비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동을 사용하여 인간의 MXA의 멀티 서브 유닛 단백질 복합체의 특성

본 실험의 전반적인 목표는 비변성 소듐 도데실 황산염-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(non-denaturing sodium dodecosulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)을 사용하여 세포 용해물 내의 호모올리고머 단백질 복합체의 서브유닛 수를 결정하는 것입니다. 이 방법은 기초적인 세포 과정에 관여하는 단백질의 올리고머 상태와 같이 세포 생물학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 호모올리고머 단백질 복합체의 정제가 필요하지 않으며, 특수하고 고가의 장비가 필요 없다는 점입니다.

따라서 대부분의 실험실에서 수행 가능합니다. 본 실험에서는 두 종류의 세포를 사용합니다. 내인성 Myxovirus resistance A 단백질(MxA)을 발현하는 A549 세포와 MxA를 과발현하는 virocell입니다.

A549 세포와 virocell을 웰당 2 mL의 성장 배지를 사용하여 6-웰 플레이트에 분주합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 세포를 회수합니다.

각 웰을 1 mL의 PBS로 세척하고, 실온에서 약 5분 동안 0.25% Trypsin-EDTA 용액 0.5 mL를 첨가하여 세포를 떼어냅니다. 세포가 디쉬에서 분리되는 즉시 성장 배지 0.5 mL를 추가하고, 피펫팅을 통해 조심스럽게 혼합합니다. 각 웰의 세포를 2 mL 튜브로 옮긴 후, 벤치탑 원심분리기를 사용하여 세포 침전물을 형성시킵니다.

세포 펠렛이 손상되지 않도록 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 1 mL의 차가운 PBS를 첨가하고 세포 현탁액을 조심스럽게 피펫팅하여 세포를 세척합니다. 벤치탑 원심분리기로 세포를 펠렛화합니다.

세포 펠릿이 떨어지지 않도록 주의하며 피펫팅으로 상층액을 제거합니다. 얼음처럼 차가운 lysis buffer 200 µL를 첨가하고, 피펫팅으로 세포를 재현탁한 후 얼음에 둡니다. lysis buffer에 포함된 iodoacetamide은 빛에 민감하므로, 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 용해물을 즉시 차광 처리합니다.

얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. iodoacetamide는 thioether 결합을 형성하여 유리 cysteine의 thiol기를 가역적으로 보호하고 인위적인 단백질 응집을 방지하므로 사용이 필수적입니다. 그다음, 미리 냉각된 벤치탑 원심분리기를 이용하여 원심분리함으로써 세포 잔해를 제거합니다.

원심분리하는 동안 분자량 컷오프가 10,000인 투석 컬럼을 준비합니다. 투석 컬럼을 플로트 부표에 부착하고, 컬럼을 평형화하기 위해 미리 냉각된 투석 버퍼가 담긴 비커에 넣습니다. 이때 막(membrane)을 만지지 마십시오.

비커에 마그네틱 스터러를 넣고 비커를 냉장실로 옮깁니다. 마그네틱 스터러를 사용하여 부드럽게 교반하면서 4 °C에서 20분 동안 평형을 맞춥니다. 20분 후, 투석 완충액과 플로트 부표에서 컬럼을 꺼냅니다.

멤브레인에 닿지 않도록 피펫팅하여 투명해진 용해물을 준비된 투석 컬럼으로 옮깁니다. 컬럼을 부표(float buoy)에 부착합니다. 투석 버퍼가 채워진 비커에 다시 넣은 후, 비커를 저온실로 옮깁니다.

비변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 방해할 수 있는 작은 대사물과 염을 제거하기 위해, 마그네틱 교반기로 조심스럽게 저어주며 4°C에서 최소 4시간 동안 용해물을 투석합니다. 투석이 완료되면, 투석된 각 시료를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 원심분리함으로써 침전물을 제거합니다.

올리고머 단백질 복합체의 해리를 방지하기 위해 용해물의 투석 직후에 전기영동을 수행해야 합니다. 내부 및 외부 젤 챔버를 미리 냉각시킨 running buffer로 채웁니다. 비변성 폴리아크릴아마이드 젤을 미리 냉각시킨 running buffer를 사용하여 4°C에서 젤당 25 mA로 15분 동안 사전 작동시킵니다.

준비된 용해물 15 µL와 4X 샘플 버퍼 5 µL를 혼합합니다. 선택한 native 단백질 표준물질과 15 µL의 샘플을 겔에 로딩합니다. 4 °C에서 25 mA로 4시간 동안 겔을 전기영동합니다.

비변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동이 완료되면, 겔을 분리하여 SDS 버퍼로 조심스럽게 옮깁니다. 상온에서 가볍게 흔들어주며 10분 동안 배양합니다. 겔당 스펀지 2개, 셀룰로오스 필터 페이퍼 4장, 그리고 블로팅 멤브레인 1개를 준비하여 블로팅 버퍼에 담가둡니다.

다음과 같이 아래에서 위로 샌드위치를 조립합니다. 스펀지 한 개, 셀룰로오스 여과지 두 장, 블로팅 멤브레인, 겔, 셀룰로오스 여과지 두 장, 그리고 스펀지 한 개 순으로 배치합니다. 멤브레인이 양(+)극을 향하고 겔이 음(-)극을 향하도록 하여 샌드위치를 블로팅 탱크에 넣습니다.

블로팅 탱크를 미리 냉각시킨 블로팅 버퍼로 채웁니다. 최적의 단백질 전이 결과를 얻으려면 4°C에서 90 mA로 하룻밤 동안 블로팅하십시오. 다음 날, 샌드위치를 분해합니다.

단백질 표준물을 시각화하기 위해 멤브레인을 Ponceau S 용액에 넣고 실온에서 5분 동안 반응시킵니다. 멤브레인을 탈이온수에 넣고 세척하여 염색약을 제거합니다. 멤브레인을 트레이로 옮긴 후, 펜을 사용하여 단백질 표준물의 밴드를 표시합니다.

블로킹 버퍼를 사용하여 멤브레인을 실온에서 최소 1시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 블로킹합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 MxA에 대한 rabbit polyclonal antibody를 사용한 면역 염색을 통해 표적 단백질을 시각화합니다. 내인성 MxA가 결핍된 Virocells에 재조합 야생형 MxA와 단량체 및 이량체 MxA 변이체를 트랜스펙션하였습니다.

재조합 MxA 변이체가 예상 분자량에서 이동한 것을 통해 이들의 올리고머 상태를 확인하였습니다. 외인성으로 발현된 야생형 MxA는 4량체(tetramer)로 이동하였습니다. 이후 이 재조합 단백질들을 사용하여 인터페론-알파(interferon-alpha)로 자극된 A549 세포에서 유래한 내인성 인간 MxA 단백질의 올리고머 상태를 평가하였습니다.

그 결과 인터페론-알파(interferon-alpha)로 자극된 A549 세포 용해물 내 MxA의 크기가 4량체(tetramer)에 해당함을 확인하였습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 1.5일 만에 완료할 수 있습니다. 이 실험 절차를 수행하는 동안, 단백질 상호작용이 파괴되거나 단백질 응집이 발생할 수 있으므로 전체 과정 중에 샘플을 얼렸다가 녹이지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.

또한, iodoacetamide와 같이 빛에 민감한 시약을 사용할 때는 용해 단계 동안 샘플을 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다. 비변성 SDS-PAGE 이후에는 단백질 겔 추출, 효소 활성 분석(AsiS) 또는 2차원 PAGE와 같은 다른 방법을 수행하여 효소 활성 및 잠재적 헤테로-올리고머 복합체의 특성 분석과 같은 추가적인 의문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 개발 이후 세포 생물학 분야의 연구자들이 배양 세포 내 올리고머 단백질 복합체의 조성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후, 비변성 PAGE 분석에서 올리고머 단백질을 연구하기 위해 세포 배양물로부터 세포 용해물을 준비하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. iodoacetamide 취급은 매우 위험할 수 있으므로, 항상 장갑과 보안경을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.