과민성 대장 증후군에서의 miRNAs 순환의 교란은 멀티 플렉스 높은 처리량 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 감지
November 30th, 2016
우리는 증폭 없이 생물학적 기질에서 분자를 바코딩하고 계수하여 유전자 발현을 정량화하는 multiplexed high-throughput 유전자 발현 플랫폼의 사용을 설명합니다. 우리는 이 플랫폼을 사용하여 과민성 대장 증후군이 있거나 없는 피험자의 전혈에서 microRNA(miRNA) 발현을 정량화했습니다.
이 멀티플렉스 핵산 정량화 프로토콜의 전반적인 목표는 전혈에서 microRNA 발현을 디지털 방식으로 정량화하는 것입니다. 이 방법은 소화 장애 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 조절되지 않는 분자 메커니즘과 microRNA와 같은 바이오마커 서명을 식별하는 데 도움이 됩니다.
이 기술의 주요 장점은 microRNA 정량화가 증폭에 의존하지 않는다는 것입니다. 이 기술은 분자 표적을 디지털 방식으로 계수하며 대부분 자동화되어 있습니다. 전체 RNA를 정제하려면 이전에 수집 및 냉동된 전혈 샘플을 2시간 동안 해동하고 배양합니다.
5, 10 분 동안 실내 온도에 000 시간 g에 관을 원심 분리하기 위하여 그네 물통 회전자를 이용하십시오. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 폐기물 튜브에 조심스럽게 붓거나 피펫으로 상층액을 제거합니다. 펠릿에 RNase가 없는 물 4ml를 추가합니다.
캡을 단단히 교체하고 펠릿이 눈에 띄게 용해될 때까지 와류를 일으킵니다. 그런 다음 튜브를 다시 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 다음으로, 펠릿에 350마이크로리터의 BM1 버퍼를 추가하고 펠릿이 눈에 띄게 용해될 때까지 와류를 일으킵니다.
그런 다음 자동 총 RNA 추출을 위해 샘플을 2ml 처리 튜브로 옮깁니다. 시판되는 RNA 추출 키트를 사용하여 RNA 정제 키트에 제공된 사전 로드된 피펫 팁, 원심분리 튜브, 완충액 및 시약을 로봇 RNA 추출 시스템에 로드하여 전혈 샘플의 microRNA를 포함한 세포 내 RNA의 자동 정제를 수행합니다. 프로토콜 선택 메뉴에서 Blood miRNA PartA 프로토콜을 선택하고 실행을 시작합니다.
RNA 추출을 완료하고 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 보관합니다. 먼저 RNase-free 물을 사용하여 12개의 RNA 샘플을 마이크로리터당 33나노그램으로 정규화하여 microRNA 샘플을 준비합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 분석 키트에 제공된 microRNA 대조군의 1/500 희석액을 준비하고 얼음에 보관합니다.
다음으로, 13 마이크로리터의 어닐링 버퍼, 26 마이크로리터의 마이크로 R-태그 시약 및 6.5 마이크로리터의 마이크로RNA 대조군을 결합하여 어닐링 마스터 믹스를 준비합니다. 12개의 0.2 밀리리터 스트립 튜브 각각에 3.5 마이크로리터의 어닐링 마스터 믹스를 첨가한 다음 3 마이크로리터의 RNA 샘플을 추가합니다. 튜브를 튕겨 혼합하고 벤치탑 미니 마이크로 원심분리기로 2000회 g으로 회전시킨 다음 다음 프로그램을 사용하여 열순환기에서 튜브를 실행합니다.
다음으로, 3마이크로리터의 라이게이션 버퍼와 19.5마이크로리터의 PEG를 결합하여 라이게이션 마스터 믹스를 준비합니다. 그런 다음 각 반응에 2.5마이크로리터의 결찰 마스터 믹스를 추가합니다. 튜브를 혼합하고 회전시킨 후 섭씨 48도의 온도에서 5분 동안 열순환기에 다시 넣습니다.
그런 다음 thermocycler 블록에 있는 동안 각 샘플에 1마이크로리터의 리가아제를 직접 추가하고 다음 프로그램을 사용하여 튜브를 배양합니다. 튜브를 부드럽게 섞어 돌리고 각 샘플에 1마이크로리터의 결찰 세척 효소를 추가합니다. 그런 다음 여기에 표시된 대로 thermocycler에서 튜브를 배양합니다.
배양 후, 샘플에 40마이크로리터의 RNase-free 물을 첨가한 후 혼합하고 스핀다운합니다. microRNA 혼성화를 수행하려면 리포터를 해동하고 얼음 위에 제공된 프로브 세트를 캡처한 다음 스핀다운합니다. 130마이크로리터의 혼성화 버퍼를 Reporter Code Set 2에 추가하고 혼합하여 혼성화 마스터 믹스를 만듭니다.
12개의 새로운 0.2 밀리리터 스트립 튜브에 20 마이크로리터의 하이브리드화 마스터 믹스를 추가합니다. 방금 준비한 microRNA 샘플을 섭씨 85도에서 5분 동안 변성시키고 얼음에서 식힙니다. 그런 다음 5마이크로리터의 microRNA 샘플을 혼성화 마스터 믹스를 포함하는 각 스트립 튜브에 추가합니다.
써모사이클러를 30마이크로리터 부피 계산 온도에서 섭씨 65도로 프로그래밍하고 가열된 뚜껑을 영원히 시간 설정으로 프로그래밍하여 실행이 끝날 때 섭씨 4도까지 내려가지 않도록 합니다. 각 튜브에 5마이크로리터의 캡처 프로브 세트를 추가하고 혼합합니다. 그런 다음 회전시킨 후 즉시 튜브를 섭씨 65도의 열순환기에 넣습니다.
샘플을 12시간 이상 30시간 이상 배양하지 마십시오. 먼저 카트리지와 플레이트를 실온으로 예열하여 준비 스테이션을 설정합니다. 그런 다음 플레이트를 스핀 다운합니다.
준비 스테이션을 로드하려면 스테이션 도어를 열고 시약 플레이트, 카트리지, 피펫 팁, 준비된 샘플을 0.2ml 스트립 튜브에 넣고 빈 0.2ml 12튜브 스트립 튜브 2개를 로봇의 적절한 위치에 로드합니다. 스트립 튜브 캡과 시약 플레이트 덮개를 제거합니다. 그런 다음 준비 스테이션 도어를 닫고 제어판에서 적절한 분석을 실행합니다.
고정되고 배향된 삼자 복합체의 바코드를 시각화하고 계산하려면 준비 스테이션에서 카트리지를 제거하고 제공된 덮개를 사용하여 밀봉한 다음 사용 가능한 슬롯의 디지털 분석기에 넣습니다. 터치 스크린을 사용하여 카트리지 정의 파일 또는 CDF를 만듭니다. 적절한 리포터 라이브러리 파일이 CDF의 각 샘플에 할당되어 있는지 확인합니다.
스캔이 완료되면 관련 QC 및 분석 프로토콜에 따라 데이터를 처리 및 분석하기 전에 USB 드라이브 또는 이메일을 통해 디지털 분석기에서 데이터 파일을 다운로드합니다. 유전자 발현 플랫폼 분석 시스템은 고도로 자동화된 특성을 통해 기술적 소음을 줄이며, 사용하는 고유한 화학 물질은 고정밀 유전자 발현 데이터를 생성합니다. 여기에 표시된 기술적 복제는 내인성 및 바이러스 microRNA 발현 정량화 모두에서 높은 재현성을 보여줍니다.
이 방법을 사용하면 건강한 연구 참가자가 정의한 대로 예상 발현에서 벗어난 바이러스 인코딩 및 내인성 인간 microRNA를 IBS의 관심 대상으로 식별할 수 있습니다. 이 방법의 정밀도와 감도를 통해 발현이 적은 표적 간의 섭동을 감지할 수 있으며 미묘한 섭동도 안정적으로 관찰할 수 있습니다. 이 수치는 건강한 대조군과 비교하여 IBS 및 IBS 아형에서 순환하는 microRNA의 일부 섭동을 보여줍니다.
IBS 참가자에서 가장 중요한 두 가지 차등적으로 상승된 microRNA가 여기에 제시되어 있습니다. 이 바이올린 플롯의 곡선은 miR-150에 대한 카운트 빈도를 나타냅니다. 세로 막대는 1사분위수와 3사분위수를 나타내고 빨간색 사각형은 중앙값 수를 나타냅니다.
이 절차에 따라 더 큰 코호트에서 바이오마커 서명을 검증하고 필수 RNA 및 단백질 연관성을 탐색하기 위해 동일한 기술을 기반으로 하는 보다 표적화된 맞춤형 분석을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 생물 의학 연구 분야의 연구자들이 질병에 대한 진단용 바이오마커 패널을 빠르고 정밀하게 개발할 수 있는 길을 열었습니다.
개요
본 논문은 전체 혈액 샘플에서 microRNA 발현을 정량화하기 위해 설계된 다중화 고처리량 유전자 발현 플랫폼을 소개합니다. 이 방법은 증폭 없이 정확한 측정을 가능하게 하므로 과민성 대장 증후군과 같은 질환 연구에 적합합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 유전자 발현 분석
- microRNA 정량화
- 소화기 질환 연구
배경
- microRNA는 유전자 조절에서 중요한 역할을 합니다.
- 이들의 발현을 이해하면 다양한 질병에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
- 기존 방법은 종종 증폭에 의존하는데, 이는 변동성을 유발할 수 있습니다.
- 본 연구는 새로운 접근 방식을 통해 이러한 한계를 극복하는 것을 목표로 합니다.
연구 목적
- 혈액 내 microRNA의 디지털 정량화를 위한 방법을 개발합니다.
- 과민성 대장 증후군에서 조절 장애가 있는 분자 메커니즘을 식별합니다.
- 소화기 질환에 대한 바이오마커 서명을 확립합니다.
사용된 방법
- 전체 혈액 샘플에서 자동화된 RNA 추출.
- 특정 시약을 사용하여 microRNA 샘플 준비.
- microRNA 검출을 위한 하이브리드화 및 리간드화 과정.
- 특수 플랫폼을 사용한 유전자 발현 데이터의 디지털 분석.
주요 결과
- 이 방법은 microRNA 수준을 정량화하는 데 높은 정확도를 입증했습니다.
- 기술 복제는 결과의 재현성을 보여주었습니다.
- 건강한 발현 프로파일에서 벗어난 microRNA를 식별했습니다.
- 낮은 발현 표적에서의 미묘한 교란을 안정적으로 검출했습니다.
결론
- 다중화 플랫폼은 혈액 내 microRNA 연구를 위한 견고한 도구를 제공합니다.
- 이는 소화기 질환의 분자적 기초를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 이 접근 방식은 과민성 대장 증후군에 대한 새로운 바이오마커 발견으로 이어질 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This multiplexed high-throughput gene expression platform enables robust, amplification-free quantification of circulating miRNAs, supporting biomarker discovery in digestive disorders such as irritable bowel syndrome. By providing high sensitivity and reproducibility in detecting low-expression miRNA perturbations, the method enhances target validation confidence and reduces mechanistic ambiguity in early discovery. Its automated workflow and digital counting approach improve assay standardization and scalability for cross-functional R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying dysregulated circulating miRNAs as potential biomarkers in IBS.
- Operational Value: Supports biological de-risking through precise, amplification-free quantification that minimizes technical variability.
- Predictive Value: Facilitates detection of subtle miRNA perturbations, improving confidence in target relevance and portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates highly reproducible, quantitative miRNA expression data suitable for assay standardization and biomarker panel development.
- Operational Value: Reduces investigator effects via largely automated sample preparation and robotic processing, enhancing throughput and consistency.
- Scalability: Permits multiplexed analysis of up to 800 transcripts per reaction, enabling efficient screening of miRNA signatures across cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports validation of circulating miRNA biomarkers discovered in human samples for further preclinical investigation.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of miRNA expression changes with disease subtypes, aiding in pathophysiological understanding.
- Predictive Confidence: Enables reliable detection of low-abundance miRNAs, improving biomarker sensitivity and reducing false-negative risk in translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis-driven biomarker screening to assay validation, supporting progression from early discovery to lead identification in digestive disorder research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing by quantifying miRNA expression changes in whole blood, clarifying dysregulated molecular pathways in IBS.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs with high linearity and sensitivity, supporting reliable compound or biomarker evaluation.
- Analytics: Provides digital barcode counts and normalized expression data that facilitate statistical comparison across conditions and cohorts.
- Translational Research: Connects circulating miRNA findings to disease relevance, supporting biomarker continuity into preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for miRNA profiling applicable across multiple therapeutic areas beyond gastrointestinal disorders.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing technical noise and enabling detection of low-expression miRNA changes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automation, minimizing batch effects and user variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust biomarker data, reducing late-stage failure risk due to poorly validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of miRNA biomarkers based on reproducible, quantifiable expression changes in clinically relevant samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling, automated liquid handling systems, and digital image analysis for accurate miRNA quantification.
- Dependent on access to robotic prep stations, digital analyzers, and proprietary fluorescent probe sets with color-coded barcodes.
- Necessitates cross-team standardization of sample collection, RNA normalization, and hybridization protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to different biofluids or tissue types beyond whole blood.
- Limited by the need for specialized reagents and equipment, which may constrain adoption in low-resource settings despite high reproducibility.
