</li>
<li>Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+tomato+gene+for+the+ethylene-forming+enzyme+by+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).</li>
<li>Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+ethylene+removal+with+Pseudomonas+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hazard.+Mater%22%5BJournal%5D)">Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains.</a> J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).</li>
<li>Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+chemotaxis+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+other+Pseudomonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Environ%22%5BJournal%5D)">Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species.</a> Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).</li>
<li>Augimeri, R. V., Strap, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phytohormone+ethylene+enhances+bacterial+cellulose+production%2C+regulates+CRP%2FFNRKx+transcription+and+causes+differential+gene+expression+within+the+cellulose+synthesis+operon+of+Komagataeibacter+%28Gluconacetobacter%29+xylinus+ATCC+53582%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582.</a> Front. Microbiol. 6, 1459(2015).</li>
<li>Zhang, W., Wen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ethylene+gas+and+comparison+of+ethylene+responses+induced+by+ethylene%2C+ACC%2C+and+ethephon%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon.</a> Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).</li>
<li>Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+preparation+and+its+application+to+physiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal.+Behav%22%5BJournal%5D)">Ethylene preparation and its application to physiological experiments.</a> Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).</li>
<li>Warner, H. L., Leopold, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+evolution+from+2-chloroethylphosphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid.</a> Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).</li>
<li>Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+of+the+thermal+decomposition+of+2-chloroethylphosphonic+acid+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution.</a> Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).</li>
<li>Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+water+vapor+pressure+on+the+thermal+decomposition+of+2-chloroethylphosphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid.</a> Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Schramm, M., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+production+of+cellulose+at+the+air%2Fliquid+interface+of+a+culture+of+Acetobacter+xylinum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum.</a> J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amorphous+cellulose-structure+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Cellul.+Chem.+Technol%22%5BJournal%5D)">Amorphous cellulose-structure and characterization.</a> Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

여기에 설명 된 방법은 모델 생물, K.를 사용하여 세균 에틸렌 반응의 연구 CEPA에서 에틸렌의 생산 현장에서 개요 xylinus. 에틸렌의 pH를 CEPA 순수한 에틸렌 가스 또는 전문 실험실 장비에 대한 필요성을 부정하는 이상으로 3.5 10,11이있는 수성 매체를 보충함으로써 제조 할 수 있으므로이 방법은 매우 유용하다. 이 방법은 세균에서 유래 CEPA 에틸렌의 효과를 연구에 국한되지 않고, 진핵 생물에서의 에틸렌 반응을 연구하기 위해 적응 될 수있다. 이들 화합물은 또한 시츄 CEPA 분해로부터 생성 될 때 병렬 제어 실험 인산 클로라이드로 수행하는 것이 중요하다. 다른 필요한 제어 CEPA 자체 조사중인 미생물 배양에 직접적인 영향을 미치지 여부를 확인하는 것이다. 생리 학적으로 관련이없는 에틸렌 농도 때 K.를 제작했다 xylinus 문화 우리pH가 5 SH 배지에서 성장과 CEPA 효과 ...

올레핀 에틸렌 (C 2 H 4)는 석탄 가스 램프를 사용하여 실험실에서 성장 완두콩 모종, (배축)이 짧았다 유래 된 비정상적인 형태를 나타낸다 관찰되었을 때 제 1901 식물 호르몬으로 발견 두꺼운 정상 완두콩 모종에 비해 옆으로 구부러진; 표현형 나중에 트리플 응답 1,2라고. 후속 연구는 에틸렌은 성장, 스트레스 반응, 과일 숙성 및 노화 3. 애기 장대 식물 생물학 연구를위한 모델 생물로 다수의 발달 과정을 조절하는 중요한 phytohormone가 잘 에틸렌에 대한 응답에 관해서 연구되어왔다 있음을 보여 주었다. 몇몇 에틸렌 반응 돌연변이 어두운 자란 A. 관찰 트리플 반응 표현형을 이용하여 분리 된 에틸렌 1,4,5의 존재 장대 모종. 식물에서 에틸렌 생합성 제조를위한 전구체는 1-A 인minocyclopropane 카복실산 (ACC) (6)과 공통 트리플 응답 표현형 1,4,5 리드 내생 에틸렌 생산을 증가시키는 트리플 응답 분석시 사용된다. 에틸렌 반응은 식물에 널리 연구되고 있지만, 세균에 외인성 에틸렌의 효과는 크게 식물 세균의 확대에도 불구 파악 하였다 연관된다. 한 연구는 특정 슈도모나스 균주는 탄소와 에너지 (7)의 유일한 소스로 에틸렌을 사용하여 살아남을 수 있다고보고했다. 그러나,이 연구는 박테리아가 에틸렌에 반응 것을 증명하고있다. 첫 번째 연구는 보여 주었다 녹농균, P.의 균주 fluorescens, P. 푸티 및 P. syringae 용융 아가 순수한 에틸렌 가스 (8) 평형화 화성 완충액과 혼합 한 아가 플러그 어 세이를 사용하여 에틸렌을 향해 주 화성이었다. 그러나, 우리의 지식, 더 푸르트는 없었다순수한 에틸렌 가스를 사용하여 응급실 보고서 때문에 특별한 장비없이 실험실 가스 운반의 성사 때문일 세균 에틸렌 응답을 특성화한다. 세균 에틸렌 반응의 두번째 보고서 에틸렌 9 xylinus 과일 관련 세균 Komagataeibacter (이전 Gluconacetobacter)에서 박테리아 셀룰로오스 생산 영향 유전자 발현이 증가하는 것이 보였다. 이 경우에, 에틸렌 - 방출 화합물, 2- 클로로 에틸 포스 폰산 (에 CEPA)은 순수한 에틸렌 가스 또는 특수 장비에 대한 필요성을 우회하여 박테리아 성장 배지 내에서 동일계 에틸렌을 제조 하였다. - 14 염기 - 촉매, 일차 반응 pH를 3.5 내지 12 10,11 전술 한 몰 비율은 1 CEPA 에틸렌을 생성한다. CEPA의 열화가 긍정적 에틸의 제조에서 pH와 온도를 13, 14 및 결과와 상호 관련엔, 염화 인산염. CEPA는 기체 에틸렌 편리한 대안 에틸렌 박테리아 응답을 공부에 관심있는 연구자를 제공합니다. 다음 프로토콜의 전반적인 목적은 박테리아의 에틸렌 반응을 연구하는 간단하고 효율적인 방법을 제공하는 박테리아 성장 배지의 CEPA 분해로부터 에틸렌 생산의 생리 학적 관련성 레벨 검증을 포함하는, 배양 pH를 분석 CEPA 분해가 동안 손상되지 않게하려면 세균의 성장 및 박테리아 형태 및 표현형에 에틸렌의 효과 평가. 우리는 K.을 사용하여 이러한 프로토콜을 보여 xylinus 그러나, 이러한 프로토콜들은 적절한 성장 배지를 사용하여 표현형 분석하여 다른 세균에서 에틸렌 반응을 연구하기 위해 적응 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC)</td> <td>Sigma</td><td>A3903</td><td>식물에서 에틸렌의 생합성 전구체</td></tr><tr><td>4 섹터 페트리 접시</td><td>Phoenix Biomedical</td><td>CA73370-022</td><td>트리플 응답 Agar</td></tr><tr><td></td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td>매체를 응고시키기 위해</td></tr><tr><td>Canon Rebel T1i DLSR 카메라</td><td>Canon</td><td>3818B004</td><td>펠리클 사진</td></tr><tr><td>Trichoderma reesei에서 추출한 셀룰라아제 ATCC 26921&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C2730</td><td>수용액</td></tr><tr><td>구연산</td><td>BioShop</td><td>CIT002.500</td><td>SH 매체</td></tr><tr><td>용 상업용 표백제</td><td>Life Brand</td><td>57800861874</td><td>종자 살균 용 표백제</td></tr><tr><td>농축 HCl</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td>pH 조정 용 염산</td></tr><tr><td>디지털 USB 현미경</td><td>플러그 가능</td><td>N / A</td><td>식민지 사진 용</td></tr><tr><td>에테폰(&ge; 96%; 2-chloroethylphosphonic acid)Sigma</td><td></td> <td>C0143</td><td>에틸렌 방출 화합물</td></tr><tr><td>포도당</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>SH 매체용</td></tr><tr><td>Komagataeibacter xylinus ATCC 53582</td><td>ATCC</td><td>53582</td><td>세균 셀룰로오스 생산 알파프로테오박테륨</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>LifeGene</td><td>LMCT1.7B</td><td>1.7ml 마이크로 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>Murashige 및 Skoog(MS) 기초 중간&nbsp;</td><td>시그마</td><td>M5519</td><td>애기장대 탈리아나 성장 매체</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPD579.500</td><td>인산나트륨, SH 매체 NaCl용 이염기성 헵타하이드레이트</td></tr><tr><td></td><td>BioBasic</td><td>SOD001.1</td><td>식염수 및 대조 용액용 염화나트륨</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPM306.500</td><td>인산나트륨, 대조 용액 NaOH용 일염기성 일수화물</td></tr><tr><td></td><td>BioShop</td><td>SHY700.500</td><td>pH 조정용 수산화나트륨</td></tr><tr><td>파라핀 필름</td><td>파라필름</td><td>PM996</td><td>플레이트 및 플라스크 밀봉용</td></tr><tr><td>펩톤(세균학)</td><td>BioShop</td><td>PEP403.1</td><td>SH 매체용</td></tr><tr><td>Petroff-Hausser 계수 챔버</td><td>Hausser 과학</td><td>3900</td><td>박테리아 세포 계수 챔버</td></tr><tr><td>폴리 에테르 설폰 살균 필터 0.2 &마이크로; m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>셀룰라아제 자</td></tr><tr><td>당</td> 살균 용 <td>BioShop</td><td>SUC600.1</td><td>MS 매체 용</td></tr><tr><td>설탕 효모 추출물</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>SH 매체 용</td></tr></tbody></table>

도구로 에틸렌 방출 화합물, 2- 클로로 에틸 산을 활용하여 박테리아의 에틸렌 응답을 공부하기

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

에틸렌(C2H4)은 식물 발달의 여러 측면에 관여하는 기체 식물 호르몬으로 노화와 과일 숙성에 지배적인 역할을 합니다. 초기 식물 발달 중에 적용된 외인성 에틸렌은 삼중 반응 표현형을 유발합니다. 과장된 정점 갈고리가 있는 더 짧고 두꺼운 hypocotyl. 식물과 박테리아 사이의 밀접한 관계에도 불구하고 외인성 에틸렌이 박테리아에 미치는 영향은 크게 간과되어 왔습니다. 이는 부분적으로 특수 장비 없이 실험실 내에서 기체 에틸렌을 제어하기 어렵기 때문입니다. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA)는 pH 3.5 이상의 수성 매체에 용해되면 1 : 1 : 1 몰 비율로 에틸렌, 염소 및 인산염으로 분해되는 화합물입니다. 여기에서는 과일 관련 셀룰로오스 생성 박테리아인 Komagataeibacter xylinus를 모델 유기체로 사용하여 박테리아의 에틸렌 반응을 조사하기 위해 CEPA를 사용하여 현장 에틸렌을 생산하는 방법에 대해 설명합니다. 본 명세서에 기술된 프로토콜은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 삼중 반응 분석을 통한 CEPA로부터의 에틸렌 생산의 검증과 K. 자일리누스 셀룰로오스 생산, 펠리클 특성 및 콜로니얼 형태학에 대한 외인성 에틸렌의 효과를 모두 포함한다. 이러한 프로토콜은 적절한 성장 배지 및 표현형 분석을 사용하여 다른 미생물에 대한 에틸렌의 효과를 조사하도록 조정할 수 있습니다. CEPA의 사용은 연구자에게 박테리아 에틸렌 반응의 일상적인 측정을 위해 순수 에틸렌 가스에 대한 간단하고 효율적인 대안을 제공합니다.

트리플 응답 분석하여 SH 배지에서 CEPA에서 에틸렌 해방 (PH 7)의 검증을위한 개략도 판 설치는 그림 1A에 표시됩니다 - C를. 펠리클 프로토콜을 도시하는 흐름도는도 2 다크 성장한 A. 같다 장대 모종 ACC의 존재 및 SH 매체 CEPA의 분해를 통해 제조 된 에틸렌 (pH가 7)의 존재하에 삼중 반응 표현형 (과장 정점 후크 짧고 두꺼운 배축)를 나타낼 수 있지만 비 처리 조건 (그림 3A) 9. ACC- 및 CEPA 파생 에틸렌 처리 (A)의 배축 길이 장대 씨앗 유의하게 (P &lt;0.0001) 생리 관련 집중하고에 SH 매체 (PH 7)에 CEPA에서 발표 된 치료 컨트롤 (그림 3...

본에 설명된 프로토콜은 2-클로로에틸포스폰산(CEPA)을 활용하여 박테리아 에틸렌 반응의 편리한 조사를 용이하게 합니다. 에틸렌은 수성 박테리아 성장 매체에서 CEPA의 분해를 통해 현장에서 생산되며, 순수한 에틸렌 가스에 대한 요구 사항을 우회합니다.

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

본 절차의 전체적인 목표는 에틸렌에 대한 박테리아의 반응을 연구하기 위한 간단하고 안전한 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 식물-미생물 상호작용에서 에틸렌이 박테리아의 식물 부착 및 군락 형성에 미치는 역할과 같은 핵심 질문에 대한 해답을 제시할 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 특수 장비가 필요하지 않으며, 실험실에서 기체 상태의 에틸렌을 다루는 것보다 훨씬 안전하다는 점입니다.이 방법은 에틸렌이 박테리아 셀룰로오스 생성에 어떤 영향을 미치는지에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 에틸렌 매개 과정이 식물 군락 형성에 어떻게 관여하는지를 in vitro로 연구하기 위해 다른 식물 관련 미생물에도 적용될 수 있습니다. 준비 과정으로, Arabidopsis 유묘용 배지 100 milliliters와 CEPA 분해용 박테리아 성장 배지 100 milliliters를 제조합니다. Arabidopsis 배지의 온도가 상온과 비슷해지면, 이 중 40 milliliters를 멸균 플라스크에 나누어 담고 해당 분취액에 10 millimolar ACC 40 microliters를 첨가합니다.이제 플레이트의 각 구역에 배지 5 mL를 분주하고 한천이 응고될 때까지 기다립니다. 모든 플레이트의 서로 마주 보는 구역에는 각각 박테리아 성장 배지와 arabidopsis 배지를 배치합니다. 세 가지 서로 다른 배지 구성을 사용하십시오.CEPA 처리는 프로토콜의 후반부에서 진행됩니다. 각 플레이트 구성은 3반복으로 준비하십시오. 한천이 식으면, 애기장대 배지의 각 구역에 약 50개의 씨앗을 고르게 분배하십시오.그 다음, 플레이트를 4 °C의 암소에서 3~4일 동안 배양합니다. 이후, 종자를 배양한 뒤 형광등에 2시간 동안 노출시킵니다. 그런 다음, 한 가지 플레이트 구성의 세균 배지에 500 mM CEPA 스톡 용액 10 µL를 도포합니다.한천 내 최종 CEPA 농도는 1 mM이 됩니다. 이제 모든 플레이트를 실험실용 필름으로 밀봉하고 알루미늄 호일로 감쌉니다. 그 다음, 플레이트를 한천 면이 아래로 향하게 하여 23 °C의 암실에 두고 3일 동안 배양하여 종자를 발아시킵니다.종자가 발아한 후, 화염 멸균한 핀셋을 사용하여 각 처리구에 해당하는 유묘를 분리합니다. 각 사분면에서 30개의 유묘를 선택하여 처리구당 총 180개를 수집합니다. 해부 현미경 또는 고해상도 디지털 카메라를 사용하여, 크기 가늠을 위한 자를 옆에 두고 검은색 배경에서 유묘를 촬영합니다.그 다음, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 하배축 길이를 측정합니다. 직선 도구(straight tool)를 사용하여 10 millimeters를 측정한 후, Analyze 탭에서 Set Scale을 선택하여 스케일을 설정합니다. 그런 다음, Straight Line 도구에 있는 Segmented 도구를 사용하여 각 하배축을 측정하고 M 키를 눌러 길이를 계산합니다.펠리클 분석법은 박테리아 셀룰로오스 생산을 위한 표준 분석 도구입니다. pH 및 형태학적 분석은 별도의 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. 준비 과정으로, 스타터 배양액에서 세포를 3회 반복 수확하고 Petroff-Hauser Counting Chamber를 사용하여 세포 수를 정량하십시오.그런 다음, 서로 다른 CEPA 농도를 가진 4가지 배지 마스터 믹스를 준비합니다. 각 마스터 믹스에 대해 pH 7 SH 배지 60 milliliters를 분주하고, 0, 5, 50 또는 500 millimolar CEPA 스톡 용액 120 microliters를 첨가하여 최종 CEPA 농도가 0, 0.1, 0.1 또는 1.0 millimolar가 되도록 합니다. 플라스크를 회전시켜 이 배지들을 혼합합니다.3회 반복 실험의 각 세트와 멸균 대조군으로 사용될 네 번째 세트를 위해 각각의 배지가 필요합니다. 따라서 준비된 60 milliliter 배지를 14 milliliter씩 4개의 분주액으로 나눕니다. 그다음, 각 분주액을 사전 냉각한 후, 최종 농도가 100, 000 cells per milliliter가 되도록 각각의 스타터 배양액을 접종합니다.셀룰로오스 생성을 방지하기 위해 접종된 모든 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 나머지 14 µL 분주액은 멸균 대조군 웰에 사용하십시오. 이제 각 14 µL 마스터 믹스에서 2 µL 분주액을 멸균 24웰 플레이트의 6개 웰에 분주하며, 분석되는 스타터 배양액 하나당 총 4개의 플레이트를 채웁니다.플레이트를 파라필름으로 조심스럽게 밀봉하고 30 °C에서 7일 동안 정적으로 배양합니다. 배양하는 동안, 배지의 산도를 주기적으로 측정하기 위해 25 mL 액체 배양액을 병행하여 배양합니다. 만약 산도가 pH 5 미만으로 떨어지면, 유기체의 성장이 CEPA의 에틸렌 분해를 억제하므로 이 분석법에 적합하지 않습니다.일주일 후, 펠리클(pellicle)을 수확하여 습중량, 두께, 건중량 및 결정성을 측정합니다. 플레이트에서 펠리클을 수집하려면, 펠리클의 한쪽 면을 눌러 반대쪽 가장자리를 들어 올린 다음 핀셋으로 집어 올립니다. 핀셋으로 잡은 상태 그대로 깨끗한 종이 타월 위에 3초 동안 올려두어 과량의 배지를 제거합니다.그 후, 각 펠리클의 무게를 측정하여 이를 습중량으로 기록합니다. 다음으로, 자를 따라 펠리클을 정렬하고 고해상도 디지털 카메라를 사용하여 측면에서 촬영합니다. 이 사진들을 분석하여 펠리클의 두께를 측정합니다.다음으로, 펠리클을 6-웰 플레이트의 각 웰로 개별적으로 옮깁니다. 세포를 용해시키기 위해 80 °C에서 20분 동안 0.1 N 수산화나트륨 12 mL로 처리합니다. 그 후 수산화나트륨을 제거하고, 6-웰 플레이트에서 12 mL의 초순수로 24시간 동안 교반하며 충분히 세척하여 처리된 펠리클을 중화시킵니다.배양하는 동안 6시간마다 물을 갈아줍니다. 배양이 끝나면 펠리클(pellicle)은 흰색을 띠어야 합니다. 그 후, 건조 중량을 측정하기 위해 펠리클을 실리콘 매트 위에 올리고 50 °C에서 48시간 동안 건조합니다.펠리클의 결정성은 푸리에 변환 적외선 분광법을 사용하여 분석할 수 있습니다. 암조건에서 성장시킨 arabidopsis thaliana 묘는 SH 배지 상에서 ACC가 존재할 때와 CEPA의 분해를 통해 생성된 에틸렌이 존재할 때, 짧고 굵은 하배축과 과도하게 발달한 정단 굴곡을 특징으로 하는 삼중 반응 표현형을 나타냈으나, 처리하지 않은 조건에서는 나타나지 않았습니다. 분명하게, 처리된 종자의 하배축 길이는 처리하지 않은 대조군보다 유의미하게 짧았습니다.따라서, SH 배지 상의 CEPA로부터 생리학적으로 유의미한 농도의 에틸렌이 방출되었습니다. CEPA 유래 에틸렌의 모든 농도에서 펠리클(pellicle)의 습중량이 유의미하게 감소했으나 펠리클 두께에는 영향을 미치지 않았으며, 모든 농도의 CEPA 유래 에틸렌에서 펠리클의 건중량이 유의미하게 증가했습니다. 또한, 모든 농도의 CEPA 유래 에틸렌에 의해 펠리클의 수분 함량이 감소했습니다.이 절차를 수행하는 동안, CEPA가 에틸렌으로 분해되는 것이 억제되지 않도록 배지의 pH가 5 미만으로 떨어지지 않는지 확인하기 위해 pH를 측정하는 것이 중요합니다. 분말 형태의 CEPA는 점막에 매우 위험하므로 주의하십시오. 이 프로토콜을 수행할 때는 항상 적절한 주의를 기울여야 합니다.이 기술을 통해 식물-박테리아 상호작용에 관심이 있는 연구자들은 체외(in vitro)에서 에틸렌 매개 반응을 안전하게 탐구할 수 있게 될 것입니다. 이는 식물 신호가 박테리아의 군집 형성 및 부착을 어떻게 매개하는지를 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 현재 이 분야에 대한 연구는 미흡한 실정입니다.

utilizing-ethylene-releasing-compound-2-chloroethylphosphonic-acid-as

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 사는 박테리아에 stomatal 응답을 액세스하는 간단하고 재현성 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 표피 껍질의 사용에 비해 잎사귀의 입힐 수있는 총알과 조작​​은 이전에 보고된 최소화합니다.

전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가

출처: Nathoo, N., et al. 식물/미생물 분자 상호 작용 및 신호 전달의 동시 및 체계적 분석을 위한 수경 공동 재배 시스템. J. Vis. 경험. (2017).이 비디오는 멸균 조건에서 식물-박테리아 상호 작용을 연구하기 위한 수경 공동 재배 시스템을 보여줍니다. 식물 묘목은 멸균된 산성 성장 배지로 옮겨져 배양되고 Agrobacterium을 접종하기 전에 오염 여부를 검사합니다. 활성화된 박테리아는 식물 뿌리에 부착되어 T-DNA를 식물 세포로 전달하며 박테리아 집락화를 강화하는 분자 변화를 촉진합니다.

식물 숙주와 상호 작용하는 박테리아의 분자 반응을 연구하기 위한 공동 배양 시스템

출처: Augimeri, RV et. al., 박테리아의 에틸렌 반응을 연구하기 위한 도구로 에틸렌 방출 화합물인 2-클로로에틸포스폰산을 활용합니다. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 2-클로로에틸포스폰산(CEPA)에 의해 생성된 에틸렌이 박테리아 성장 및 셀룰로오스 생산에 미치는 영향을 보여줍니다. 에틸렌은 셀룰로오스 합성을 자극하는 신호 전달 경로를 활성화하여 펠리클 형성을 향상시킵니다. 이러한 결과는 에틸렌에 대한 박테리아 반응을 강조합니다.

에틸렌 방출 화합물을 이용한 에틸렌에 대한 박테리아 반응 조사

병원체 성장의 정량화는 다양한 애기장대(Arabidopsis) 탈리아나(Arabidopsis) 면역 반응을 특성화하는 강력한 도구입니다. 여기에 설명된 방법은 Pseudomonas syringae pv를 정량화하기 위해 최적화된 주사기 침투 분석을 제공합니다. 마쿨리콜라 성체 애기장대에서 ES4326 성장.

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

우리는 다른 박테리아에 대한 억제성 화합물의 생산을 위해 박테리아 배양을 스크리닝하는 간단한 방법을 설명합니다.

소프트 한천 오버레이 기법의 사용은 세균 생산 억제 화합물에 대한 화면으로

형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

이 원고의 목표는 RING 형 E3 유비퀴틴 리가제의 포괄적 인 생화학 및 기능 적 연구에 대한 개요를 제시하는 것입니다. 상세한 프로토콜을 갖춘 이 다단계 파이프라인은 테스트된 단백질의 효소 활성을 검증하고 활성을 작동하도록 연결하는 방법을 보여줍니다.

시험관 내 링 타입 E3 유비퀴틴 리가제의 기능적 특성화

여기에서는 AT4G18020(APRR2)-AirID 단백질을 모델로 사용하여 오이(Cucumis sativus L.)에서 근접 라벨링(PL) 실험을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 벡터의 구성, 아그로인 침투를 통한 구성물의 변형, 비오틴 침투, 단백질 추출 및 친화성 정제 기술을 통한 비오틴 표지 단백질의 정제를 설명합니다.

식물의 단백질-단백질 상호작용을 위한 AirID 기반 근접 라벨링

본 프로토콜은 식물 아포플라스트 내에서 성장한 슈도모나스 시린지와 집단에 대한 단일 세포 유전자 발현 분석을 허용하는 방법을 설명합니다.

식물 조직 내 Pseudomonas syringae 유전자 발현의 단일 세포 분석

이 프로토콜은 동일 시료 내에서 식물 이온 누출, 과산화효소 활성, 칼로스 생성을 평가하는 고처리량 접근법을 설명합니다.

고처리량 형식을 이용한 미생물 2차 대사산물에 대한 잎 반응 평가

배우세요 CEPA를 이용한 박테리아 에틸렌 응답 연구 방법으로 식물-미생물 상호작용을 탐구하세요. 이 기술은 가스 형태의 에틸렌을 다루지 않고도 안전하게 세포외 다당류 생산과 박테리아 부착을 분석할 수 있습니다.

도구로 에틸렌 방출 화합물, 2- 클로로 에틸 산을 활용하여 박테리아의 에틸렌 응답을 공부하기

더 많은 동영상 탐색