Name: 절제된 자유 비행 꿀 꿀벌의 Neuropharmacological 조작, API를 mellifera이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 학습하세요 꿀벌 중추신경계에 약물을 투여하는 신경약리학적 조작법을. 구강 투여와 흉부·단안 주사를 통해 사회행동의 신경기전을 연구하고 비모델 생물의 신경생물학을 탐구하는 방법을 익히세요.

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이 프로젝트는 ARC 보조금 DP0986021와 NHMRC 보조금 585442에서 자금을 지원받았습니다. ABB는 ARC Future Fellowship(FT140100452)의 지원을 받습니다. JAP는 맥쿼리 대학교(Macquarie University)가 수여하는 iMQRES 장학금과 독일 학술 교류 서비스(German Academic Exchange Service)가 수여하는 DAAD-Doktorandenstipendium의 지원을 받습니다. JMD는 CNRS와 University Paul Sabatier의 지원을 받습니다.

마구 꿀벌 1. 약국 (FDA) <ol><li> 구강 치료 <ol><li> 물 500 ㎖로 크로즈 257g을 혼합하여 1.5 M 수크로오스 용액을 제조 하였다 (이것은 끓는 물에 자당이 양을 용해 쉽다). 사용할 때까지 4 ℃에서 자당 솔루션을 저장합니다. 참고 : 자당 솔루션은 특정 미생물에 대한 매우 친절 환경을 제공하고, 따라서 쉽게 오염 및 꿀벌에 싫은된다. 벌크 수크로오스 용액을 분취하고 사용할 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 적절한 약물 투여 량을 결정합니다 (아래의 토론 섹션에서 해결 그것을 달성하는 방법), 및 예를 들어, 20 μg의를 제공하기 위해 (선호하는 약물 투여 량은 20 μL에 용해되도록 자당 용액을 용액을 제조하는에서 약을 희석 1 ㎎ / ㎖의 비). 하네스 꿀벌 Felsenberg 등에 따라. (2011) 16. 오 꿀벌이 더 이상 강조되지 않도록하기 위해 적어도 12 시간 약물 치료 전에이 단계를 수행약액이 제공 될 때 활용에서 유타. 주 : 자세한 일관된 결과를 들어,이 O / N (34 ° C 및 70 % 습도 인큐베이터에서 무력화 꿀벌을 배치하여) 꿀벌을 굶어하는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 마이크로 피펫을 사용하여 밝혀 꿀벌의 안테나에 1.5 M 수크로오스 물방울을 터치. 프로보 시스가 확장되면, 꿀벌의 코에 직접 약물을 함유하는 1.5 M 슈크로 오스 20 ㎕의 액 적을 터치. 꿀벌이 모든 것을 소비해야합니다. 차량 제어로 추가 약물없이 1.5 M 자당 솔루션을 사용합니다. 참고 : 자당 용액의 양은 실험 계획에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. appetitive 조절이 의도하는 경우, 훈련 직전에 꿀벌을 공급하는 꿀벌 &#39;응답을 방해합니다. </li><li> 폐기 또는 자당을 모두 소비하지 않는 꿀벌을 따로 설정합니다. 주 : 꿀벌 다수 자당 용액 마시 실패하면 반송 스케줄을 조정해야 할 수도있다. </li></ol></li><li> 흉부에 주입 <ol><li> 다음과 같이 꿀벌에 벨소리 17 약을 준비합니다 : <ol><li> 혼합 및 오토 클레이브 7.45 g의 NaCl, 0.448 g의 KCl, 0.812 g의의 MgCl 2, 0.735 g의 CaCl2를, 54.72 g 자당, 4.95 g의 D-포도당, 물 1,000 ml의에서 2.48 g의 HEPES. 그것은 쉽게 오염으로 벨소리를 저장할 때주의해야합니다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 나누어지는 및 저장 벨소리. </li><li> 링거 용액에 약물을 녹인 다음, 원하는 양의 5 μL 존재가되도록 희석한다. 1 μg의 / μL의 최종 솔루션 링거 1000 : 꿀벌 약물 5㎍을 처리 할 경우에는 예를 들어, 1 g의 초기 한 희석 전에 링거액, 1 ㎖에 용해시킬 수있다. 주 : 대안 적으로, 시판은 PBS (살랑를 인산 완충) 대신 링거 용액을 사용할 수있다. </li></ol></li><li> 양날 면도날의 모서리를 파괴하여 microscalpel합니다블레이드 홀더. 그것은 날카로운 끝 지점과 함께 좋은 날을 수 있도록 블레이드 홀더에 칼날 조각을 연결합니다. </li><li> 실체 현미경에서 조심스럽게 옆에 꿀벌의 흉부의 후방 날개 프로세스에 바로 배반 위에 2mm 구멍을 잘라 microscalpel를 사용합니다. 이 비행 근육을 다칠 수 있습니다으로 너무 깊이 절단하지 말고, 날개 경첩을 피하기 위해주의해야합니다. 표피의 플랩 나중에 부상의 사이트를 닫고 다시 접을 수 있도록 이상적으로, 만, 세 가지 측면을 잘라. </li><li> 흉부에있는 구멍의 상단에있는 약물을 포함하는 마이크로 피펫, 보증금 5 μlL 벨소리 (또는 PBS)를 사용. 조심스럽게 전체 강하가 체액에 흡수되어 있는지 확인하기 위해 현미경으로 모니터링 할 수 있습니다. 차량 제어로 벨소리 (또는 PBS)를 사용합니다. </li><li> 가능하면, 다시 구멍을 통해 표피 플랩 이동합니다. 5 ~ 10 시간 후에는 다시 연결하고 밀봉한다. 주 :이 방법의 대안으로서, SMA 개봉 후, 유리 주사기를 사용 흉부에 직접 1 μL를 주입주사기 바늘로 frenum합니다 (배반의 후방 지역의 가로 라인)의 중간에 LL 구멍 (직경 : 0.6 mm, G : 23). 이것은 제 메스 및 주사 부위 작다와 흉부를 절단 할 필요를 회피하지만,이 방법은, 노광 주사 부위를 떠날 것이다. </li></ol></li><li> Ocellus 주입 주 :이 체액으로, 헤드 캡슐에 걸쳐 분자를 전달하기위한 적합한 방법이다. <ol><li> 1.2.1와 같이 약물을 제조하지만, 원하는 투여 량 링거액 또는 PBS 중 1 ㎕를 함유 이도록 약물 농도를 조절 (더 적은 부피 흉부 통해보다 ocellus 홀을 통해 흡수 될 수있다). </li><li> 1.2.2에서와 같이 microscalpel를 준비합니다. 실체 현미경에서 왁스와 목의 틈새를 작성하여 장소에 무력화 꿀벌의 머리를 잠급니다. 손상 더듬이 후각 또는 I를 할 수있는 다른 셀을 방지하기 위해 저온 용융 왁스 (예를 들면, 치과 용 왁스)를 사용하여행동 (예를 들어, 후각 학습)을 평가하기위한 mportant. 조심스럽게 렌즈 아래 microscalpel의 선단부를 삽입하여 중간 ocellus 렌즈를 제거하고 부드럽게 머리 캡슐이없는 렌즈를 휴식. 주 : 이동을 방지하기 위해, 안테나를 통해주의 깊게 왁스를 배치하는 것도 가능하다. </li><li> 조심스럽게 ocellus 구멍에 약을 피펫. 모두가 머리를 캡슐에 촬영 될 때까지 기다립니다. 안테나에서 치과 왁스를 제거하고 꿀벌 실험 절차를 계속하기 전에 잠시 동안 휴식 할 수 있습니다. 차량 제어로 벨소리 (또는 PBS)를 사용합니다. </li></ol></li><li> ocellar 기관에 주입 주 : ocellar 기관이 큰 섬유를 포함, 중앙 뇌 (18)의 대부분의 지역에 연결. 이 처리 방법만을 뇌로 화합물을 적용하지만, 뇌의 특정 하위 영역 타겟팅되지 있습니다. <ol><li> 1.3.2에서와 같이 벌을 준비합니다. 그리고 t와 중간 ocellus의 렌즈를 제거1.3.3에서와 같이 microscalpel의 IP. 참고 :이 주입하기 전에 2 시간까지 수행 할 수 있습니다. 우리의 경험을 바탕으로, 공급 꿀벌 굶주린 꿀벌보다이 수술에 대처 더 잘 할 수있다 </li><li> 작은 게이지가 장착 된 10 μL 유리 주사기를 작성 (예를 들어, 33, 직경 210 μm의) 약물 용액 바늘 1.3.1에서와 같이 제조 함. </li><li> 수동 미세 조작기를 사용하여, 50 ㎛의 깊이까지 헤드 캡슐로 ocellar 망막을 통해 주사기의 끝 부분을 삽입하여 용액 250 NL 주입. </li><li> 사용 후에는, 그 후, 증류수로 주사기를 75 % 에탄올로 3 회 3 회 헹군다. </li></ol></li><li> 특정 뇌 구조에 미세 주입 주의 : 전술 한 체계적인 치료 이외에, 그것은 특히 뇌 구조로 microinjections을 수행 할 수있다. 영향을받지 않는 다른 남기고 이것은 하나 이상의 뇌 영역의 약리학 적 조작을 허용한다. 이 작품뇌의 앞쪽 뇌 표면 (예를 들어, 더듬이 로브, 버섯 몸 꽃받침 또는 수직 로브, 또는 광학 로브)에서 인식하기 쉬운 지역이지만, 다른 지역과 가장을 대상으로하고있다. 방향 (전방 / 후방, 지느러미 / 복부)가 neuraxis 19보다, 오히려 몸 축에 의미 있습니다. <ol><li> 형광을 추가 1.2.1에서와 동일한 방식으로 벨소리 또는 PBS에 약물을 준비한다 (예, 0.5 ㎎ / ㎖ 덱스 트란 알렉사 546 또는 568 불소) 또는 비 형광 색소 (예를 들면, 1 mM의 메틸렌 블루). 참고 실험 (뇌 절개 다음, 공 초점 현미경을 사용하여)를 통해 후 비 형광 염료가 실험 기간 동안 직접 모니터링을 허용하는 반면 형광 염료의 첨가는 주입 위치의 인증을 허용 할 것이다. </li><li> 표준 개최 (전극 풀러의 홀더 클램프에 1.0 mm를 올바른 직경의 유리 모세관을 삽입, 주입 용 유리 피펫을 만들려면어 물질 목록에 언급 된 마이크로 인젝터)을 위해 포함되어 있습니다. 약 0.5 cm 길이 팁을 제조 당겨 열 설정을 조정 (설정은 동일한 모델이 사용 되더라도, 각 풀러에 대해 상이 할 것이다). 주의 : 이상적으로, 두 피펫 모두 사용할 수 있도록 동일한 길이와 형상을 가져야 하나의 유리로부터 뽑아. </li><li> 실체 현미경 아래에서 눈에 삽입 된 계수의 크기를 이용하여 비주얼 추정에 기초하여, 약 10 ~ 15 ㎛의 외경을 구하는 팁 휴식. 눈금 단계는 제조자에 의해 정의되고 사용 된 배율 보정 될 수있다. </li><li> 그런 다음 주입하는 용액을 유리 피펫을 입력합니다. 필라멘트 유리 모세관을 사용하는 경우, 그렇지 않으면 microloader 팁을 사용 팁을 작성하여 약물 용액에 뒷면을 배치하여 피펫을 입력합니다. </li><li> 수동 또는 전자식 MI에 의해 제어되는 마이크로 인젝터의 모세관 홀더로 채워진 유리 피펫을 삽입cromanipulator. </li><li> (타겟 뇌 구조의 크기에 따라 0.5 NL) 원하는 볼륨을 주사하도록 마이크로 인젝터 보정. 이를 위해 미네랄 오일을 함유하는 작은 페트리 접시에 직접 주사하여 계수와 액체 방울의 직경을 측정한다. 원하는 볼륨에 도달 할 때까지 설정을 변경합니다. </li><li> 세 인하와 더불어, microscalpel를 사용하여 헤드 캡슐의 앞쪽 부분에 개구부를 절단하기 전에, 1.3.2에서와 같이 부드러운 치과 용 왁스를 사용하여 무력화 꿀벌의 머리를 수정 : 그냥 중간 ocellus 아래 하나 (복부), 하나에서 안테나 위의 오른쪽 또는 왼쪽 눈과 하나의 테두리 (지느러미) 유래한다. 장소에서 열린 플랩을 개최 치과 왁스의 조각을 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 분비 따로 미세 집게를 사용하여 뇌의 상단에 거짓말 기관이 다음 대상 뇌 구조 이상 (뇌 주위에 매우 얇은 막)을 neurilemma에 작은 파열을 누릅니다. 참고 : 많은 꿀벌이 한 번에 처리 할 경우,이 절차를이전에 수행 될 수있다; 뇌가 건조하는 수도로, (더 이상 30 분 이상) 너무 오래이 상태에서 꿀벌을 떠나지에 그러나주의해야합니다. </li><li> 원하는 뇌 영역에 팁을 삽입하고 뇌 표면에 수직 깊이를 조정 (예를 들어, 버섯 몸 꽃받침 60 μm의). 사전 설정 볼륨을 주입한다. 측면 뇌 영역의 경우 (즉, 각 반구 하나의 주입을) 양자 주입. 비 형광 염료를 사용하는 경우, 주입하는 동안 관찰에 적합한 영역에서 발생한 주사를 보장한다. 형광 염료를 사용하는 경우, 형광 관찰 시스템 실체 현미경을 이용하여 형광등 아래에서 동일한 작업을 수행. </li><li> 그 후, 다시 꿀벌의 머리 위에 열려있는 플랩을 배치합니다. 마이크로 납땜 인두의 끝을 감싸 얇은 와이어를 사용하여, 직경 약 1mm 인 에이코의 결정을 용융 (용융 온도 것은 35-37 °의 C이다)과 상처를 봉인. 이것은 크게 사망률을 줄일 수 있습니다. </li><li> 릴리스예를 들어, 코 확장 반사 (PER) 20 테스트 - 행동 분석을위한 하네스에서 꿀벌 (그러나 설명을 참조), 또는 구속 꿀벌 실험을위한 하네스에 보관하십시오. </li><li> 형광 염료를 사용한 경우의 실험 공 초점 레이저 주사 현미경 (도. 1)를 사용하는 동안 후 분사가 관심 영역에 충돌 확인. 주 : (가 주입 단계 동안 비 형광 염료를 참조 어려운 것) 깊은 뇌 영역을 목표로 할 때 특히 유용하다. </li></ol></li></ol> 무료 비행 꿀벌 2. 의약품 안전청 방법 <ol><li> 구강 치료 <ol><li> 단계에서와 동일한 방법으로 약물을 준비 1.1.1-1.1.2. 급 지대에 약액을 추가하고 저장 냉장고에 넣습니다. 주 : 모든 장치는 거꾸로 병 뚜껑이나 티슈 페이퍼에 반전 항아리로 할 것입니다. </li><li> 1 M 또는 0.5를 포함하는 중력 공급에 꿀벌 기차하이브에 가까운 공급 장치를 배치하여 M 자당 솔루션입니다. 꿀벌 피더에서 꼴을 시작하면 그것은 (최소 5m) 찌르 게되는 것을 방지하기 위해 편안한 거리가 될 때까지 점진적으로 더 멀리 이동합니다. </li><li> 순서 페인트 마크 꿀벌 개별 꿀벌을 추적합니다. 사용되는 모든 색상 조합의 목록을 확인합니다. 피더에서 꿀벌 땅은 조심스럽게 두 가지 색상과의 복부를 표시하고, 조합이 촬영 목록에 메모를 할 때. </li><li> 약물 / 자당 솔루션을 포함하는 장치에 대한 중력 공급 장치를 교체합니다. 피더를 방문 표시된 꿀벌 기록해 둡니다. 꿀벌 다작의 채용만큼 공급기를 방문하는 표시되지 않은 벌, 신속하게 통제 얻을 수있는 마약을 상용 공급을 방문하는 꿀벌의 숫자를 잡아라. 동일한 실험이 연속 일에 수행 될 경우, 나이브 꿀벌이 더 이상 없을 나이브 하듯이 특히 문제가된다. 참고 : 급 지대에 개별 꿀벌을 훈련, 이전의 저자에 대한 대안으로23 -의 성공적 전체 하이브 (21)에 약물 레이스 크로스 물을 공급하고있다. </li></ol></li><li> 국소 치료 주 : 목적은 왁스 곤충 표피를 관통 할 수있는 용매에 관심있는 화합물을 용해하는 것이다. 용제는이 목적을 위해 사용될 수있다. 가장 일반적으로 사용되는 아세톤, 디메틸 포름 아미드 (DMF) 및 디메틸 술폭 시드 (DMSO)를 포함한다. <ol><li> 용매가 손 화합물에 대한 가장 적합한 평가합니다. 강력한 표현형이 조심스럽게 다른 용매의 각각에 용해 과다 복용 (예를 들어, 마비 또는 사망), 고용량으로 치료 꿀벌 (단계 2.2.2) (예를 들어, 20 μg의 코카인 7)에서 예상되는 경우 마비까지 시간을 모니터링 또는 사망. </li><li> 1 μL의 마이크로 캐 필러 (또는 마이크로 실린 적절한 반복 디스펜서에 부착 될 수 있음) 및 마이크로 캐 필러 홀더를 사용하여 약액의 1 μL (예를 들어, 3 무승부(81), 모세관에 코카인 g / μL). 드롭을 추방 조심스럽게 표시된 꿀벌의 가슴에 그것을 페인트. 꿀벌은 다음을 신랑 가능성 등의 영역이 아니라 고체 드롭을 떠나보다, 솔루션과 가능성의 큰 커버. 화합물이 날개 경첩, 또는이 흉부 떨어져 그것을 끌어와는 체액에 흡수되지 않고 증발 측면을 따라 할 수 닿지 않도록주의하십시오. 참고 : 연구 목표에 따라이 방법은 꿀벌의 복부에 약물을 관리하는 데 사용할 수 있습니다. 흉부 (24) .This 방법을 작품에 적용 동일하게 무료로 비행 꿀벌로 밝혀 그러나 약물은 더 빠르고 더 많은 양의 CNS에 도달합니다. </li></ol></li><li> 휘발 처리 <ol><li> 약물을 용해 100 % 에탄올 (이전에이 방법은 꿀벌 (10)에 코카인을 전달하는 데 사용되었다). 가용성을 보장하기 위해, 염산염 또는 다른 염 형태를 사용하지 않는약물 가능한 경우. 양 꿀벌에 전달할되도록 희석하여 제조 할 때는 100 μL로 존재한다. 차량 제어로 순수 에탄올을 사용합니다. </li><li> 필라멘트를 만들려면 McClung와 Hirsh (25)와 동일한 절차를 사용합니다. <ol><li> 간단히 설명 : 손톱 주위에 단단히 니크롬 선을 바람과 두 개의 전선 (필라멘트의 각 끝에 하나)에 연결합니다. 못을 제거합니다. 나머지 니크롬 코일 필라멘트로서 지칭된다. </li><li> 선택된 온도에 저항력이 있어야 50 mL의 원심 분리 튜브의 뚜껑으로주의 깊게 천공 홀을 통해 배선을 두 스레드. 액체 실리콘과 장소에 와이어를 접착제. 참고 :이 튜브 밀폐 할 것입니다. 이 실험에 이차 노출을 방지하고 꿀벌이 적절한 투여 량으로 처리되어 있는지 확인하는 것이 필수적이다. </li></ol></li><li> 전원에 필라멘트로 이어지는 선을 연결. 열전쌍을 사용하여 온도를 측정필라멘트, 이상적으로, 문제의 약물에 대한 적절한 온도 프로파일을 초래 하나, 난방 이하의 10 초를 허용 하나까지 서로 다른 전압 / 전류 조합으로 실험. 이것은 매우 중요하다, (적어도 200 ° C까지 가열 할 필요가 휘발 코카인 위해서는 예를 들어,하지만, 350 °의 C 이상 온도가 보조 화합물 (26)로 분해된다) 관련 문헌을 참조하십시오. </li><li> 조심스럽게 필라멘트 상 에탄올 용액을 포함하는 약 100 μl를 피펫. 이러한 증착 효율을 증가하므로 가급적 필라멘트 표면에 액체를 확산. 모든 에탄올이 증발 될 때까지 상온에서 노출 된 필라멘트를 남겨주세요. 주 : 에탄올이 충분히 증발되지 않으면 꿀벌 선택과 에탄올의 약물 모두로 처리한다. 꿀벌은 에탄올에 매우 민감한, 일부 약은 어떤 것 바이어스 전을 에탄올로 시너지 상호 작용이perimental 결과. </li><li> 에탄올을 완전히 (약물의 침전이 보통 현미경 건조 필라멘트에서 알 수있는)이 증발되면, 50 ㎖ 튜브에서 자유 비행 꿀벌 타기. 조심스럽게 필라멘트를 포함하는 덮개를 닫습니다. </li><li> 10 초 동안 전원을 켜고 전원을 끄고 다른 50 초를 기다립니다 (휘발 된 화합물을 냉각하여 응축 또는 예금 할 수 있도록하기 위해). 꿀벌을 놓습니다. 참고 :이 치료 방법은 자유 비행 꿀벌에 대한 뛰어난 작동하지만, 그냥 효과적으로 무력화 꿀벌 사용할 수 있습니다. 단순히 50 ML 튜브 내부의 무력화 꿀벌을 연결합니다. 꿀벌 사이에 2.3.4에 설명 된대로 필라멘트를 다시로드하십시오. 높은 처리량, 여러 섬유는 병렬로 사용될 수있다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

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위에서 설명한 방법은 자유 비행 또는 무력화 꿀벌 중 하나의 간단하고 효과적이고 강력한 치료를 할 수 있습니다. 이러한 방법은 많은 실험 패러다임 생물 질문 (표 1)와 호환됩니다. 자유 비행하는 모든 방법을 쉽게 밝혀 꿀벌에 적용될 수있다. 임시 구속 침습성 치료 방법은 종종 꿀벌 &#39;비행하는 능력을 손상시킬 수 있기 때문에 역방향 그러나 덜 성공적이다. 방법은 뇌 중심의 관점에서 제시되었다. 이것은 오히려 때문에 저자의 개인적 관심, 기술의 본질적인 한계로 인해 없습니다. 이 방법은 다른 기관을 연구에 사용할 수없는 이유가 없다. 그러나, 작은 수정은 다른 기관 시스템에 방법이 더 적합 할 필요할 수 있습니다. 국소 치료가 뇌에 도달하기위한 예를 들어, 일반적으로 흉부에 적용되고 생 적용하는 것이 좋을 수도복부에들 의도 된 대상은 난소 경우. 마찬가지로, 주사가 용이 흉부 또는 헤드 이외의 부분에 적용될 수있다 (예를 들면,</e...

카를 폰 프리 슈는 자신의 춤 언어 (1)를 밝혀 때문에, 꿀벌은 동물의 행동 및 신경 생물학 연구자를위한 인기있는 연구 종을 남아있다. 최근 새로운 분야의 수많은 이러한 두 필드 및 그들과 함께 제기 한 여러 가지 다른 분야 (예를 들면, 분자 생물학, 유전학, 컴퓨터 과학)의 교차점에 나왔다. 이것은 문제가 신경계 내에서 활동의 결과 방법을 이해하기위한 새로운 이론과 모델의 신속한 개발을 주도하고있다. 때문에 독특한 라이프 스타일, 풍부한 행동 레퍼토리, 실험 및 약리 조작의 용이성, 꿀벌이 혁명의 최전선에 남아있다. 꿀벌은 같은 그 기본 학습과 기억 2, 3, 결정 (4)을, 후각 5, 시각 처리 (6)과 같은 기본적인 신경 생물학적 문제를 연구하는 데 사용하고있다. 최근 몇 년 동안, 혼11, 잠 12 13 노화, 또는 메커니즘 마취 (14)의 기초 - EY 꿀벌도 같은 중독성 약물 (7)의 영향으로 일반적으로 의학 연구를 위해 예약 주제를 연구하기위한 모델로 사용되어왔다. 고전적인 유전자 모델 생물에 대한 달리 (예를 들어, D. melanogaster의, 선충, M.의의 musculus)이 현재 15을 변경하더라도 꿀벌의 신경 기능을 조작 할 수 거의 유전 적 도구가 있습니다. 대신, 꿀벌 연구는 주로 약리 조작에 의존하고있다. 이것은 매우 성공적이었다; 그러나, 꿀벌의 연구는 다양한 약물 투여 방법의 범위가 필요되도록한다. 꿀 꿀벌 연구는 다른 분야와 배경을 가진 연구자들에 의해 연구되고, 매우 다양한 문제를 해결하고, 실험 방법의 다양한 사용합니다. 많은 rese아치 질문에 자유롭게 그들의 식민지, 또는 두 가지 모두에 상호 작용이 될 자유 비행에 꿀벌을 필요로한다. 이것은 어려운 개별 실험 동물을 추적 할 수 있도록하고, 억제 또는 삽관 실현성하게 할 수있다. 꿀벌 연구의 다양성을 수용하기 위해, 약물 전달 방법의 다양한 약물 동력 학적 및 약력 학적 프로필에있어서의 침입, 및 신뢰성 문제의 패러다임에 맞는 것을 보장하면서 강력하고 유연한 관리를 허용 필요하다. 때문에 이러한 다양한 요구, 대부분의 연구 그룹은 그들 만의 독특한 약물 투여 방법을 개발했습니다. 지금까지이 꿀벌 연구 커뮤니티의 힘이었다; 이는 다른 환경에서 동일한 약제의 투여 방법을 가능 어레이의 개발을 유도 하였다. 여기에 우리의 목표는 꿀벌의 약리 조작에 대해 하나의 표준화 된 방법을 개발하는 것이 아니라 방법을 강조하지 않습니다 그특히 성공적인 것으로 입증, 도움 연구자들은이를 채택했다. 우리는 기본 작동 방식의 원칙뿐만 아니라, 자신의 장점과 단점에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>설탕</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td>어떤 공급업체든지</td></tr><tr><td>소듐 클로라이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 클로</td>라이드 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333을 할 것입니다&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>포도당 일수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>49159</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수(PBS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>보호 왁스</td><td>덴타우럼</td><td>124-305-00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마 -알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 포름 아미드</td><td>시그마 -알드리치</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>95 % 에탄올</td><td>시그마 -알드리치</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>WPI</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>23 G NanoFil 바늘</td><td></td><td>WPI NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>매우 미세한 forsceps</td><td>Dumont</td><td>0208-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>전극 풀러</td><td>SRI</td><td>2001</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.01</td><td></td></tr><tr><td>Eicosane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>219274</td><td></td></tr><tr><td>수동 micromanipulator</td><td>Brinkmann Instrumentenbau</td><td>MM-33</td><td></td></tr><tr><td>전자 micromanipulator</td><td>Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik</td><td>Junior 장치 XYZ</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>납땜 인두</td><td>Weller</td><td>WESD51</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000MW</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D-22911</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000MW</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D-22912</td><td></td></tr><tr><td>소형 페트리 접시</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원심분리기 튜브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>호주 곤충학 용품</td><td></td><td></td></tr><tr><td>블레이드 홀더 및 차단기</td><td>호주 곤충학 용품</td><td>E130</td><td></td></tr><tr><td>깃털 양날 면도날</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-949-135</td><td></td></tr><tr><td>니크롬 와이어</td><td></td><td></td><td>모든 공급 업체가 할 것입니다</td></tr><tr><td>전기 와이어</td><td></td><td></td><td>모든 공급 업체가 할 것입니다</td></tr><tr><td>모델 페인트</td><td>Tamiya USA</td><td>색상</td><td></td>에 따라</tr><tr><td>다름 반복 디스펜서</td><td>Hamilton company</td><td>PB-600-1</td><td></td></tr><tr><td>유리 주사기</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>형광 관측 시스템</td><td>Nightsea</td><td>SFR-GR</td><td></td></tr><tr><td>graticule</td><td>ProSciTech</td><td>S8014-24</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 모세관 홀더</td><td>포함 Drummond</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>액체 실리콘</td><td></td><td></td><td>모든 공급 업체가</td></tr><tr><td>열전대를</td> 수행합니다 <td>Digitech</td><td>QM-1324</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

절제된 자유 비행 꿀 꿀벌의 neuropharmacological 조작,<em&gt; api를 mellifera이</em

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

꿀벌은 놀라운 학습 능력 및 고급 사회적 행동과 의사 소통을 보여줍니다. 또한, 뇌는 작은 시각화하고 연구하기 쉽다. 따라서, 꿀벌은 오랫동안 사회와 자연 행동의 신경 기초를 공부 신경 생물 학자와 neuroethologists 사이에 선호하는 모델이었다. 이는 동작을 방해하지 꿀벌을 연구하기위한 실험 방법이 검토되고 있다는 것이 중요하다. 이 때문에 꿀벌의 약리학 적 조작을위한 기술의 범위를 개발할 필요가 있었다. 이 논문에서 우리는 약리 에이전트의 광범위한 절제 또는 자유 비행 꿀벌을 치료하는 방법을 보여줍니다. 이 중 하나를 전신 또는 국소 방식으로 정확한 약물 전달을 허용 모두 경구 및 국소 치료와 같은 비 침습적 방법뿐만 아니라 더 침습적 인 방법을 포함한다. 마지막으로, 우리는 각 방법의 장점과 단점을 토론하고 설명일반적인 장애물과 최선의 방법을 극복하는 방법. 우리는 생물학적 질문이 아닌 다른 방법으로 주위에 실험 방법을 적응의 중요성에 대한 논의와 결론 지었다.

상기의 방법에 대한 대표적인 결과의 선택은 주로 방법은 약리 에이전트가 뇌에 도달 할 수 있도록, 꿀 꿀벌의 행동에 영향을 미치는 것을 입증하기 위해 표시됩니다. 뇌의 특정 처리의 효과를 용이 흉부 주입 다음을 얻을 수있다. 약리 에이전트가 몸에 여러 대상에 따라 행동 할 수 있고, 뇌에 도달하기 전에 몸에 희석 얻을 흉부 통해 주입하기 때문에,이 기술은 가능한 특이성 문제를 제기 할 수있다. 그럼에도 불구하고,이 주요 차 효과를 얻을 수있는 매우 높은 투여 량을 사용할 필요없이,인지 과정을 방해하기 문헌에서 널리 사용되어왔다. 예를 들어, 전사 차단제 유전자를 필요로 메모리의 위상을 확인하기 위해이 기술을 사용하여 투여되었다표현. 이러한 분자의 흉부 주입...

이 원고는 자유 비행 꿀벌에 대한 간단한 비 침습적 방법뿐만 아니라 억제 꿀벌의 정확한 지역화 된 처리 수 있도록 더 많은 침략 변종을 포함, 꿀벌에 약리 에이전트를 관리하기위한 여러 프로토콜을 설명합니다.

절제된 자유 비행 꿀 꿀벌의 Neuropharmacological 조작,<em&gt; API를 mellifera이</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

이 절차들의 전반적인 목표는 꿀벌이나 유사한 곤충의 중추 신경계에 약리제를 신뢰할 수 있고 견고하게 투여하는 것입니다. 이러한 방법들은 사회적 행동의 신경 기전 탐구와 같이 사회생물학, 신경행동학 및 양봉학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술들의 주요 장점은 현재 유전적 도구가 제한적인 꿀벌과 같은 비모델 생물체에서 신경생물학 연구를 가능하게 한다는 점입니다.시연은 Macquarie University Neuroethology Lab의 대학원생인 Jenny Plath가 진행하겠습니다. 약물은 경구 투여 또는 주사로 투여할 수 있습니다. 주사는 흉부, 홑눈 또는 홑눈 신경로에 실시할 수 있습니다.홑눈(Ocellus) 주입은 머리 전체에 약물을 전달하며, 홑눈 경로(ocellar tract) 주입은 뇌의 특정 영역을 표적으로 합니다. 모든 주입을 위해, 블레이드 홀더가 있는 양날 면도날의 모서리 부분을 부러뜨려 마이크로 스칼펠을 제작하십시오. 블레이드 파편을 블레이드 홀더에 부착하여 끝부분이 날카로운 적절한 칼날을 만듭니다.흉부 주사를 위해 벌의 흉부 후방 날개 돌기 옆, 소순판(scutellum) 바로 위에 2mm 크기의 구멍을 뚫습니다. 너무 깊게 절개하면 비행 근육이 손상될 수 있으므로 주의하고, 날개 경첩 부위를 건드리지 않도록 조심하십시오. 가급적 세 면만 절개하여, 나중에 큐티클 덮개를 다시 접어 손상 부위를 닫을 수 있게 합니다.이제 약물을 흉부로 주입하십시오. 그런 다음 큐티클 플랩을 구멍 위로 다시 덮어주면, 10시간 후에 다시 부착되어 밀봉됩니다. 뇌에 접근하려면, 더듬이의 후각 수용체나 꿀벌의 행동에 중요할 수 있는 다른 세포들을 손상시키지 않도록 손으로 따뜻하게 데운 치과용 왁스로 목 틈새를 채워 고정된 꿀벌의 머리를 고정하십시오.더듬이는 치과용 왁스로 고정할 수 있습니다. 그런 다음 마이크로 스칼펠을 사용하여, 스칼펠 끝을 렌즈 아래로 삽입하고 머리 캡슐에서 렌즈를 조심스럽게 떼어내어 중앙 홑눈의 렌즈를 제거합니다. 약물이 머리 캡슐 전체로 흡수되게 하려면, 홑눈 구멍 위에 약물을 조심스럽게 피펫으로 떨어뜨리고 약물이 스며들 때까지 기다립니다.또는 홑눈관(ocellar tract)을 통해 뇌의 하위 영역을 표적으로 삼을 수 있는데, 예를 들어 홑눈 인접 뇌 구조를 표적으로 하기 위해 50 µm 깊이에 250 nL의 약물을 주입하는 방식이 있습니다. 그 후 치

neuropharmacological-manipulation-restrained-free-flying-honey-bees

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 마약 조직의 응용 프로그램에서 꿀벌의 후각 appetitive 에어컨 패러다임 (아피스 mellifera)의 행동 약리학 방법을 구현하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 메커니즘 기본 학습과 간단하고 안정적​​인 방식으로 메모리 형성의 조사를 허용합니다.

꿀벌의 코 확장 응답 클래식 컨디셔닝에 Behavioural 약리학 ( 아피스 mellifera)

이 프로토콜에서 우리는 상태로 촉각 자극에 꿀벌을 밝혀와 고급 규모의 antennal 샘플링 패턴의 운동학을 분석하는 차원 모션 캡처 기술을 소개하는 방법을 보여줍니다.

촉각 시설과 꿀벌에 Antennal 샘플링 전략의 움직임 분석 (<em&gt; API를 mellifera</em&gt; L.)

이 프로토콜에서는, 우리는 동시에 꿀벌 두 개의 유전자 (더블 유전자 최저를) 억제 두 가지 전략에 대해 설명합니다. 그럼 우리는 꿀벌 미각 지각을 두 번 유전자 최저의 효과를 연구하는 코 확장 응답 (PER) 분석을 사용하는 방법을 제시한다.

꿀벌의 RNAi를 매개로 두 유전자 넉다운과 미각 지각 측정 (<em&gt; 아피스 mellifera</em&gt;)

꿀벌(Apis mellifera)을 위해 개발된 코확장반응(PER) 조절프로토콜은 많은 곤충 종에서 여러 가지 학습 메커니즘을 연구하기 위한 생태학적으로 관련성이 있고 쉽게 정량화할 수 있는 수단을 제공합니다.

코 확장 응답 곤충의 행동 소성을 조사하기위한 프로토콜 : 기본, 바이오 메디컬에 응용 프로그램, 및 농업 연구

두 개의 서로 다른 뇌 neuropiles 또는 두 개의 서로 다른 해부학 책자에서 동시 세포 장기 기록은 꿀벌에 설립되었다. 이 기록은 다른 뇌 영역 하나의 신경 세포에서뿐만 아니라 행동 동물의 앙상블 수준에서 신경 세포의 처리 시간 측면의 조사를 할 수 있습니다.

행동을 한 꿀벌 두 신경 처리 단계에서 동시 장기 녹음

용액의 영양분과 독소에 대해 자유롭게 움직이는 호박벌(Bombus terrestris)의 입 부분의 단기 미각 반응을 조사하기 위한 새로운 행동 분석법이 설명되어 있습니다.

소설 행동 분석은 (엉망으로 꿀벌을 자유롭게 이동 개인의 미각 응답을 조사하기<em&gt; 뒤의 terrestris</em&gt;)

여기에서 우리는 단일 코호트 꿀벌 식민지의 제조를위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명 - 롤 관련 근로자의 생리를 분석하기위한 유용한 도구입니다. 우리는 또한 작업자의 행동 및 / 또는 생리 조절에 이러한 호르몬의 참여를 평가하기 위해 청소년 호르몬과 에크 디손과 근로자를 치료하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

단일 코호트 식민지와 노동자 꿀벌의 호르몬 치료의 준비 역할 및 / 또는 내분비 시스템과 생리학 관련 분석하기

꿀벌 식민지의 손실은 작물 수분 서비스에 대한 도전입니다. 현재의 pollinator 보호 관행은 혐기성 화학 물질을 사용하여 유해한 농약에 대한 꿀벌의 접촉을 최소화하기위한 대체적인 접근법을 보증합니다. 여기서 우리는 벌에 대한 억지력을 스크린하기위한 시각적 추적 프로토콜에 대한 상세한 방법을 제공합니다.

꿀벌을위한 억제 성 화학 물질을 차단하는 비디오 추적 프로토콜

이 프로토콜 기존의 컴퓨터를 사용 하 여 기존의 웹 카메라 비디오에서 곤충 안테나 및 코 위치의 프레임별으로 추적을 위한 새로운 소프트웨어, SwarmSight, 사용 하기 위한 단계를 설명 합니다. 무료, 오픈-소스 소프트웨어 프레임 약 120 배를 인간 보다 더 빨리 처리 하 고 이상의 인간의 정확도에서 수행 합니다.

SwarmSight: 곤충 안테나와 일반적인 준비와 기존 하드웨어를 사용 하 여 코 확장 반사의 실시간 추적

꿀벌 두뇌의 다른 지역에서 phospholipase C (PLC)에 pharmacologic 에이전트의 억제 효과 테스트 하려면 우리는 그 지역에서 PLC 활동을 측정 하는 생 화 확 적인 분석 결과 제시. 이 분석 결과 PLC 활동 조직 들 뿐만 아니라 다른 행동을 전시 하는 꿀벌 들을 비교 하는 데 유용 수 있습니다.

꿀벌에서 두뇌 Homogenate에서 Phospholipase C 활동의 탐지

여기서 제시된 프로토콜은 항체 특이성을 시험하기 위해 성인 꿀벌 뇌에서 단백질의 생산을 감소시키기 위한 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하는 프로토콜이다.

CRISPR-Cas9를 사용하여 꿀벌 뇌 섹션에서 항 RDL 및 안티 mGlutR1 수용체 항체 테스트

학습하세요 꿀벌 중추신경계에 약물을 투여하는 신경약리학적 조작법을. 구강 투여와 흉부·단안 주사를 통해 사회행동의 신경기전을 연구하고 비모델 생물의 신경생물학을 탐구하는 방법을 익히세요.

절제된 자유 비행 꿀 꿀벌의 Neuropharmacological 조작,

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