Name: 그룹 B의 쥐 모델 연쇄상 구균 질 식민 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 학습하세요 쥐 질 식민 모델을 통해 그룹 B 연쇄상 구균(GBS)의 면역 반응과 세균 인자를 연구하는 방법을. 이 기술은 마취 없이 90% 이상의 식민율을 달성하여 치료 전략 테스트에 유용합니다.

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축산을 지원해 주신 샌디에이고 주립 대학의 사육장 관리자와 직원에게 감사드립니다. 이 과정에서 K.A.P.는 ARCS 장학금과 이나모리 재단의 펠로우십의 지원을 받았습니다. K.S.D.는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 R01 보조금(NS051247)으로 지원됩니다.

모든 동물의 작업은 샌디에고 주립 대학의 실험실 동물 관리 사무소의 승인을 받아 수의학 기준에 따라 실시 하였다. 암컷 마우스 연령 8-16주이 방법의 개발에 사용 하였다. β-에스트라 디올의 1. 준비 및 복강 내 주사 <ol><li> 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하고있는 동안 종이의 무게에 β-에스트라 디올 (0.5 밀리그램 / 마우스)를 밖으로 측정한다. 주의 :-β 에스트라 디올은 피부 및 점막 표면을 통해 흡수 될 수있다. </li><li> 모든 덩어리를 제거하고, β-에스트라 디올이 미세 분말 될 때까지 15 ML 원뿔 튜브와 소용돌이에 β-에스트라 디올을 전송합니다. 10 ML의 주사기에 참기름 (100 μL / 마우스)를 그립니다. 0.45 μm의 필터를 사용하여 β-에스트라 디올을 함유하는 15 ml의 원추형 튜브에 주사기 필터 참기름. β-에스트라 디올은 참기름에 균일 한 현탁액이 될 때까지 15 ML 원뿔 튜브를 소용돌이. </li><li> β-ES를 그리기새로운 10 ML의 주사기에 tradiol 서스펜션. 18 G, 1 인으로. 바늘, 나누어지는 1 ㎖의 투베르쿨린 주사기로 현탁액을 100 ㎕. 각 마우스에 대해 하나의 주사기를 준비합니다. 새로운 멸균 26 G, ½ 인을 배치합니다. 각 투베르쿨린 주사기 바늘. </li><li> 이전 세균 접종에 각 마우스 24 시간에 참기름 (5 ㎎ / ㎖) 100 ㎕에 현탁 β-에스트라 디올의 0.5 밀리그램을 관리 할 수 ​​있습니다. 바로 오른쪽에 하복부 사분면에서는 복강 내의 각 마우스를 주입하거나 이전 28 바와 같이, 중간 선 왼쪽. 주 : 주사 부위의 어떠한 청소 또는 클리핑이 필요하지 않습니다. </li></ol> GBS 2. 질 접종 <ol><li> 어느 날 이전에 접종을, 37 ° C에서 토드 휴이트 국물 (THB)에서, 같은 A909 (혈청 형 IA)와 같은 관심의 GBS 균주의 5 ml의 하룻밤 액체 문화를 성장. </li><li> 신선한 THB로 1:10 볼륨에서 GBS 하룻밤 문화를 배양하고 37 ° C에서 품어. 성장미드 로그 상에 박테리아 (= 0.4-0.5 OD 600). 참고 : - GBS의 변형에 따라, 3 시간이 보통이 소요됩니다. </li><li> 5 분 동안 3,000 × g에서 멸균 15 ML 원뿔 튜브와 펠렛 박테리아에 하위 문화를 전송합니다. 뜨는을 대기음. 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 200 μL의 세균 펠렛을 재현 탁. </li><li> 새로운 5 ㎖의 배양 관에서 PBS 5 ㎖ (10 마우스 당 1 mL) 중 정확히 OD 600 = 0.4 - 재현 탁 된 펠릿을 이용하여, 3을 가져온다. 이것은 ~ 1 × 10 8 콜로니 형성 단위 (CFU) / ml의 농도 될 것입니다. 새로운 15 ML 원뿔 튜브로 전송 5 분 동안 3,000 × g에서 박테리아를 재 - 펠렛. 뜨는을 대기음. </li><li> 1/10 원래 볼륨에서 PBS의 펠렛을 재현 탁. 예를 들어, OD = 0.4 (600)의 3 ml의 펠릿 되었다면, PBS 300 μL 그것을 재현 탁. 주 :이 동물 접종에 사용되는 최종 세균 현탁액 (~ 1 × 109 CFU / ㎖)이다. </li><li> 아르 자형직렬 희석 현탁액의 50 μl를 eserve과 THB 한천에 도금하는 것은 정확한 접종을 결정합니다. </li><li> 그 1 × 107 CFU 각 마우스에 투여되도록 최종 세균 현탁액의 10 μl를 각 마우스를 접종한다. <ol><li> , 이전에 접종 28 바와 같이, 핸들러의 엄지와 검지 후 꼬리를 고정화 사이 목 목덜미에서 느슨한 피부를 보호하여 수동으로 마우스를 억제. </li><li> 200 ㎕를 겔로드 피펫 팁으로 단계 2.6에서 제조 된 GBS의 10 μL를 그립니다. 팁을 질 루멘에 5 ~ 10 mm를 삽입하고 접종의 10 μl를 분배. 주 : 겔 로딩 팁 특히 어린이나 작은 마우스에서 장기 외상 또는 손상의 위험을 최소화하기 위해 표준 200 μL 팁 위에 바람직하다. </li><li> 즉시 접종을 다음과 같은 꼬리와 w로 마우스를 올려, 목의 목덜미를 해제하고 마우스의 뒷다리 끝을 상승~ 1 분 동안 딱딱한 표면에 전면 발 alking. </li><li> 시각 접종의 역류에 대한 질 입구를 검사합니다. 역류가 관찰되는 경우, 새로운 피펫 팁은 루멘 내로 역류의 흡수를 용이하게 조작하거나 질구를 확대하기 위해 사용될 수있다. 또한, 역류는 피펫을 통해 흡입 될 수 있으며, 재 접종. 참고 : 국소 에이전트, 프로 바이오 틱 미생물, 또는 관심의 단백질을 투여하는 경우에는 생리적 버퍼 20 μl의 최대 볼륨은 질 기관에 제공 될 수있다. </li></ol></li></ol> 3. GBS 부하를 정량화하기 위해 질 루멘을 보라고 <ol><li> PBS 100 ㎕를 첨가하여, 마우스 당 1.5 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브를 준비한다. 그냥 보라고하기 전에, PBS에서 면봉을 사전에 젖은. </li><li> 단계 2.7.1에서 설명한대로 마우스를 억제하고 질 루멘에 면봉을 10mm를 삽입합니다. 부드럽게 4 배를 시계 방향으로 면봉을 회전하고 4 시간은 질 벽에 약간의 압력을 적용, 시계 방향으로 대응.</li><li> PBS 100 ㎕로 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 면봉을 전송합니다. 도금에 앞서, 소용돌이 면봉에서 박테리아를 해제하기 15 초 ~에 대한 microcentrifuge 관. 직렬 1시 10분 1을 통해 각 PBS에서 샘플 판 희석 20 μl를 희석 : 10,000 제조업체의 지침에 따라 준비 차동 매체 아가 플레이트에. 24 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어. GBS 식민지 색상에 밝은 분홍색 또는 자주색를 나타납니다. 다른 내생 식물을 억제 할 것, 또는 파란색, 흰색, 회색 식민지로 표시됩니다. </li></ol> 4. 수집 질 세척 유체 <ol><li> 단계 2.7.1에서 설명한대로 마우스를 억제. 200 ㎕를 겔로드 피펫 팁, 피펫 질 루멘에 PBS의 20 μl를 사용. 부드럽게 루멘 내에서 전체 볼륨 위아래로 4 회 피펫, 다음 같은 피펫 팁의 전체 볼륨을 철회. 주 : 세척액이 점액 두꺼운 경우 표준 200 μL 피펫 팁최종 세정액을 수집하는데 사용될 수있다. </li><li> 사이토킨 분석 CFU 또는 정량 용 세정액을 저장하는 경우에 0.7 ml의 마이크로 원심 관에 분주. 발정기의 단계를 결정하는 경우, 유리 슬라이드 상에 세정액의 적어도 5 μL를 분배하고 광학 현미경에서 100 배의 배율 하에서 세포를 관찰한다. 참고 : 발정 단계의 예를 들어, 그림 1을 참조하십시오. </li></ol> 5. 조직의 해부 및 균질화 <ol><li> 각 마우스의 경우, 세 개의 2-ML 스크류 캡 튜브 (: 질, 자궁 경부, 자궁 각 조직에 대해 하나)을 준비합니다. 튜브의 원뿔 모양의 바닥을 커버 - (0.5 g 0.4) 1.0 mm 지르코니아 비드 충분한 각 튜브를 입력합니다. </li><li> 세균 부하를 정량화 특히 121 ° C에서 30 분 동안 조직을 수집하기 전에 준비된 튜브 압력솥. 각 튜브에 멸균 PBS 500 μl를 추가합니다. 복구 조직의 무게를 계산하기 위해 나중에 참조 할 수 있도록 고압 증기 멸균 기록 후 각 튜브의 무게. </li><li&gt; 이러한 CO 2 질식 및 경추 탈구으로 승인 기관 방법을 사용하여 마우스를 희생한다. 70 % EtOH로 복부 복부를 스프레이. 멸균 가위,의 복부 캐비티를 열고 다시 피부와 복부 근육을 들어 올린 생식 기관이 노출되도록 내장을 대체. </li><li> 70 % EtOH로 가위를 소독 필요한 경우 깨끗이 닦아, 두 자궁 뿔 자궁 몸과 난소 사이의 중간 길이를 잘라. 가위와 집게, 별도의 내장 지방, 멤브레인, 멀리 생식 기관에서 방광을 사용하여, 꼬리 쪽 이동. </li><li> 단계 5.4에 설명 된대로 가위를 소독. 횡 방향으로 몸에서 생식 기관을 분리 가능한 외음부에 가깝게 질을 잘라. 들어 올려 그대로 생식 기관을 제거하고 멸균 페트리 접시에 넣습니다. </li><li> 새 면도날을 사용하여, 하나의 가로 절단에 자궁 경부에서 자궁을 분리합니다. 70 %로 면도날 소독다음의 EtOH, 그리고 하나의 가로 컷의 질에서 자궁 경부를 구분합니다. 참고 : 아직 자궁 경부에 연결된 자궁 조직의 최소한있을 것이다. 아직 자궁 경부에 부착 된 질 조직의 최소한있을 것이다. </li><li> 무균 핀셋을 사용하여, 각각의 2 ㎖의 튜브를 함유하는 PBS와 구슬 균질화로 각 조직 옮긴다. 각 조직을 처리하는 사이에 70 % EtOH로 집게를 청소합니다. </li><li> 각각 2 ㎖의 스크류 캡 튜브의 무게를 측정하고, 조직의 무게를 결정하기 위해 관의 원래 중량을 뺀다. 100 mg의 - 조직의 무게는 일반적으로 20 사이를 다릅니다. 단단히 스크류 캡 튜브를 밀봉하고 조직 균질 기에서 최대 속도에서 1 분 동안 조직을 균질화. </li><li> 10,000 차동 매체 아가 플레이트에 : 세균 부하를 정량화하기 위해 직렬로 조직 균질 및 플레이트 희석 1시 10분 1을 통해 25 μl를 희석. 단계 3.3에 설명 된대로 번호판을 품어. 에서 조직 균질 동결, 사이토 카인의 정량 샘플을 저장하려면 -20 ° C. </li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

호스트의 컨텍스트 내의 호스트 및 다른 미생물 모두 GBS 상호 작용의 이해의 발전을 촉진하기 위해 동물 모델이 요구된다. 이 작품은 생쥐에서 GBS 질 식민지를 확립의 기술적 측면에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 박테리아를 접종하거나 접종을 두껍게, 질 미리 세척, 또는 첨가제 식민지 수 있도록 면봉 샘플, 면역 억제제를 수집하기 위해 마취제를 사용하지 않고 마우스의&gt; 90 % 식민지를 달성한다. 또한,이 모델은 GBS 지속성의 길이와 세균 부담이 모두 겸손 간 실험적인 변화와 강력한 재현성을 보여줍니다. 이 연구에서 입증 대표 결과는 독립적 인 실험의 컴파일하고 미래의 실험 설계에 대한 참조해야한다; 그러나 GBS 균주 및 마우스 선에 걸쳐 직접 비교주의해야한다. 이 모델은 인간의 colonizati을 모방쥐의 점막 질 GBS의 식민지에서의 생식 기관에 제한 될 것으로 보인다. 자궁 경부와 자궁에 승천 여러 GBS 25 균주 관찰되었지만, 마우스...

연쇄상 구균 agalactiae, B 군 연쇄상 구균 (GBS)는 자주 장과 건강한 성인의 비뇨 기관에서 분리 된 캡슐, 그람 양성 세균이다. 1970 년대에, GBS는 매년 신생아 질환의 7,000의 경우 1, 감염성 신생아 사망의 주요 에이전트로 나타났다. 조기 발병 GBS 질환 (EOD)는 폐렴이나 호흡 곤란으로 발생하는 첫 번째 시간, 삶의 일에 발생하고, 종종 후기 발병 질환 (LOD) 반면, 패혈증으로 발전 몇 달 후에 계속된다 자주 균혈증과 선물 2 뇌막염으로 진행한다. 2002 년 질병 통제 예방 센터 (CDC)는 GBS 양성 산모 1 늦은 임신과 분만 예방 적 항생제 (IAP)에서 GBS 질 식민지에 대한 보편적 인 검사를 권장합니다. 매년 IAP로 인해 미국에서 약 1,000가지 경우에 조기 발병 질환의 감소에도 불구하고,GBS는 조기 발병 신생아 패혈증의 주요 원인 남아 있고, 후기 발병 발생 1 영향을받지 남아있다. 자궁의 여부, 노동 동안, 또는 후기 발병의 경우, GBS에 신생아 노출 수막염, 높은 규제 혈액 -의 교차의 경우, 호스트 환경과 장벽, 면역 회피의 숫자를 통해 생존, 횡단이 필요하며, 뇌 장벽이. 신생아 내에서 이러한 악성 상호 작용의 상류는 산모의 질 기관의 초기 식민지입니다. GBS 질 식민지 비율이 12.7 %, 4의 추정 평균 속도, 선진국과 개발 도상국에서 8-18% 범위 임산부. 임신 중 질 기관의 GBS의 식민지 개별 여성 5 중 자연, 상수 간헐적 또는 일시적 일 수있다. 흥미롭게도, 모성 연령&gt; 삼십육년은 지속적 식민지 (6)와 연결되어 있습니다. GBS 질 식민지에 대한 다양한 생물학적 및 사회 경제적 위험 요인확인되었습니다. 생물학적 요인 위장 GBS의 식민지와 장 내 유산균의 부재를 포함한다. 그러나, 인종, 비만, 위생, 성적 활동은 GBS 질 캐리지 (7)과 관련되어있다. 신생아 감염을 일으키는 악명이 있지만, GBS는 산모의 감염 모두 주 산기 및 산후의 다양한됩니다. GBS 캐리지도 질병 엔티티 9 일 수 있고, 어떤 경우에는 질염 8 제시 여성에서 증가된다. 또한, 임신 중 생식 기관의 GBS 적경은 내 양수 감염이나 융 모양 막염 (10)가 발생할 수 있습니다. 또한, 임신의 3.5 %까지로, GBS는 요로 감염이나 무증상 세균 (11)을 유발하는 방광에 배포한다. 임신 중 GBS의 세균이 분만 발열, 융 모양 막염, 조산 및 prematur의 위험 증가와 관련이막 (12)의 전자 파열. 함께 찍은, 질 기관 내에서 GBS의 존재는 여러 호스트 조직의 감염에 연결하고,이 틈새 시장에서 GBS를 제거 할 수있는 기능을 모두 산모와 신생아의 건강을 위해 필수적이다. 최근까지 자궁 경부 기관과 상호 작용 GBS 검사 작업의 대부분은 체외 세포 모델 13-15로 한정 하였다. 이러한 시험 관내 실험은 표면 단백질을 포함한 부착에 중요한 요인 세균을 밝혀냈다 같은 필리 세린 풍부 반복 (17, 18),뿐만 아니라 이성 조절 시스템 (15, 19)과의 질 상피 글로벌 전사 반응 GBS 19. 그러나, 완전히 질 관 내의 호스트 미생물 작용을 해명하기 위해 강력한 동물 모델이 필요하다. 초기 작품은 GBS가 접종 된 마우스 (20, 21)와 쥐의 질 기관에서 복구 할 수 있다는 것을 보여 &lt;SUP&gt; 모두 임신과 비 임신 상태에서 22. 2005 년 단기 GBS 질 집락은 24 시간 기간에 걸쳐 23 질 GBS 치료에 파지 용균 효소의 효능을 조사 생쥐에서 만들어졌다. 몇 년 후, 장기 GBS 질 식민지 마우스 모델은 GBS 지속성을 관리하는 호스트와 세균 요인을 연구하기 위해 개발되었다. 이 모델은 표면 부속 (17, 18)과 GBS 두 구성 요소 시스템 19,24 포함 정착에 기여 수많은 GBS 요인을 확인했다. 이 모델은 호스트 응답 메커니즘 19,25의 식별에 기여하고 면역 펩티드 26, 프로바이오틱스 (27) 등 여러 가지 치료 전략을 시험하기 위해 사용되었다. 이 프로토콜은 마우스 질 관 GBS로 접종하고이어서 정착을 추적하고 추가적인 분석을 위해 샘플을 수집하기 위해 필요한 지침을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>참기름&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>S3547-250ML</td><td></td></tr><tr><td>&베타;-에스트라디올&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>E8875-1G</td><td>주의: 적절한 개인보호구를 착용하십시오. &베타;-에스트라디올은 피부와 점막 표면을 통해 흡수될 수 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>200 &뮤; L 젤 로딩 피펫 팁&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1252-0610</td><td></td></tr><tr><td>요도 생식기, 멸균, 칼슘 알긴산 면봉</td><td>Puritan</td><td>25-801 A 50</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar StrepB</td><td>DRG International</td><td>SB282</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt Broth</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>7161C</td><td></td></tr><tr><td>18 G, 1.5 인치 바늘</td><td>BD</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>26 G, 0.5 인치 바늘</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 주사기</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m PVDF 주사기 필터</td><td>Whatman</td><td>6900-2504</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 염 용액 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

그룹 b의 쥐 모델<em&gt; 연쇄상 구균</em&gt; 질 식민

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

성인의 30 % - 연쇄상 구균 agalactiae (그룹 B 연쇄상 구균, GBS)는 인간의 위장관 10의 질 기관의 그람 양성, 증상이 식민지 개척자이다. 면역 손상 개인을 포함한 신생아, 임산부, 노인에서는 GBS 패혈증, 관절염, 폐렴과 뇌막염을 일으키는 원인이 침입 병원체로 전환 할 수 있습니다. GBS가 신생아의 선도적 인 세균성 병원체이기 때문에, 현재의 예방은 GBS 질 식민지와 GBS 양성 어머니의 후속 산기 항생제 치료를 위해 임신 후기 검사로 구성되어 있습니다. 무거운 GBS 질 부담은 신생아 질환과 식민지 모두의 위험 요인이다. 불행하게도, 거의 호스트 및 홍보 또는 질 식민지 GBS을 허용 박테리아 요인에 대한 알려져있다. 이 프로토콜은 세균 LOA를 결정하는 하나의 β-에스트라 전처리 매일 샘플링을 이용한 영구 GBS 질 집락을 설정하기위한 기술을 설명디. 그것은 더 자세한 방법은 추가 치료 또는 관심의 시약을 관리하고 질 세척 유체 및 생식 기관의 조직을 수집 할 수 있습니다. 이 마우스 모델 임신 중 모체의 질 집락을 제어하고 취약한 신생아로의 전송을 방지하기 위해 잠재적 인 치료 표적으로 이어질 질 환경 내 GBS 호스트 상호 작용의 이해를 촉진한다. 또한 여성의 질 기관에서 일반 세균 - 호스트 상호 작용에 대한 우리의 이해를 높이기 위해 관심이 될 것입니다.

이 모델의 개발 과정에서 여러 관찰 GBS 질 정착 기간에 영향을주는 요인에 관한 하였다. 접종에 미치는 영향 GBS 세균의 지속성에 얼마나 발정 단계를 결정하려면, 마우스는 질 세척 유체를 통해 접종의 날에 개최되었다. 도 1에 의해 결정된대로 마우스 발정주기의 네 단계를 도시 습식 마운트 질 세정액, 잘 확립 된 방법 (29). 마우스는 초기 단계에 기초하여 그룹으로 분할하고, GBS 지속성 질 보라고 통해 시간 동안 모니터링 하였다. 발정 단계에서 접종 한 마우스는 발정의 다른 단계, 접종 시간 (그림 2)에서 diestrus에서 특히보다 더 GBS와 식민지가되었다. 이러한 결과에 기초하여, 현재의 모델에서, 마우스는 발정 단계로 동기화하기 전날 GBS로 접종-β 에스트라 디올로 처리된다. </p&gt; <p class="jove_content" fo:keep-together.with...

이 프로토콜의 목적은 쥐 모델에서 인간의 B 군 연쇄상 구균 (GBS) 질 식민지를 모방하는 것입니다. 이 방법은 숙주의 면역 반응 및 GBS 질 지속성에 기여 박테리아 인자를 조사 할뿐 아니라 치료 전략을 시험하기 위해 사용될 수있다.

그룹 B의 쥐 모델<em&gt; 연쇄상 구균</em&gt; 질 식민

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

이 동물 모델의 전반적인 목표는 마우스 질 내에 B군 연쇄상구균(group B Streptococcus, GBS)의 정착을 유도하는 것입니다. 이 방법은 정착에 중요한 박테리아 요인은 무엇인지, 그리고 숙주의 반응이 질 내 지속성에 어떤 영향을 미치는지와 같은 B군 연쇄상구균 정착에 관한 핵심적인 질문들을 이해하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적으로 마취제, 면역 억제제 또는 증점제 없이도 90% 이상의 정착률을 얻을 수 있다는 점입니다.먼저, 마우스 한 마리당 0.5 mg의 beta-Estradiol을 15 mL 원뿔형 튜브에 넣고, 모든 덩어리가 제거되어 beta-Estradiol이 고운 가루 형태로 보일 때까지 볼텍싱합니다. 다음으로, 마우스 한 마리당 100 µL의 참기름을 0.45 µm 스트레이너를 통해 튜브에 시린지 필터링하여 넣은 후, 튜브를 다시 볼텍싱합니다. 호르몬이 오일 전체에 균일한 현탁액으로 분산되면, 해당 시약을 새로운 10 mL 시린지에 흡입하고 18 gauge 1인치 바늘을 장착합니다.현탁액 100 µL를 마우스 한 마리당 1 mL 튜버큘린 주사기에 각각 분주하고, 각 튜버큘린 주사기에 멸균된 26 gauge, 1/2 inch 바늘을 장착합니다. 그런 다음, 각 동물의 복강 하단 왼쪽 또는 오른쪽 사분면에 beta-Estradiol 100 µL를 투여합니다. 주사와 같은 날, 대상 GBS 균주를 Todd Hewitt broth(THB)에서 37 °C로 5 mL 동안 하룻밤 동안 액체 배양합니다.다음 날 아침, 새로운 THB 배지에 GBS를 1:10 부피 비율로 계대 배양하고, 박테리아가 대수 증식 중간 단계(mid-log phase)에 도달할 때까지 37°C에서 2~3시간 동안 배양합니다. 그 후, 계대 배양액을 멸균된 15 mL 원심분리관(conical tube)으로 옮겨 박테리아 세포를 원심분리합니다. 침전물을 200 µL의 멸균 PBS에 재현탁합니다.그런 다음, 새 5 mL 배양 튜브에서 OD600이 0.4가 되도록 생쥐 10마리당 1 mL의 PBS를 추가하여 현탁액의 총 부피를 맞춥니다. 배양물을 새 15 mL 튜브로 옮긴 후 박테리아를 다시 펠렛화합니다. 그 다음, 원래 부피의 1/10에 해당하는 PBS에 세포를 재현탁합니다.접종액의 정확한 CFU를 결정하기 위해, 박테리아 50 µL를 따로 보관하여 연속 희석 후 THB agar에 도말합니다. 그다음, 200 µL 젤 로딩 피펫 팁에 GBS 10 µL를 취하고, 첫 번째 동물의 목덜미 쪽 느슨한 피부를 엄지와 검지로 잡아 고정한 후 꼬리를 고정합니다. 피펫 팁을 질강 내로 5~10 mm 삽입하고, 접종액 전체 부피를 분주합니다.그다음, 즉시 목덜미를 놓고 꼬리를 들어 동물의 뒷부분을 높이는 동시에 앞발은 딱딱한 표면 위에서 걷게 합니다. 1분 후, 질 입구에 접종액이 역류했는지 육안으로 확인합니다. 스와빙 직전에 면봉의 솜 부분을 PBS로 미리 적시고, 방금 시연한 방식대로 마우스 한 마리를 보정합니다.면봉을 질강 내로 10 밀리미터 삽입하고, 질벽에 가벼운 압력을 가하면서 시계 방향으로 4회, 반시계 방향으로 4회 천천히 회전시킵니다. 100 마이크로리터의 PBS가 들어 있는 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 면봉을 넣고, 튜브와 면봉을 약 15초 동안 볼텍싱하여 면섬유로부터 박테리아를 분리합니다. 그 다음, 각 시료를 PBS로 연속 희석하고, 제조사의 지침에 따라 준비된 감별 배지 한천 플레이트에 1:10에서 1:10,000까지 희석한 액체 20 마이크로리터를 도말하여 37 도 섭씨에서 24시간 동안 배양합니다.GBS 콜로니는 밝은 분홍색 또는 연보라색으로 나타납니다. 질 세척액을 수집하려면, 200 µL 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 20 µL의 PBS를 질강 내에 분주합니다. 질강 내에서 전체 부피를 네 번 천천히 피펫팅하여 섞어줍니다.그런 다음, 동일한 팁을 사용하여 전체 부피를 흡입합니다. 후속 세척액 분석을 위해서는 세척액을 0.7 milliliter 마이크로원심분리관에 분주합니다. 조직 해부 균질화를 위해서는 안락사시킨 동물의 복측 복부를 70 % 에탄올로 살포하고, 멸균 가위를 사용하여 복골반강을 엽니다.생식관이 노출되도록 장을 밀어냅니다. 그 다음, 자궁체와 난소 사이의 자궁각 중간 부분을 양쪽 모두 절단합니다. 가위와 핀셋을 사용하여 내장 지방, 막, 그리고 방광을 생식관에서 분리하여 조직을 미측으로 이동시킵니다.그런 다음, 생식관을 몸체에서 분리하기 위해 질을 외음부와 최대한 가까운 곳에서 횡단면으로 절개합니다. 손상되지 않은 생식관을 멸균 페트리 접시에 옮기고, 새 면도날을 사용하여 자궁을 자궁경부에서 한 번의 횡단 절개로 분리합니다. 다시 횡단 절개하여 자궁경부를 질에서 분리합니다.그 다음, 멸균 핀셋을 사용하여 각 조직을 500 µL의 PBS와 균질화 비드가 들어 있는, 미리 무게를 잰 개별 2 mL 튜브로 옮깁니다. 각 2 mL 튜브의 무게를 측정하여 조직의 무게를 결정합니다. 그런 다음, 스크류 캡 튜브를 단단히 밀봉하고 조직 균질화기를 사용하여 최대 속도로 1분 동안 조직을 균질화합니다.박테리아 부하량을 정량화하려면, 조직 균질액 25 µL를 연속 희석하여 1/10에서 1/10,000 희석 배수까지 선택적 배지 한천 플레이트에 도말하고, 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 사이토카인 정량을 위해 시료를 보관하려면, 균질액을 -20 °C에서 냉동하십시오. 이 이미지들에서는 습식 마운트 질 세척액으로 판별한 마우스 발정 주기의 4단계를 보여줍니다.발정전기 단계에서 접종된 마우스는 에스트러스의 다른 어떤 단계보다 GBS가 더 오래 군집을 형성했으며, 특히 접종 당시 발정후기에 있던 마우스에서 이러한 경향이 두드러졌습니다. 지속적인 발정기는 CD-1 마우스에서 GBS A909의 지속성을 촉진하며, 접종 2주 후 90%의 군집 형성률이 관찰되었습니다. 접종 전 beta-Estradiol을 1회 투여한 일반적인 실험에서는 접종 1주 후 마우스의 40~50%만 군집을 형성했으며, 회수된 평균 GBS 양은 군집 형성 비율과 유사하게 나타났습니다.지속적인 발정기 상태를 유지하는 것이 대부분의 CD-1 마우스에서 GBS의 질 내 지속성을 촉진함을 입증합니다. GBS A909는 잡종 CD-1 마우스와 근친 교배된 FVB 마우스의 질 내에서 약 1주일 동안 지속됩니다. 반면, 근친 교배된 BALB/c 및 C57BL/6 마우스의 대부분은 1주일 후에 군집화되어 한 달 또는 그 이상 지속됩니다.접종된 동물에서 GFP 양성 GBS를 시각화하면 GBS가 마우스 질 상피에 부착되어 있으며 다른 자생 질 내 미생물 군집과 매우 가깝게 위치하고 있음을 보여줍니다. 모든 마우스에 군락이 형성되도록 하려면 접종 중에 역류를 방지하는 것이 중요합니다. 이 기술에 숙달되면 동물 수에 따라 1~2시간 내에 완료할 수 있습니다.이 모델을 통해 숙주-병원체 상호작용 분야의 연구자들은 B군 연쇄상구균과 같은 박테리아가 여성 생식관에 정착하는 능력을 탐구할 수 있습니다. 이 절차는 치료적 개입에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 새로운 화합물이나 프로바이오틱스 치료제를 테스트하는 데 활용될 수 있습니다.

a-murine-model-of-group-b-streptococcus-vaginal-colonization

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

의 실험 마우스 모델에서 질 접종 및 샘플 수집을위한 프로토콜 칸디다 질염

출처: Morrill, SR, et al. 혐기성 성장 박테리아에 의한 쥐 질 집락화 모델. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 항생제 내성 혐기성 박테리아를 사용하여 마우스의 질 집락화를 모델링하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. 상피 감수성을 증가시키기 위한 호르몬 치료로 시작하여 혐기성 조건에서 질 접종 및 동시 접종이 이어집니다. 이 절차는 박테리아 집락화 및 생물막 형성을 평가하기 위한 접종 후 샘플링 및 배양으로 마무리됩니다.

혐기성 박테리아에 의한 쥐 질 집락화 모델링

출처: 파트라스, K. A., 도란, K. S. B 군 연쇄상구균 질 정착의 쥐 모델. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 B 그룹연상구균 에 감염된 호르몬 처리된 암컷 쥐의 준비 및 질 접종 과정을 시연하여 감염을 모델링합니다. 박테리아를 배양하고 준비하는 방법, 질 내강에 접종을 투여하는 방법, 그리고 성공적인 감염을 보장하는 방법을 설명합니다.

질 그룹 B 연쇄상구균 감염의 마우스 모델 구축

출처: 파트라스, K. A. &amp; 도란, K. S. B 군 연쇄상구균 질 정착의 쥐 모델. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 면봉 채취와 염색 배양을 이용해 마우스 모델에서 질 B 군 연쇄상구균 (GBS) 부하를 정량화하는 과정을 보여줍니다. 이 연구는 마우스 질 내강 내 GBS 부하를 정량화하기 위해 샘플 수집, 플레이트 부착, 콜로니 카운팅 과정에 필요한 단계를 개괄합니다.

면봉 및 염색 배양을 통한 마우스 질 내강 내 그룹 B 연쇄상구균 부하 정량화

이 비디오는 경요도 카테터 점안을 통해 암컷 마우스 방광에서 요병원성 대장균 감염이 확립되는 것을 보여줍니다. 주입된 박테리아는 방광 내에서 요로 감염을 성공적으로 확립하여 요로와 관련된 의료 관련 질병을 연구하기 위한 귀중한 플랫폼을 제공합니다.

암컷 마우스의 요로 감염 모델 구축

나이 세리아 수막염은 혈관을 감염시키는 인간의 특정 병원체이다. 이 프로토콜에서 인간의 미세 혈관은 면역 억제 쥐에 인간의 피부를 이식하여 마우스에 도입된다. 박테리아는 일반적으로 인간의 경우에 관찰 부르르 발진, 혈관 손상과 발전에 선도적 인, 인간의 혈관에 광범위하게 준수합니다.

인간 답게 된 마우스 모델은 미세 혈관을 대상으로 세균 감염을 연구하는

재발성 UPEC UTI를 유도하기 위해 잠복성 세포내 방광 저장소와 G. 질리스에 대한 후속 방광 노출을 확립하는 비뇨병원성 대장균(UPEC) 경요도 접종의 마우스 모델이 입증된다. 또한 박테리아의 열거, 소변 세포학 및 주사 전자 현미경을위한 현장 방광 고정 및 처리가 입증되었습니다.

재발 성 에스케리치아 콜라 이 요로 감염 Gardnerella 질 방광 노출에 의해 유발 마우스에서

이 프로토콜은 혐기성 배양 된 인간 질 박테리아를 사용한 질 식민지화의 마우스 모델을 제시합니다. 우리는 Gardnerella vaginalis에 초점을 맞추고 Prevotella bivia 및 Fusobacterium nucleatum에 대한 제안을 포함합니다. 이 프로토콜은 또한 질 접종 및 다른 혐기성 성장 박테리아의 실행 가능한 회복을위한 지침으로 사용될 수 있습니다.

혐기성 박테리아에 의한 쥐 질 집락화 모델

조산(37주 분만)은 최적이 아닌 예방 및 치료 옵션이 있는 긴급한 글로벌 건강 문제&lt; 있습니다. 우리는 상행 질 세균 감염으로 인한 조산의 마우스 모델을 제시하고 그 결과 신생아 이환율과 사망률을 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다.

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이 프로토콜은 비염증 조건에서 pks+ 대장 균 쥐를 정착하는 데 필요한 절차와, 대변 내 pks+ 대장균 확장의 비침습적 확립 및 평가 방법을 설명합니다.

비염증 조건에서 마우스 pks+ 대장균에 의한 정착

학습하세요 쥐 질 식민 모델을 통해 그룹 B 연쇄상 구균(GBS)의 면역 반응과 세균 인자를 연구하는 방법을. 이 기술은 마취 없이 90% 이상의 식민율을 달성하여 치료 전략 테스트에 유용합니다.

그룹 B의 쥐 모델

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