Name: 공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: 학습하세요 생쥐 원발성 헬퍼 T 세포 분리 및 레트로바이러스 형질도입법을 통해 면역학에서 T 세포 분화와 기능 조절 경로를 연구하는 방법을. 이 기법은 유전자 발현 분석에 효과적입니다.

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이 연구는 BBSRC(Biotechnology and Biological Sciences Research Council) 보조금(BB/H018573/1) 및 BD Biosciences 보조금의 지원을 받았습니다.

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저자는 이 작품의 출판에 상충되는 이해관계가 없습니다.

이들 발전과 기능은 종종 키 조정기의 발현에 의해 결정되는 바와 같이 레트로 바이러스 매개 된 유전자의 과발현은 헬퍼 T 세포의 기능을 분석하기위한 강력한 방법이다. 크게 내인성 유전자들 위에서 발현 여러 이슈를 도입 할 수 있기 때문에, 결과의 해석에주의가 필요하다. 따라서,이 기술은 함수의 관련성을 확인하기 위해 다른 조합한다. 예를 들어, 과발현이 가능한 경우 siRNA를 또는 유전자 녹아웃을 사용하여 단축 된 표현에 의해 보완되어야한다. 의 miRNAs, 우리는 miRNA의 15 경쟁력 억제제 행동 사이트를 대상으로 인공 miRNA의를 과발현 바이러스를 사용하여 차단하는 것과 과발현 실험을 보완. 레트로 바이러스 형질 도입 된 세포는 RNA 및 단백질 분석을 포함하는 생화학 적 분석에 이용 될 수있다. 그러나,이 실험의 주요 제한은 입술 전달 효율은형질 도입 및 untransduced 세포의 혼합 인구 ulting. 따라서 이러한 분석은 가능성이 가장 높은 GFP + 인구의 정렬이 필요합니다. 마지막으로, 체외 분화 분석은 생체 내 실험과 결합하고, 이것이 달성 될 수있는 한 가지 방법은 적응 적 마우스로 형질 도입 된 T 세포의 전사 및 분화 및 면역 반응에 미치는 영향에 따라이다한다. 이 시스템의 주요 한계들 중 하나는 레트로 바이러스 캡시드 내로 패키징 될 수있는 RNA 게놈의 크기이다. 우리의 경험에서, 좋은 바이러스 생산을 제공 MIG의 레트로 바이러스 시스템의 최대 삽입 크기는 3-3.5 KB입니다. 이들은 불량 바이러스 역가를 제공 따라서 큰 유전자는이 시스템을 해석 할 수 없다. 이 시스템의 유전자 연구의 다양한 유용하므로 그러나, 대부분의 유전자가이 크기보다 작다. 레트로 바이러스 전달이 protoco 내에서 여러 가지 대안으로LS가 사용되어왔다. 많은 연구자 안정적 레트로 바이러스 유전자 (예 16 참조) 발현 패키징 세포주를 이용했다. 그러나, 우리는 PCL 에코 헬퍼 바이러스 벡터의 공동 형질 표준의 HEK 293T 세포를 사용하여 최고 역가를 얻었다. 나이브 헬퍼 T 세포의 분리는 자성 비드와 세포 분리 컬럼 프로토콜 대신 정렬 셀을 통해 달성 될 수 있지만, 이는 셀 소터에 대한 액세스를 요구하고, 일종의 시간에 대한 비용은 일반적으로 비드 시약보다 더 높다. 마지막으로, 서로 다른 서브 세트에 헬퍼 T 세포를 구별하는 데 사용되는 작동 조건에 변동이있다. 예를 들어, 너무 오래 세포의 TCR 자극은 TREG 유도 조건에 노출하기 전에 유도 (16)을 억제 할 수 있습니다. 레트로 바이러스 발현 세포의 자극에 의해 유도되는 세포의 분열을 필요로하기 때문에 문제가 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 우리는 O / N의 액티브이 프로토콜을 사용하여 효율적인 TREG 유도를 발견레트로 바이러스 전달하기 전에 ATION. 이러한 프로토콜 내에서 성공적인 응용 프로그램은 몇 가지 요소가 필요합니다. 높은 역가 레트로 바이러스 제제는 중요하다 HEK의 293T 세포 때문에 높은 품질의 DNA와 정확하게 준비 배 HBS의 효율적인 형질 전환이 필요합니다. 형질 감염된 DNA를 잘 발현은 세포가 너무 희박한 또는 조밀 한 경우 세포가 활발히 성장하고,이 억제되도록 요구하기 때문에 또한 HEK 293T 세포의 세포 밀도는 형질의 시점에서 약 50 %가 될 필요가있다. 형질 전환시 최적의 농도에서 세포는 바이러스 수집 단계 동안 어떤 시점에서 합류에 도달해야하지만, 그들은 모든 방법 마지막 컬렉션을 통해 높은 역가의 바이러스 주식을 생산하는 것입니다. 헬퍼 T 세포의 효율적인 분화 세포 좋은 품질이되도록 분리 된 세포는도 1에 도시 된 순도되도록 요구한다. 마찬가지로, 셀의 품질은 쥐 FR에 의존그들은 고립 된 엄마. 이러한 연구를 위해, 우리 6-8 주령 C57BL / 6 마우스를 사용하고 있습니다. 이전 마우스는 덜 순진 세포를 가질 수 있고, 다른 균주는 차별화 다를 수 있습니다. T 세포는 TH2 반응을 유도하기 어려울 수 있으며, 상기 C57BL / 6 바와 같이 예를 들어, BALB / c 마우스 그래서 C57BL / 6 마우스 17보다 TH2 반응에 더 쉽다. 또한, 분화 조건들은 실험실 실험실에서 약간 다를 수 있고, 다양한 편광 상태의 사이토 카인 농도는 적정 될 필요가있을 수 있으므로 유전자 과발현의 효과는 서브 - 최적의 조건에서 명백해질 수있다. 마지막으로, 세포 증식의 과발현 유전자의 영향이나 편광 상태는 관심의 유전자의 측정 이렇게 효과 편광 시약의 타이밍 및 농도를 최적화 필요할 수 전달 효율에 영향을 미칠 수있다. 이러한 모든 요소를 ​​최적화하는 것은이 시스템에 유익한 결과를 가져올 것이다.

면역 반응은 감염을 제거하기 위해 고도로 조절되어야 하지만 자가면역으로 이어지는 자가조직에 대한 공격을 예방해야 합니다. 보조 T 세포는 면역 반응을 조절하는 데 필수적인 역할을 하며, 이들의 발달과 기능을 이해하기 위해 많은 노력이 기울여져 왔습니다(최근의 여러 리뷰 1-3에 설명되어 있음). 그러나 많은 의문이 남아 있으며, 보조 T 세포의 발달과 기능을 제어하는 메커니즘을 연구하기 위해 많은 접근법이 활용되어 왔습니다. 이는 체외 세포 배양 시스템의 사용에서 전체 동물에 이르기까지 다양합니다. 세포 배양 시스템, 특히 세포주를 사용하는 시스템은 사용이 간편하고 정교한 생화학 분석을 수행하기 위해 많은 양의 물질을 생성할 수 있는 기능을 제공합니다. 그러나 그들은 면역 반응에서 발생하는 실제 상태를 재현하는 능력이 제한되어 있습니다. 이와는 대조적으로, 전체 동물 실험은 관련성의 이점을 제공하지만, 큰 비용과 윤리적 함의뿐만 아니라 조작의 어려움과 정확한 통제를 수행할 수 있는 능력으로 어려움을 겪을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 오늘날 대다수의 보조 T 세포 연구는 세포주가 전체 동물에서 발생하는 정확한 단계를 복제할 수 없기 때문에 여전히 1차 T 세포를 포함하는 전체 동물 실험을 필요로 합니다. 따라서 매우 유익한 비용 효율적인 접근 방식을 활용하는 것이 필수적입니다. 
Genetics는 보조 T 세포의 발달과 기능을 연구하는 강력한 도구 중 하나이지만, 유전자 knockout이나 transgenes와 관련된 전통적인 방법은 시간과 비용이 많이 들기 때문에 종종 소규모 실험실의 손이 닿지 않는 곳에 있습니다. 그러나 레트로바이러스 형질도입은 특정 유전자 산물의 메커니즘을 연구하기 위한 강력하고 빠르며 비용 효율적인 유전적 접근 방식을 제공합니다. 따라서 보조 T 세포 발달 및 기능을 연구하는 논문에서 일반적으로 사용됩니다. 
우리는 보조 T 세포의 레트로바이러스 형질주입을 위한 절차를 최적화했습니다. pMIG(Murine stem cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein) 레트로바이러스 발현 벡터를 활용하며, 관심 유전자를 클로닝하여 레트로바이러스 긴 말단 반복(LTR) 4에서 발현할 수 있습니다. 또한, 삽입된 관심 유전자의 다운스트림에는 내부 리보솜 진입 서열(IRES)과 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자가 이어지므로 형질도입된 세포는 GFP의 발현을 쉽게 따를 수 있습니다. 이 벡터는 원래 쥐 줄기 세포 바이러스(MSCV) 벡터에서 유래했으며, 이 벡터는 LTR의 억제 인자 결합 부위에 돌연변이를 포함하여 침묵에 저항하므로 보조 T 세포 5,6를 포함한 많은 세포 유형에서 높은 발현을 제공합니다. 고역가 레트로바이러스를 생산하려면 MIG 벡터와 레트로바이러스 GAG, Pol 및 Env 유전자를 발현하는 도우미 바이러스 벡터를 가진 인간 배아 신장(HEK) 293T 세포의 간단한 일시적 transfection 프로토콜이 필요합니다. 이를 위해 pCL-Eco helper virus vector 7은 고역가 복제, 무능한 레트로바이러스를 생산하는 데 효과적입니다. 
여기에서는 1차 쥐 T 세포의 레트로바이러스 생산 및 형질도입을 위한 이러한 프로토콜에 대해 설명하며, 이 접근법을 사용하여 보조 T 세포 분화를 제어하는 유전자 발현의 miRNA 조절을 연구하는 데 사용한 일부 결과에 대해 설명합니다. miRNA는 약 22개의 뉴클레오티드 길이를 가진 작은 RNA로, 전령 RNA를 암호화하는 단백질에서 상동 염기서열을 표적으로 하고 번역을 억제하고 유도함으로써 전사 후 유전자 발현을 조절합니다. 메시지 불안정 8,9. miRNA는 발달 유전자 조절에 중요한 역할을 합니다. miRNA를 생산할 수 없는 배아는 매우 초기 단계에서 죽기 때문에 발달의 초기 단계에서 필수적입니다 10. 또한 miRNA는 나중에 많은 조직의 발달에서 중요합니다. 그들은 발달 프로그램에 필요한 유전자의 발현을 미세 조정하여 기능하는 것으로 생각됩니다 1. 보조 T 세포에서 miRNA는 여러 역할을 하며 조절 T 세포(Treg) 발달에 필요합니다 11-14. Treg 분화의 miRNA 조절 메커니즘을 해부하기 위한 수단으로 레트로바이러스 형질도입을 사용했습니다 15. 이러한 연구를 통해 중요한 개별 miRNA는 레트로바이러스 매개 과발현에 의해 결정되었습니다. 그 후, 보조 T 세포 분화에서 miRNA에 의해 조절되는 분자 경로를 이해하기 위해 이러한 miRNA에 의해 조절되는 관련 유전자를 확인했습니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신 용액</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MIG 벡터</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 9094</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco 벡터</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 12371</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 비드 마우스 CD4 셀 키트&nbsp;</td><td>Invitrogen (Dynabeads)</td><td>11415D</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin 비드&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-048-102</td><td></td></tr><tr><td>MS 세포 분리 칼</td>럼 <td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>LS 세포 분리 칼</td>럼 <td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD25 Biotenylated MAb&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>85059</td><td>클론 7D4</td></tr><tr><td>CD62L Biotenylated MAb&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>553149 클론 MEL-14</td></tr><tr><td>폴리브레네(헥사디메트린 브로마이드)</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>클론 145-2C11&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD28</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>클론 37.51&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-IL-4</td><td>BD Biosciences</td><td>559062</td><td>클론 11B11</td></tr><tr><td>Anti-IFN-gamma</td><td>BD Biosciences</td><td>559065</td><td>클론 XMG1.2</td></tr><tr><td>Anti-IL-2</td><td>BD Biosciences</td><td>554425</td><td>cloneJES6-5H4</td></tr><tr><td>재조합 IL-12 p70</td><td>eBiosciences</td><td>14-8121</td><td></td></tr><tr><td>재조합 IL-4</td><td>BD Biosciences</td><td>550067</td><td></td></tr><tr><td>재조합 TGF-beta</td><td>eBiosciences</td><td>14-8342-62</td><td></td></tr><tr><td>재조합 IL-6</td><td>eBiosciences</td><td>14-8061</td><td></td></tr><tr><td>재조합 IL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>PMA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>eBiosciences</td><td>00-4506</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>16005</td><td>Paraformaldehyde는 독성이 있으므로 취급 시 적절한 주의를 사용하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>Foxp3 염색 완충액 세트</td><td>eBiosciences</td><td>00-5523</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4&nbsp; FITC</td><td>eBiosciences</td><td>11-0041</td><td>클론 GK1.5&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD8a perCP-cy5.5</td><td>eBiosciences</td><td>45-0081-80</td><td>클론 53-6.7&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-MHCII PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0920</td><td>&nbsp; 클론 HIS19</td></tr><tr><td>Anti-CD25 PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0251-82</td><td>&nbsp; 클론 PC61.5&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD62L PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0621-82</td><td>클론 MEL-14&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD44 APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0441</td><td>클론 IM7&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-IFN-감마 FITC&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>11-7311-81</td><td>클론 XMG1.2</td></tr><tr><td>Anti-IL-4 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554435</td><td>클론 11B11</td></tr><tr><td>Anti-IL-9 PE 또는 APC</td><td>eBiosciences/Biolegend</td><td>50-8091-82/514104</td><td>클론 RM9A4</td></tr><tr><td>Anti-IL-17a PE</td><td>BD Biosciences</td><td>559502</td><td>클론 TC11-18H10</td></tr><tr><td>Anti-Foxp3&nbsp; APC 또는 PE</td><td>eBiosciences</td><td>17-5773-82/12-5773-80&nbsp;</td><td>클론 FJK-16s</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H2O</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>덱스트로오스/포도당</td><td>시그마</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 유리 산</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>시그마</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>디소듐 EDTA</td><td>시그마</td><td>D2900000</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>시그마</td><td>237205</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CaCl2&nbsp;</td><td>시그마</td><td>C5670</td><td></td></tr></tbody></table>

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 t 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

도우미 T세포의 발달과 기능은 특정 병원체를 제거하면서도 자가면역을 막는 적절한 면역 반응을 유도하기 위해 엄격하게 조절되어야 합니다. 보조 T 세포 발달 및 기능을 제어하는 메커니즘을 이해하기 위해 다양한 모델 유기체를 포함하는 많은 접근 방식이 활용되었습니다. 그러나 마우스 모델을 사용한 연구는 유전학, 세포 및 생화학 시스템의 가용성으로 인해 매우 유익한 것으로 입증되었습니다. 많은 실험실에서 사용되는 생쥐의 한 가지 유전적 접근법은 1차 보조 T 세포의 레트로바이러스 형질도입을 포함합니다. 이는 상대적으로 쉽기 때문에 강력한 접근 방식으로, 분자 생물학 및 면역학의 기본 기술을 갖춘 거의 모든 실험실에서 사용할 수 있습니다. 그러므로, 야생형 또는 돌연변이 형태의 여러 유전자는 도움 T 세포의 기능에 대해 쉽게 테스트하여 그 중요성과 작용 메커니즘을 이해할 수 있습니다. 당사는 이 접근법을 최적화했으며, 여기에서 고역가 레트로바이러스의 생산, 1차 쥐 보조 T 세포의 분리, 레트로바이러스에 의한 형질도입 및 다른 보조 하위 집합으로의 분화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 마지막으로, 이 접근법의 사용은 보조 T 세포 발달 및 기능을 제어하는 경로를 조절하기 위해 microRNA(miRNA)가 사용하는 메커니즘을 밝히는 데 설명되어 있습니다.

이 실험 시스템의 성공은 T 세포와 고역가 레트로 바이러스 제제의 고순도 집단을 필요로한다. 대표적인 결과가 성공적인 실험 예로서 여기에 도시되어있다.도 1은도 2. 순진한 헬퍼 T 세포 격리 프로토콜의 각 단계에서 전후 선택된 집단의 전형적인 순도를 보여주고도 3은 GFP 발현을 레트로 바이러스 생산의 분석을 도시 형질 감염된 HEK의 293T 세포 (그림 2)와 형질 도입 T 세포 (그림 3). HEK 293T 세포의 형질 전환 효율은 다른 레트로 바이러스 작 제물에 따라 크게 변할 수 있지만, 이것은 종종 GFP + T 세포의 수를 관찰 레트로 바이러스 생산의 수준과 상관 없다. 또한, GFP + T 세포의 숫자는 편광 상태에 따라 달라질 수있다. 또한, mGFP의 발현 수준 EAN 일체화 바이러스 매수에 따라 달라질 수있는 삽입 유전자의 전사에 통합 사이트 효과 및 바이러스 전 사체에 영향을주는 전사 후 조절 기전. 마지막으로, 그림 4의 miRNAs은 miR-15B는 / (16)가 과발현 때 우리는 헬퍼 T 세포 분화 관찰 한 전형적인 결과를 보여줍니다. 이러한 결과 때문에 진정한 효과 헬퍼 T 세포의 다양한 제제를 사용하여 여러 반복 실험의 통계적 분석에 의해 입증되어야 개별 실험에서 발생할 수있는 변화들을 보여준다. 이 실험에서, TH2 반응은 한 Th1 반응하는 경향이 있기 때문에 여기에 사용 된 C57BL / 6 라인 관찰하기가 어려울 수있다. 유사하게, IL-9 염색 배경 위에서 검출하기 어려울 수있다. 따라서, 아이소 타입 컨트롤을하고 올바른 조지아을 보장하기 위해 적절한 보상을 설정하는 데 필수적이다사이토 카인의 발현 팅. 우리의 결과에서 우리는은 miR-15B / 16 구성 요소 Rictor과 mTOR의 15의 발현을 억제을 통해 신호 전달 경로에서 mTOR를 억제함으로써 iTreg 유도을 향상 것으로 나타났습니다. 미르 15B / 16 때때로 개별 실험 TH0,받은 Th1 및 Th17 분화에 영향을 미칠 수 있지만, 다수의 반복 실험에서 시험 큰 영향은 없다. 반면은 miR-15B / 16 과발현이 크게 TH9 차별화를 (참조 18 참조) 억제 않습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig1.jpg" /> 그림 분리의 각 단계에서 헬퍼 T 세포의 1. 일반적인 순도. 표시된 항원의 결과 세포 계측법 대표 흐름은 앞으로 분산 형 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 플롯에서 지정한 살아있는 세포의 게이트에서 표시됩니다. (A) 사전 및 사후 CD4 음의 선택. CD4의 발현 프로파일,CD8a 및 MHCII이 표시됩니다. 이러한 헬퍼 T 세포의 보충 및 세포 독성 T 세포의 손실 및 MHC 클래스 II 발현 세포를 나타낸다. 좋은 정화는이 단계에서 90 % CD4 + T 세포 ~ 초래한다. (B) CD25를 선택합니다. 왼쪽에서 CD4, CD8a 및 MHCII의 발현 프로파일, 그리고 오른쪽에있는 CD4이며 CD25 발현 사전 및 사후 선택을 프로필. CD25 부정적인 선택한 셀이 점&gt; 95 %에서 CD4 + CD25해야한다 -. (C) CD62L보세요. CD4, CD8a 및 MHCII 발현 프로파일은 왼쪽에 표시됩니다. 오른쪽에 CD62L과 CD44의 발현 양상은 포스트 선택된 셀의 CD4와 CD62L 식 프로필과 함께 사전 및 사후 CD62L 선택된 셀에 표시됩니다. CD62L 선택되면 거의 모든 메모리 셀 (CD44 +)를 10~15% 이펙터 세포 (CD62L 저)를 함유 나이브 헬퍼 T 세포의 고농축 인구 이탈 제거된다. 모든특정 매개 변수에 대한 FACS 프로필, 동등한 설정 및 저울에 걸쳐 유지 하였다. 숫자는 게이트 집단 내 세포의 비율을 나타낸다. 초기 선택 후 세포의 크기에 약간의 감소는 프로토콜 동안 기계적 스트레스에 아마도 때문이다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig2.jpg" /> 도 레트로 바이러스 형질 감염된 HEK 293T 세포에 2. 분석. GFP 발현은 형질 감염되지 않은 또는 형질 감염 및 바이러스 배양 상청액 수집 한 후 분석 하였다 하나의 HEK 293T 세포에 나타낸다. GFP 분석은 첫 번째 패널에서 금융위원회에 게이트와 SSC 플롯에서 살아있는 세포에서 수행되었다. 숫자는 게이트 영역 내의 GFP + 세포의 비율을 나타낸다. 일반적인 transfection 효율이 30~90% 사이의 범위. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig3.jpg" /> 도 레트로 바이러스 형질 헬퍼 T 세포 3. 분석. GFP 발현 TH0,받은 Th1, TH2, TH9, Th17에서 분화 후 레트로 바이러스 형질 도입 헬퍼 T 세포에 도시 한 3 일간 TREG 편광 상태이다. 분석은 FSC / SSC 패널에 표시된 라이브 및 활성화 세포에 문이되었다. 전달 효율은 구조 및 편광 상태에 따라 10~75%에 따라 다를 수 있습니다. 마찬가지로, GFP 발현의 평균 형광 강도는 다릅니다. 수있는 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림은 miR-(15b)의 4 효과 / 다른 편광 상태에서 헬퍼 T 세포 분화에 16 과발현. 대표적인 사이토 카인 프로필이 GFP + 그림 3에서 세포의 인구에 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54698/54698table1.jpg" /> 표 1 :.이 프로토콜에 사용되는 버퍼 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">Excel 스프레드 시트로이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="3"> 돕는 사람T 세포 편광 상태 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> TH0 </td><td> 항 IL-4 </td><td> 5 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td> 안티 IFN-γ </td><td> 5 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> TH1 </td><td> 재조합 IL-12 </td><td> 20 ng를 / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td> 항 IL-4 </td><td> 5 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> TH2 </td><td> 재조합 IL-4 </td><td> 각 40ng / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td> 안티 IFN-γ </td><td> 5 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> TH9 </td><td> 재조합 TGF-β </td><td> 2.5 ng를 / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td> 재조합 IL-4 </td><td> 각 40ng / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td> 안티 IFN-γ </td><td> 10 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th17 </td><td> 재조합 TGF-β </td><td> 2.5 ng를 / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td> 재조합 IL-6 </td><td> 50 ng를 / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td> 안티 IFN-γ </td><td> 5 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td> 항 IL-4 </td><td> 5 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td> 항 IL-2 </td><td> 5 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tregs </td><td> 재조합 TGF-β </td><td> 2.5 ng를 / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td> 재조합 IL-2 </td><td> 5 NG / ㎖ </td></tr></tbody></table> 표 2 : 헬퍼 T 세포 서브 세트의 편광 상태.

많은 실험 시스템은 면역 반응의 T 세포의 발달 및 기능을 조절하는 메카니즘을 이해하는 데에 이용되고있다. 여기 레트로 바이러스 형질 도입을 이용하여 유전 적 접근 경로를 규정하는 식별 경제적 시간 효율적이고, 무엇보다도 매우 유익하다 설명한다.

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 일차 마우스 헬퍼 T 세포를 분리하고, 이를 관심 유전자의 레트로바이러스 발현 컨스트럭트로 형질도입하는 것입니다. 면역 반응에서 T 세포의 발달과 기능을 조절하는 메커니즘을 이해하기 위해 많은 실험 시스템이 활용되어 왔습니다. 본 문서에서는 경제적이고 시간 효율적이며 조절 경로를 식별하는 데 매우 유용한 레트로바이러스 형질도입을 이용한 유전적 접근법에 대해 설명합니다.우리는 유전자 발현의 중요한 조절자인 microRNA의 기능을 분석하기 위해 이 기술을 사용해 왔습니다. 레트로바이러스 형질전환을 통해 개별 microRNA의 기능과 헬퍼 T 세포 분화를 테스트할 수 있었습니다. 공동 연구자인 Oliver Garden이 일차 T 세포 분리를 시연하고, 저는 레트로바이러스 형질전환을 시연하겠습니다.형질전환 24시간 전에, 세포가 가득 찬 플레이트를 10cm 플레이트에 1:10 비율로 분할하여 다음 날 세포 밀도가 약 50%가 되도록 합니다. 형질전환 약 1시간 전에, 세포가 플레이트에서 떨어지는 것을 방지하기 위해 배지를 조심스럽게 제거하고 신선한 HEK293 T 배지 9mL를 천천히 첨가합니다. 6mL 라운드 바텀 튜브 또는 15mL 원뿔형 튜브에 레트로바이러스 DNA 5µg, 헬퍼 바이러스 DNA 5µg을 넣고, 최종 부피가 420µL가 되도록 증류수를 첨가합니다.그 다음, 최종 부피가 500 µL가 되도록 2.5 M 염화칼슘 80 µL를 추가합니다. 그 후, 용액이 계속 섞여 인산칼슘이 균일한 크기의 결정으로 침전될 수 있도록, 부드럽게 볼텍싱하면서 2x HBS 500 µL를 DNA 혼합물에 한 방울씩 천천히 첨가합니다. 이어서, 인산칼슘 DNA 혼합물을 조직 배양 후드로 옮깁니다.플레이트를 지속적이고 부드럽게 회전시키면서 혼합물을 세포에 천천히 첨가한 후, 세포를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 다음 날 바이러스를 수집하려면, 세포가 플레이트에서 떨어지지 않도록 주의하며 배지를 제거하고 10 mL의 신선한 HEK293 T 배지를 공급합니다. 저녁에 신선한 HEK293 T 배지 3.5 mL를 공급하고, 세포를 4 °C에서 12시간 동안 배양합니다.약 12시간 후에 배지를 수집하고, 3.5 milliliters의 신선한 HEK293 T 배지를 세포에 다시 공급합니다. 약 12시간 간격으로 배지 수집을 두 번 더 반복하여, 총 약 10 milliliters의 바이러스 스톡을 수집합니다. 이 과정에서 비장과 림프절을 세포 스트레이너에 넣고, 5 milliliters 주사기 플런저 끝을 사용하여 으깹니다.그 후, R10 배지 1~2 mL로 세척합니다. 그런 다음 세포를 15 mL 원심분리관(conical tube)으로 옮기고 R10을 사용하여 부피를 14 mL로 맞춥니다. 4 °C에서 600 ×g로 5분 동안 세포를 원심분리합니다.그 후, 세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 한 번의 깔끔한 동작으로 상층액을 따라내어 제거합니다. 다음으로, 세포에 2 mL의 차가운 적혈구 용해 버퍼를 첨가합니다. 혼합한 후, 지속적으로 부드럽게 섞어주며 세포를 얼음 위에 3.5분 동안 둡니다.그 후, R10 배지 12 milliliters를 첨가하고 즉시 4 °C에서 600 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다. 세포에서 잔류 적혈구 용해 버퍼를 제거하고 림프구의 사멸을 방지하기 위해 R10 배지로 세척 단계를 두 번 더 수행합니다. 이 단계에서 원추형 튜브당 8~10 × 10⁷ cells를 분주하고, 4 °C에서 600 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다.세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 한 번의 깔끔한 동작으로 상층액을 따라냅니다. 그런 다음, 100 µL의 열 불활성화 FBS를 넣어 세포를 재부유시킵니다. 다음으로, 세포에 100 µL의 항체 믹스를 첨가하고, 롤러에서 부드럽게 혼합하며 4 °C에서 30분 동안 배양합니다.그 후, 비드-containing vial을 30초 이상 볼텍싱하여 비드를 재현탁합니다. 그런 다음 비드를 15mL 원심분리관(conical tube)으로 옮기고, 비드 1mL당 2mL의 R10 배지를 추가합니다. 튜브를 자석기에 1분 동안 둡니다.그런 다음 상층액을 제거하고, 비드를 4 mL의 R10 배지에 다시 부유시킵니다. 항체 배양 단계가 끝난 후, 튜브당 10 mL의 R10 배지를 넣어 세포를 세척하고, 4 °C에서 600 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿이 흐트러지지 않도록 한 번의 깔끔한 동작으로 상층액을 따라내고, 세포를 1 mL의 R10 배지에 다시 부유시킵니다.그런 다음, 세척한 비즈 2 milliliters를 항체 처리된 세포가 들어 있는 튜브에 넣고 롤러에서 부드럽게 혼합하며 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 이후, 피펫팅을 다섯 번 부드럽게 하여 세포-비즈 혼합물을 다시 현탁시킨 후, 튜브를 비즈 마그넷에 2분 동안 둡니다. 음성 선택된 세포가 포함된 상층액을 새 튜브로 옮기고, 음성 선택 과정을 한 번 더 반복합니다.이 절차에서는 CD4 양성 T 세포를 4 °C에서 600 ×g로 5분간 원심 분리한 후, 세포 10⁸개당 150~200 µL의 R10 배지에 다시 현탁합니다. 다음으로, 세포에 비오틴화된 CD25 단일클론 항체 스톡 2 µL를 첨가하고, 롤러 위에서 부드럽게 혼합하며 4 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 세포 분리 컬럼 버퍼 10 mL를 첨가하여 세포를 세척하고, 4 °C에서 600 ×g로 5분간 원심 분리합니다.그런 다음, 상층액을 가능한 한 많이 제거하고, 세포 10⁷개당 최종 부피가 약 90 µL가 되도록 세포를 재현탁합니다. 이어서 세포 10⁷개당 20 µL의 streptavidin bead를 추가하고 가볍게 튕겨 섞어줍니다. 그 후 4 °C에서 15분 동안 배양합니다.세포를 배양하는 동안 MS 컬럼을 준비합니다. 배양이 끝나면, 10 mL의 세포 분리 컬럼 완충액을 첨가하고 4 °C에서 600 ×g로 5분 동안 원심분리하여 세포를 세척합니다. 세포 $10^8$개당 500 µL의 세포 분리 컬럼 완충액으로 세포를 재현탁합니다.그 후, 500 µL의 세포 현탁액을 컬럼에 적용하고 통과액을 수집합니다. 이를 컬럼에 한 번 더 통과시키고 통과액을 다시 수집합니다. 그런 다음, 500 µL의 세포 분리 컬럼 완충액으로 컬럼을 3회 세척하고, 각 통과액을 수집된 CD25 음성 세포에 추가합니다.앞서 언급한 대로 세척, 스트렙타비딘 비드 결합 및 세포 분리 컬럼 준비를 수행하되, LS 컬럼을 사용하십시오. 이번에는 통과액을 버리고 제공된 플런저를 사용하여 컬럼에서 세포를 씻어내십시오. 나이브 T 세포를 분리하는 동안, DPBS에 희석된 anti CD3 및 anti CD28 항체로 24 웰 조직 배양 플레이트를 코팅하고 37 °C에서 2시간 동안 배양하십시오.세포를 배양하기 직전에, 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 웰당 250 µL의 DPBS로 플레이트를 세척합니다. 그런 다음, DPBS를 제거하고 R10 배지에 든 naive CD4 positive T 세포 1 mL를 첨가하여 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 세포를 30 °C에서 900 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.그런 다음 배지를 수집하고, 바이러스 생산 프로토콜에 따라 준비한 바이러스 배양 상청액 1 milliliter를 첨가합니다. 이어서 바이러스 흡수를 돕기 위해 8 mg/mL polybrene 1 microliter와 1 M hepes 10 microliters를 첨가한 후, 세포를 30 °C에서 900 ×g로 90분 동안 원심분리합니다. 세포를 분화시키기 위해 바이러스 배양 상청액을 조심스럽게 제거하고, IL2 및 기타 T 세포 성장 인자가 포함된 이전에 수집한 배지 1 milliliter를 첨가합니다.그런 다음 동반된 논문의 표 2에 명시된 시약들을 첨가하고, 세포를 3~4일 동안 배양하여 특정 하위 집단으로 분화시킵니다. 이 그림은 나이브 헬퍼 T 세포 분리 프로토콜의 각 단계에서 선택 전후 집단의 전형적인 순도를 보여줍니다. CD4, CD8A, MHC II, CD25, CD62L 및 CD44의 발현 프로파일은 MHC Class 2 세포와 더불어 세포독성, 조절 및 기억 T 세포의 소실을 나타냅니다.그 결과 95% 이상의 CD4 양성 T 세포 집단이 형성되며, 이 중 약 85%에서 90%는 naive 세포이고 나머지 10%에서 15%는 effector 세포입니다. 이 그림에서는 transfection을 하지 않았거나 수행한 HEC293 T 세포에서 GFP 발현을 보여주며, 이는 바이러스 배양 상청액을 수집한 후 분석되었습니다. GFP 분석은 FSE 및 SSE 플롯의 게이트 내에 있는 생존 세포를 대상으로 수행되었습니다.일반적인 형질전환 효율은 30%에서 90% 사이입니다. 여기서는 Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 및 T reg 분화 조건에서 3일간 배양한 후 레트로바이러스로 형질도입된 헬퍼 T 세포의 GFP 발현을 보여줍니다. 형질도입 효율은 구성물과 분화 조건에 따라 10%에서 75%까지 다양합니다. 다음은 다양한 분화 조건에서의 헬퍼 T 세포 분화에 따른 대표적인 사이토카인 프로파일입니다.이러한 기술들을 숙달하면 유전자 기능과 헬퍼 T 세포의 발달 및 기능을 분석하는 강력한 방법이 될 수 있습니다. 다만, 유의미한 결과는 세포와 시약의 품질에 달려 있다는 점을 기억하십시오. 따라서 형질도입 프로토콜과 헬퍼 T 세포의 분리 및 분화 과정을 최적화하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을...

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

의 생성에 대한 신속, 간단하고 비용 효율적인 프로토콜 기증자 파생 CMV, EBV 감염 또는 교수실을 개발하는 위험 allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 수신자에게 주입을위한 multivirus 특정 CTLs (rCTL을). 이 제조 과정은 GMP 준수하고 전문 센터 이외 T - 세포 immunotherapy의 광범위한 구현을 보장한다.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

순진 CD4 콕 사키 아데노 바이러스 수용체의 유전자 발현과 T 세포에 아데노 바이러스 유전자 전달은 규제 T 세포 분화의 분자 분석을...

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

이 프로토콜은 HIV 감염에 대한 줄기 세포 기반 엔지니어링 면역을 가진 인간화 된 골수/간/흉선 마우스 모델을 구성하는 방법을 설명합니다.

인간화 된 마우스 모델에 HIV 감염에 대 한 줄기 세포를 기반으로 설계된 내성

우리는 단일 T 세포 수용체(TCR) 레트로바이러스 기반 생체 내 발현 시스템을 위한 빠르고 유연한 프로토콜을 제시합니다.  레트로바이러스 벡터는 골수 전구 세포를 transduction하여 TCR 형질전환 마우스의 대안으로 in vivo에서 단일 TCR의 T 세포 발달 및 기능을 연구하는 데 사용됩니다.

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

여기, 우리는 인간 세포에서 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 기반의 레트로 바이러스 벡터의 통합 사이트의 게놈 전체 매핑을위한 프로토콜을 설명합니다.

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우리는 세포 효능의 주입 연구를 위한 충분한 수에 있는 관심 있는 유전자의 우수한 공동 발현을 가진 세포를 산출하는 rhesus macaque 말초 혈액 단핵 세포의 transduction 그리고 확장을 위한 9 일 프로토콜을 개략적으로 설명합니다.

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이 프로토콜은 추가 기능 분석을 위해 델타와 같은 4-발현 골수 기질 세포주 공동 배양 시스템(OP9-DL4)에서 레트로바이러스 형질도입 및 공동 배양에 이어 마우스 흉선에서 이중 음성 흉선 세포를 분리하는 것을 설명합니다.

T 세포 백혈병에서 종양 유전자를 연구하기 위해 델타와 같은 4-발현 간질 세포에서 쥐 흉선세포의 공동 배양 및 형질도입

현재 연구는 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신을 평가하고 이러한 세포에서 유전자 발현을 조작하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근

Cas9 형질전환 마우스의 일차 T 세포로 가이드 RNA를 레트로바이러스 형질전환하기 위한 프로토콜을 제시하여 Th17 분화 연구에서 유전자 편집을 위한 효율적인 대안을 제공합니다.

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

우리는 수용체 매개 장기 및 미세환경 특이적 림프구 위치를 연구하기 위해 트래픽 수용체의 레트로바이러스 전달과 경쟁적 귀환을 위한 개선된 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 면역 세포 이동 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하며 향후 기초 및 치료 연구에 잠재적으로 응용될 수 있습니다.

다양한 조직 미세환경에서 GPCR 매개 T 세포 국소화 연구를 위한 효율적인 레트로바이러스 형질도입 및 경쟁력 있는 호밍(Competitive Homing)

학습하세요 생쥐 원발성 헬퍼 T 세포 분리 및 레트로바이러스 형질도입법을 통해 면역학에서 T 세포 분화와 기능 조절 경로를 연구하는 방법을. 이 기법은 유전자 발현 분석에 효과적입니다.

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

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