그룹 B의 쥐 모델 연쇄상 구균 질 식민

이 동물 모델의 전반적인 목표는 그룹 B 연쇄상 구균 또는 쥐 질관의 GBS 집락화를 확립하는 것입니다. 이 방법은 군집 형성에 중요한 박테리아 요인이 무엇인지, 숙주 반응이 질 지속에 어떤 영향을 미치는지와 같은 그룹 B 연쇄상 구균 집락화에 대한 주요 질문을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 일반적으로 마취제, 면역억제제 또는 증점제를 사용하지 않고도 접종이 90% 이상 집락화

15ml 원뿔형 튜브에 쥐당 0.5mg의 베타-에스트라디올을 모든 덩어리가 제거되고 베타-에스트라디올이 미세한 분말로 나타날 때까지 와류로 가열하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 주사기로 마우스당 100마이크로리터의 참기름을 0.45미크론 여과기를 통해 튜브에 여과하고 튜브를 다시 와류로 가열합니다. 호르몬이 오일 전체에 균일한 현탁액으로 분포되면 시약을 새로운 10밀리리터 주사기로 끌어당기고 18게이지, 1인치 바늘을 부착합니다.

100마이크로리터의 현탁액을 마우스 한 마리당 1밀리리터 투베르쿨린 주사기 1개로 나누고, 각 투베르큘린 주사기에 멸균된 26게이지, 1/2인치 바늘을 장착합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 베타-에스트라디올을 각 동물의 복막강의 왼쪽 또는 오른쪽 하단 사분면에 전달합니다. 주사와 같은 날, 섭씨 37도에서 Todd Hewitt 육수 또는 THB에 관심 GBS 균주의 5ml 하룻밤 동안 액체 배양을 배양합니다.

다음날 아침, 박테리아가 중간 로그 단계에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 2-3시간 동안 신선한 THB에서 GBS를 1-10 부피로 계소 배양합니다. 그런 다음 하위 배양을 멸균된 15ml 원추형 튜브로 옮기고 박테리아 세포를 원심분리합니다. 펠릿을 200마이크로리터의 멸균 PBS에 재현탁합니다.

그런 다음 현탁액의 총 부피를 10 마우스당 최대 1ml의 PBS로 가져와 새로운 5ml 배양 튜브에서 0.4의 OD600에 도달합니다. 배양물을 새로운 15ml 튜브로 옮기고 박테리아를 다시 펠릿화합니다. 그런 다음 PBS의 세포를 원래 부피의 1/10로 재현탁합니다.

THB 한천에 연속 희석 및 도금을 위해 박테리아 50 마이크로 리터를 예약하여 접종물의 정확한 CFU를 결정합니다. 그런 다음 10마이크로리터의 GBS를 200마이크로리터 젤 로딩 피펫 팁에 넣고 첫 번째 동물의 목 목덜미에서 엄지와 검지 사이에 느슨한 피부를 수동으로 고정한 다음 꼬리를 고정합니다. 피펫 팁을 질 내강에 5-10mm 삽입하고 접종물의 전체 부피를 분배합니다.

그런 다음 즉시 목덜미를 풀고 꼬리를 들어 올려 동물의 뒷쪽 끝을 들어 올리고 앞발로 단단한 표면을 걷습니다. 1분 후, 질 입구에 접종물 역류가 있는지 육안으로 검사합니다. 면봉 직전에 PBS에 면화를 미리 적시고 방금 시연한 것처럼 쥐 중 하나를 제지합니다.

면봉을 질 내강에 10mm 삽입하고 질벽에 약간의 압력을 가하면서 시계 방향으로 4회, 시계 반대 방향으로 4회 부드럽게 회전합니다. 1.5마이크로리터의 PBS가 들어 있는 100밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 면봉을 넣고 튜브와 면봉을 약 15초 동안 소용돌이쳐 면 섬유에서 박테리아를 방출합니다. 그런 다음, PBS에서 각 샘플을 연속적으로 희석하고, 24 시간 동안 섭씨 37도에서 배양을 위해 제조업체의 지침에 따라 제조 된 차동 매체 한천 플레이트에 1-10, 000 희석액의 20 마이크로 리터를 플레이트합니다.

GBS 군체는 밝은 분홍색 또는 연보라색으로 나타납니다. 질 세척액을 채취하려면 200마이크로리터 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 20마이크로리터의 PBS를 질 내강으로 분배합니다. 루멘 내에서 전체 볼륨을 위아래로 네 번 부드럽게 피펫팅합니다.

그런 다음 동일한 팁을 사용하여 전체 볼륨을 인출합니다. 다운스트림 세척 유체 분석을 위해 세척액을 0.7ml 마이크로 원심분리기 튜브에 분배합니다. 조직 해부 균질화를 위해 안락사된 동물의 복부에 70% 에탄올을 뿌리고 멸균 가위를 사용하여 복부 골반강을 엽니다.

생식관이 노출되도록 장을 변위시킵니다. 그런 다음 자궁체와 난소 사이의 양쪽 자궁 뿔을 중간 길이로 자른다. 가위와 집게를 사용하여 내장 지방, 막 및 방광을 생식관에서 분리하여 조직을 꼬리 쪽으로 움직입니다.

그런 다음 질을 외음부에 최대한 가깝게 가로로 잘라 생식관을 신체에서 분리합니다. 재치 있는 생식관을 멸균된 페트리 접시에 옮기고 새 면도날을 사용하여 자궁과 자궁경부를 한 번의 가로 절단으로 분리합니다. 자궁경부를 질에서 다른 가로 절개로 분리하십시오.

그런 다음 멸균 겸자를 사용하여 각 조직을 500마이크로리터의 PBS와 균질화 비드가 들어 있는 미리 계량된 개별 2밀리리터 튜브로 옮깁니다. 조직 무게를 결정하기 위해 각 2밀리리터 튜브의 무게를 측정합니다. 그런 다음 나사 캡 튜브를 단단히 밀봉하고 조직 균질화기에서 최대 속도로 1분 동안 조직을 균질화합니다.

박테리아 부하를 정량화하려면 25 마이크로 리터의 조직 균질액을 연속적으로 희석하고 섭씨 37도에서 24 시간 배양을 위해 차동 매체 한천 플레이트에서 1-10, 000 희석을 플레이트에 도금합니다. 시토카인 정량화를 위해 시료를 보관하려면 균질액을 섭씨 영하 20도에서 동결합니다. 이 이미지에서는 습식 산 질 세척액에 의해 결정되는 마우스 발정 주기의 4단계가 시연됩니다.

발정기에 접종된 마우스는 다른 발정기보다 더 오래 GBS에 집락화되었으며, 특히 접종 당시 발정기에 있는 마우스는 더욱 그랬습니다. 지속적인 발정은 CD-1 마우스에서 GBS A909 지속성을 촉진하며, 접종 2주 후 90%의 집락화가 관찰되었습니다. 접종 전에 베타 에스트라디올을 1회 투여한 일반적인 실험에서, 접종 일주일 후 쥐의 40-50%만이 집락화되었으며, 평균 GBS는 집락화 비율을 모방하여 회복되었습니다.

지속적인 발정을 유지하는 것이 대다수의 CD-1 마우스에서 GBS 질 지속성을 촉진한다는 것을 입증합니다. GBS A909는 근친 교배 CD-1 마우스와 근친 FVB 마우스의 질관에서 약 1주일 동안 지속됩니다. 근친 BALB/c 및 C57BL/6 마우스의 대다수는 한 달 이상 1주일에 집락화됩니다.

접종된 동물에서 GFP 양성 GBS의 시각화는 GBS가 쥐 질 상피에 부착되어 있고 다른 토착 질 세균총과 매우 근접해 있음을 보여줍니다. 접종 중 역류를 방지하여 모든 마우스가 집락화되도록 하는 것이 중요합니다. 이 기술을 숙달하면 동물의 수에 따라 1-2시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 모델을 통해 숙주/병원체 상호 작용 분야의 연구자들은 B군 연쇄상구균과 같은 박테리아가 여성의 생식관에 군집화할 수 있는 능력을 탐구할 수 있습니다. 이 절차는 치료 개입에 대한 추가 질문에 답하기 위해 새로운 화합물 또는 프로바이오틱스 치료법을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.