과민성 대장 증후군에서의 miRNAs 순환의 교란은 멀티 플렉스 높은 처리량 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 감지

본 다중 핵산 정량 프로토콜의 전반적인 목표는 전혈 내의 microRNA 발현을 디지털 방식으로 정량화하는 것입니다. 이 방법은 소화기 질환 연구의 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움을 줄 수 있으며, microRNA와 같은 조절 장애 분자 기전 및 바이오마커 시그니처를 식별하는 데 유용합니다.

이 기술의 주요 장점은 microRNA 정량이 증폭 과정에 의존하지 않는다는 점입니다. 이 기술은 분자 표적을 디지털 방식으로 계수하며 대부분 자동화되어 있습니다. 총 RNA를 정제하려면, 이전에 수집하여 냉동 보관한 전혈 샘플을 해동하고 2시간 동안 배양하십시오.

스윙 버킷 로터를 사용하여 상온에서 5,000 ×g로 10분 동안 튜브를 원심분리합니다. 그 다음, 펠릿이 손상되지 않도록 주의하며 상층액을 폐기 튜브에 조심스럽게 붓거나 피펫으로 옮겨 제거합니다. 펠릿에 RNase-free water 4 mL를 추가합니다.

캡을 단단히 닫고, 펠릿이 눈에 보이게 용해될 때까지 볼텍싱합니다. 그다음 튜브를 다시 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 이어서 펠릿에 BM1 버퍼 350 µL를 첨가하고 펠릿이 눈에 보이게 용해될 때까지 볼텍싱합니다.

그런 다음, 자동화된 총 RNA 추출을 위해 샘플을 2 mL 처리 튜브로 옮깁니다. 시판되는 RNA 추출 키트를 사용하여, RNA 정제 키트에 제공된 사전 로딩된 피펫 팁, 원심 분리 튜브, 버퍼 및 시약을 로봇 RNA 추출 시스템에 장착함으로써 전혈 샘플로부터 microRNA를 포함한 세포 내 RNA의 자동 정제를 수행합니다. 프로토콜 선택 메뉴에서 Blood miRNA PartA 프로토콜을 선택하고 실행을 시작합니다.

RNA 추출을 완료하고, 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 보관하십시오. 먼저 RNase-free water를 사용하여 12개의 RNA 샘플을 33 nanograms per microliter로 정규화하여 microRNA 샘플을 준비합니다. nuclease-free water를 사용하여 어세이 키트에 제공된 microRNA 컨트롤을 1:500으로 희석하여 준비하고, 얼음 위에 보관하십시오.

다음으로, annealing buffer 13 µL, micro R-tag 시약 26 µL, 그리고 microRNA 대조군 6.5 µL를 혼합하여 annealing 마스터 믹스를 준비합니다. 12개의 0.2 mL 스트립 튜브 각각에 annealing 마스터 믹스 3.5 µL를 넣은 다음, RNA 샘플 3 µL를 추가합니다. 튜브를 가볍게 쳐서 혼합하고, 벤치탑 미니 원심분리기를 사용하여 2000 ×g에서 원심 분리한 뒤, 다음 프로그램을 사용하여 써모사이클러에서 반응을 진행합니다.

다음으로, ligation buffer 3 µL와 PEG 19.5 µL를 혼합하여 ligation master mix를 준비합니다. 그런 다음, 각 반응액에 ligation master mix 2.5 µL를 첨가합니다. 튜브를 혼합하고 원심 분리하여 액체를 모은 후, 48 °C의 thermocycler에서 5분 동안 반응시킵니다.

그 다음, 튜브들을 써모사이클러 블록에 둔 상태에서 각 샘플에 리가아제 1 µL를 직접 첨가하고, 다음 프로그램에 따라 튜브를 인큐베이트합니다. 튜브를 가볍게 섞어 원심분리한 후, 각 샘플에 라이게이션 정제 효소 1 µL를 첨가합니다. 그런 다음, 여기 보이는 것과 같이 써모사이클러에서 튜브를 인큐베이트합니다.

배양 후, 샘플에 RNase-free water 40 µL를 첨가한 다음 혼합하고 원심분리하여 가라앉힙니다. microRNA 하이브리다이제이션을 수행하려면, 제공된 리포터 및 캡처 프로브 세트를 얼음 위에서 해동하고 원심분리합니다. Reporter Code Set 2에 하이브리다이제이션 버퍼 130 µL를 첨가하고 혼합하여 하이브리다이제이션 마스터 믹스를 제조합니다.

새 0.2 milliliter 스트립 튜브 12개에 하이브리다이제이션 마스터 믹스 20 microliters를 넣습니다. 방금 준비한 microRNA 샘플을 85 degrees Celsius에서 5분 동안 변성시킨 후, 얼음 위에서 냉각합니다. 그런 다음, 하이브리다이제이션 마스터 믹스가 들어 있는 각 스트립 튜브에 microRNA 샘플 5 microliters를 첨가합니다.

써모사이클러를 65 °C로 설정하고, 30 µL 부피 기준으로 온도를 계산하며, 가열 덮개는 Forever 설정으로 지정하여 작동 종료 후 4 °C로 온도가 내려가지 않도록 합니다. 각 튜브에 캡처 프로브 세트 5 µL를 첨가하고 혼합합니다. 그 다음, 원심 분리하여 액체를 가라앉힌 후 즉시 튜브를 65 °C로 설정된 써모사이클러에 넣습니다.

샘플을 최소 12시간에서 최대 30시간 동안 배양합니다. 먼저 카트리지와 플레이트를 상온으로 워밍업하여 준비 스테이션을 설정하십시오. 그 다음 플레이트를 스핀 다운합니다.

프렙 스테이션(prep station)을 준비하려면 스테이션 도어를 열고 시약 플레이트, 카트리지, 피펫 팁, 0.2 milliliter 스트립 튜브에 준비된 샘플, 그리고 빈 0.2 milliliter 12-튜브 스트립 튜브 2개를 로봇의 적절한 위치에 로드합니다. 스트립 튜브 캡과 시약 플레이트 커버를 제거합니다. 그런 다음 프렙 스테이션 도어를 닫고 제어 패널에서 해당 분석(assay)을 실행합니다.

고정 및 정렬된 3분법 복합체의 바코드를 시각화하고 계수하려면, 준비 스테이션에서 카트리지를 분리하고 제공된 커버를 사용하여 밀봉한 후 디지털 분석기의 사용 가능한 슬롯에 배치하십시오. 터치스크린을 사용하여 카트리지 정의 파일(CDF)을 생성하십시오. CDF의 각 샘플에 적절한 리포터 라이브러리 파일이 할당되었는지 확인하십시오.

스캔이 완료되면 USB 드라이브나 이메일을 통해 디지털 분석기에서 데이터 파일을 다운로드한 후, 관련 QC 및 분석 프로토콜에 따라 데이터를 처리하고 분석하십시오. 유전자 발현 플랫폼 분석 시스템은 고도로 자동화된 특성을 통해 기술적 노이즈를 줄이며, 독자적인 화학 기술을 사용하여 정밀도가 높은 유전자 발현 데이터를 생성합니다. 여기에 제시된 기술적 반복 실험은 내인성 및 바이러스 microRNA 발현 정량화 모두에서 가능한 높은 재현성을 보여줍니다.

이 방법을 사용하면 건강한 연구 참여자에 의해 정의된 예상 발현 양상에서 벗어난 바이러스 인코딩 및 내인성 인간 microRNA를 IBS의 관심 표적으로 식별할 수 있습니다. 이 방법의 정밀도와 민감도는 저발현 표적 간의 섭동을 감지할 수 있게 하며, 미세한 섭동 또한 신뢰성 있게 관찰할 수 있습니다. 이 수치들은 건강한 대조군과 비교하여 IBS 및 IBS 하위 유형의 순환 microRNA에서 나타나는 일부 섭동을 보여줍니다.

IBS 참여자에게서 가장 유의미하게 차등적으로 증가한 두 가지 microRNA를 여기에 제시합니다. 이 바이올린 도표의 곡선은 miR-150의 카운트 빈도를 나타냅니다. 수직 막대는 제1사분위수와 제3사분위수를 나타내며, 빨간색 사각형은 중앙값 카운트를 나타냅니다.

이 절차에 따라, 동일한 기술을 기반으로 더 표적화된 맞춤형 분석을 수행함으로써 더 큰 코호트에서 바이오마커 시그니처를 검증하고 필수적인 RNA 및 단백질 연관성을 탐구할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 의생명 연구 분야의 연구자들이 질병 진단을 위한 바이오마커 패널을 신속하고 정밀하며 정확하게 개발할 수 있는 길을 열어주었습니다.