검출 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei 변형 표면 당 단백질 전환

이 방법의 전반적인 목표는 특정 변이 표면 당단백질 또는 VSG를 발현하는 트리파노좀을 나머지 개체군에서 분리하고 시작 우성 VSG에서 다른 VSG로 전환된 기생충을 식별하는 것입니다. 이 방법은 기생충 개체군에서 VSG 전환에 영향을 미치는 요인 또는 사건이 무엇인지와 같은 트리파노솜 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이전에 발표된 방법보다 빠르며 스위치가 없는 셀로의 전환을 쉽게 정량화할 수 있다는 것입니다.

실험실에서 처음 항원 변이에 대한 연구를 시작했을 때 첫 번째 문제는 희귀 스위처를 감지하는 방법이었습니다. 이러한 종류의 문제는 실제로 몇 년 전 면역학에서 특정 형질에 대해 부정적인 세포를 농축하기 위해 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 해결되었습니다. 비선택 과정을 항원 변이로 이식하는 것은 정말 유망한 아이디어처럼 보였습니다.

우선, Lister 427 균주 혈류 트리파노솜은 밀리리터당 0.5 내지 100, 000의 밀도로 성장해야 한다. 6개의 세포 샘플에 50 곱하기 10을 15ml 튜브에 분취한 다음 원심분리기합니다. 6개의 세포에 1 곱하기 10을 저장하고 나중에 양성 및 음성 항체 대조군으로 사용할 수 있도록 배양합니다.

대부분의 상등액을 피펫으로 분리하여 튜브에 약 750 마이크로 리터를 남깁니다. 세포를 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 마지막으로, 섭씨 4도에서 2800 회 g으로 4 분 동안 세포를 원심 분리한다.

그런 다음 모든 상등액을 피펫으로 제거합니다. 150마이크로리터의 배양 배지에 세포를 재현탁하고 1차 항변이체 표면 당단백질 항체 또는 항 VSG를 적절한 희석으로 재현탁합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 10분 동안 세포를 소용돌이칩니다.

800-1000 마이크로 리터의 차가운 배양 배지로 세척하십시오. 섭씨 4도에서 5200 회 g으로 4 분 동안 세포를 원심 분리하십시오. 상등액을 흡인시킨 후 1ml의 배양액으로 세포를 세척하고 다시 원심분리합니다.

상등액을 제거하고 펠릿을 100 마이크로 리터의 배양 배지에 재현탁시킵니다. 110마이크로리터의 1차 항체에 적합한 유형의 자기 활성화 세포 분류 마이크로비드를 추가합니다. 위아래로 피펫팅한 다음 와류로 잘 섞습니다.

세포가 와류를 일으키는 동안 자기 활성화 분리 컬럼을 설정합니다. 그 아래에 15ml 튜브를 놓고 프라이밍 매체를 수집합니다. 2ml의 배양 배지를 추가하여 컬럼을 프라이밍합니다.

다음으로, 와류에서 샘플을 제거하고 800-1000 마이크로 리터의 저온 배양 배지를 첨가하십시오. 샘플을 원심분리한 다음 상층액을 제거하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 펠릿화된 세포를 1ml의 배양 배지로 세척하고 다시 원심분리기를 합니다.

이번에는 상등액을 흡입하되 튜브에 100마이크로리터를 남겨둡니다. 펠릿이 완전히 다시 부유할 때까지 원심분리기 튜브를 세게 튕깁니다. 1ml의 배양 배지와 피펫을 위아래로 추가하여 세포를 완전히 재현탁시킵니다.

프라이밍 매체를 수집하는 데 사용되는 15mm 원추형 튜브를 제거하고 새로운 15mm 원뿔형 튜브로 교체하여 전환된 기생충을 포함하는 흐름을 수집합니다. 세포 현탁액을 프라이밍된 컬럼에 적용합니다. 아래의 15ml 튜브에 플로우 스루를 수집하며, 1ml의 미디엄 플러스 트리파노솜의 경우 일반적으로 6-7분이 소요됩니다.

다음으로, 1ml의 배양 배지로 컬럼을 두 번 세척하고 동일한 튜브에 플로우스루를 수집합니다. 총 용량이 약 3밀리리터인 플로우 스루를 두 개의 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 나눕니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

컬럼에 3ml의 배양 배지를 추가하고 컬럼을 15ml 원심분리 튜브에 넣습니다. 이렇게 하면 시작 우성 VSG를 발현하는 셀을 얻을 수 있습니다. 이 용출된 물질 300마이크로리터를 제거하고 얼음 위에 보관하면 나머지는 버릴 수 있습니다.

긍정적인 대조군을 창조하기 위하여는, 세포의 시작 배양에서 대략 100, 000의 세포를 가지고 가고 1.5 밀리리터 마이크로 분리기 관으로 그(것)들을 피펫으로 삐걱거리십시오. 이 작업을 반복하여 음수 컨트롤을 만듭니다. flow-through 샘플과 positive control 샘플을 원심분리합니다.

그런 다음 상층액을 제거하고 버립니다. 양성 대조군 세포를 100마이크로리터의 배양 배지에 1차 형광단 표지된 anti VSG 항체와 함께 적절한 희석으로 재현탁합니다. 다음으로, 1차 형광단 표지된 anti VSG 항체와 함께 100마이크로리터의 배양 배지에 1개의 플로우 스루 펠릿을 적절한 희석으로 재현탁합니다.

그런 다음 현탁액을 사용하여 펠릿을 두 번째 관류에 다시 현탁시켜 하나의 풀 튜브를 만듭니다. 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다. 세포를 와류로 처리한 다음 800-1000마이크로리터의 저온 배양 배지를 추가합니다.

섭씨 4도에서 5200회 g로 4분 동안 시료를 원심분리한 다음 상등액을 버리고 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 1ml의 배양 배지로 세포를 세척한 다음 세포를 원심분리합니다. 양성 및 음성 대조군과 이전에 얼음에 보관된 용출된 세포.

상등액을 버리십시오. 그 후, 샘플에 148.5 마이크로 리터의 배양 배지를 첨가하십시오. 다음으로, 25마이크로리터의 절대 계수 비드를 추가한 다음 1.5마이크로리터의 프로피듐 요오드화물 염색 용액을 추가합니다.

양성 및 음성 대조군 펠릿을 175마이크로리터의 배양 배지로 재현탁합니다. 이제 유세포 분석기에서 샘플을 실행할 수 있습니다. 이러한 유세포 분석 플롯은 이중 가닥 DNA 절단을 생성하도록 유도된 트리파노좀 집단과 유도되지 않은 세포의 세포 분리 결과를 보여줍니다.

왼쪽 패널은 전방 대 측면 산란을 보여주며, 이를 통해 샘플에 추가된 살아있는 세포와 죽은 세포 및 비드를 설명할 수 있습니다. 그런 다음 산란 특성을 기반으로 이를 결정하는 게이트를 생성할 수 있습니다. 오른쪽 패널에는 왼쪽 패널에서 생성된 산란 게이트를 기반으로 살아있는 것으로 분류할 수 있는 셀만 표시됩니다.

이 경우 지배적인 시작 VSG는 VSG 2였습니다. Propidium Iodide에 대해 양성으로 염색된 세포는 죽은 세포입니다. 그리고 이것들은 플롯의 Q 1 및 Q 2 영역에서 볼 수 있습니다.

우성 VSG에 대해 양성으로 염색되고 PI에 대해 음성으로 염색되는 세포는 Q 3 영역에 속하며 오염 물질입니다. 마지막으로, Q 4의 세포는 스위처로 간주되는 우성 VSG에 대해 음극으로 염색되는 살아있는 세포입니다. 이 플롯은 유도 단절이 있는 것과 없는 트리파노솜 집단의 계산된 관찰된 스위칭 빈도를 보여줍니다.

시험관 내에서 확률적 스위칭 수준은 상당히 낮습니다. 중단을 유도하면 훨씬 더 많은 세포가 생성되지만 비우성 VSG로 전환합니다. 이 기술을 완전히 익히면 약 3시간 안에 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안에는 시료를 전체적으로 차갑게 유지하고 특히 컬럼에서 분리하기 전에 펠릿을 적절하게 재현탁하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 RNA 염기서열분석과 같은 다른 방법을 사용하여 스위치 모집단에서 어떤 VSG가 발현되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이러한 방법은 일반적으로 VSG 스위칭을 측정하는 데 사용되며, 관심 있는 표면 단백질을 발현하는 기생충의 분리 및 정량화에도 사용할 수 있습니다.