Name: 스트레스 식물에서 분리 된 엽록체로 단백질 가져 오기의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 배우세요 스트레스 조건에서 엽록체 단백질 가져오기를 분석하는 방법을 Arabidopsis thaliana를 사용하여. 이 기술은 식물 생물학 및 스트레스 생리 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회에서 PJ에 부여에 의해 지원되었다 (BBSRC, 심판을 부여 BB / K018442 / 1.).

1. 애기 장대 식물의 성장과 스트레스 치료 <ol><li> 1 L에 순수까지 MS 바살 염 혼합물의 4.3 g 10 g의 수 크로스, 0.5 g 2- (N- 모르 폴리 노) 에탄 술폰산 (MES)을 첨가하여 무라 시게 및 스쿡 (MS) 배지 1 L를 준비하고, 조정 수산화 칼륨으로 pH를 5.7로 (KOH). 120 ℃에서 20 분 동안 phytoagar 및 오토 클레이브 6g을 추가합니다. <ol><li> 응고하기 전에 (- 판 당 25 mL의 MS 배지 (20)와 직경 9cm, 높이 1.5 cm) 라운드 페트리 접시에 매체를 붓는다. 플레이트는 뚜껑을 닫기 전에 층류 후드 1 ~위한 시간을 건조하도록 허용합니다. </li></ol></li><li> 70 %의 1 ㎖의 0.02 % (v / v) 트리톤 X-100을 함유하고 지속적으로 5-10 분 동안 진탕 (v / v)의 에탄올을 첨가하여 표면 살균 1.5 mL를 시험관에 애기 장대의 종자를 배치했다. (150) 모종 - 각 유전자형 / 상태의 경우, 10 페트리 접시 각각 들고 ~ (100)을 준비합니다. </li><li> 씨앗이에 정착 할 때까지 약 10 초 동안 기다립니다다음 튜브의 바닥, 그리고 피펫으로 상층 액을 버린다. 100 % 에탄올 1 mL를 넣고 10 분 동안 다시 튜브를 흔들. </li><li> 씨앗이 살균하는 동안 층류 후드를 준비합니다. 샘플 당 여과지의 한 조각을 가지고 파종을 용이하게하기 위해 반으로 접은 후드에 100 % 에탄올에 담가. 그것은 완전히 건조 될 때까지 기다립니다. 더 빠르게 70 % 에탄올보다는 증발이 100 % 에탄올을 사용하는 주. </li><li> 미세 끝에서 1 mL를 피펫 팁 컷 ~ 5mm를 사용하여 피펫 팅하여 여과지 위에 씨앗을 전송합니다. 15 분 - 그들이 10을해야하는, 건조하도록 허용합니다. </li><li> 각 MS 매체 페트리 접시에 균등하게 150 살균 씨, 수술 테이프로 각 플레이트를 밀봉 - ~ 100 뿌리다. </li><li> 격려하고 발아를 동기화 4 D - 거꾸로 2 4 ° C에서 접시를 저장합니다. 이전 씨는 4 ° C에서 (주까지) 이상 유지해야 할 수 있습니다. </li><li> 식물 조직 배양 챔버에 접시를 전송하고 거꾸로 업을 둡니다.긴 일주기에서 8 D의 식물 성장 (16 시간 100 μmol · m - 2 ·의 - 1 등, 8 시간의 어두운) 20 ° C에서. </li><li> 식물이 흐름 후드, 8 라 오래 스트레스 치료의 경우, 부드럽게 스트레스를 포함하는 액체 MS 매체의 멸균 플라스크에 넣고, 에탄올 멸균 장갑을 끼고 손을 긁어에 의해, 한천 매체로 전송 (예 : , 200 mM의 만니톨). 한천 매체를 통해 운반하지 마십시오. 멸균 호일로 플라스크 입을 덮고 식물 부드러운 진탕 (~ 100 RPM)를 오비탈 진탕 기에서 추가로 2 일 동안 단계 1.8에서와 동일한 조건 하에서 성장을 허용한다. </li></ol> 2. 시험 관내 전사에 의해 전구체 단백질을 만들기 / 번역 주 :이 프로토콜은 I 템플릿 / D 프레 같은 전구체 (pPsaD)를 소단위 애기 광계의 사용을 가정하지만, 다른 방법과 호환 가능하다. <ol&gt; <li> pBluescript 계 II SK 벡터 (또는 상류 T7 프로모터와 다른 유사한 벡터) (13)의 다중 클로닝 부위 (MCS)에 pPsaD의 암호화 서열 (CDS)를 복제. 하는 DNA 분리 키트를 사용하여 플라스미드 (통해 pBSK-pPsaD)을 정제하고 DNA 서열 분석에 의해 서열을 확인. 참고 :이 모든 단계는 표준 분자 복제 기술을 사용한다. </li><li> 260 nm에서 흡광도를 측정하도록 설정된 분광 광도계를 사용을 pBSK-pPsaD 플라스미드 DNA 농도를 측정. 10 NG / μL의 최종 농도로 플라스미드를 희석. </li><li> 템플릿으로 희석 된 플라스미드를 사용하여 (35 사이클) 20 μL PCR을 실행합니다. 2 μL 10 × 중합 효소 버퍼, 2 μL 2 밀리미터의 dNTPs, 1 μL 5 mM의 M13 앞으로 프라이머 (5&#39;-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 &#39;), 1 μL 5 mM의 M13 역방향 프라이머 (5 : 다음과 같이 반응 준비 &#39;-CAG은 GAA ACA-3 ACC GCT ATG&#39;), 1 μL은을 pBSK-pPsaD 플라스미드, 1 U Taq 중합 효소 및 증류수를 희석까지 총 반응 볼륨을 만들려면20 μL. 다음과 같이 표준 PCR 프로그램을 사용하여 95 ° C, 5 분; [95 ° C, 30 초 35주기; 56 ° C, 30 초; 72 ° C, 30 초) 72 ° C, 5 분. </li><li> TAE 완충액 (트리스 - 염산, pH가 7.6, 20mM의 ​​아세트산, 1 mM의 EDTA)에서 아가 로스 겔 cDNA에 올바른 증폭을 확인하고 해당 정량화 (/ V는 W) 1 %의 PCR 산물의 5 μL를 실행 표준 밴드의 상대 농도를 확인합니다. 상기 애플리케이션 -20 ° C에서 제품의 나머지 부분을 저장한다. </li><li> 다음과 같이 PCR DNA와 호환 토끼 망상 적혈구 용 해물 계 무 세포 전사 / 번역 시스템을 이용하여 50 μL 반응을 준비한다 : 40 μL 망상 적혈구 용 해물을 전사 / 번역 시스템에서, 2.5 μL 방사성 [35 S] 메티오닌, 11 μCi를 / ㎖ (특정 활동&gt; 1000 CI / mmol)을, 2.5 μL 멸균 증류수, 5 μL pPsaD PCR 제품 (100-800 NG). 주의 : 장갑, 실험실 의류 및 안전 한 유리를 착용SES는 방사성 물질을 취급 할 때. 모니터링 및 작업 표면 및 장비의 오염을 제거. 허가 된 폐기물 용기에 모든 방사성 폐기물 폐기하십시오. </li><li> 30 ° C의 물을 욕조에 90 분 동안 반응을 품어. 얼음 위에 시료를 넣어 반응을 정지. </li><li> 오토 라디오 그래피, fluorography 또는 형광 촬상 다음 표준 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)의 검증을위한 시료로서 반응 (동일한 부피는 단계 5.7에 대한 입력 제어 역할을 할 수) 1 μL를 제거한다. 좋은 결과 pPsaD (~ 23 kDa의)의 분자량에 상응하는 별개의 강한 밴드의 관측에 의해 지시된다. 추가 응용 프로그램에 대한 -80 ° C에서 반응의 나머지를 저장합니다. </li></ol> 3. 엽록체 분리 <ol><li> 다음 재고 솔루션을 준비합니다 : <ol><li> 0.6 M 솔비톨, 10 mM 염화 마그네슘 : 엽록체 분리 완충액 (CIB 2 배)를 준비(의 MgCl 2), 10 mM의 에틸렌 글리콜 디아민 테트라 아세트산 (EGTA), 10 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 20 mM의의 중탄산 나트륨 (NaHCO3), 40 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄 술폰산 (HEPES) ; KOH으로 pH 8.0으로 조정한다. 2 배 CIB 2 L 준비를 분취하고 장기 보관을 위해 -20 ℃에서 그들을 유지 또는 단기 저장을 위해 4 ℃에서. 증류수로 1; 1 배 CIB을하려면 배 CIB 1 희석 이는 엽록체 분리 실험 일에 신선하게 제조 할 수있다. </li><li> HEPES-황산 4 -Sorbitol 완충액 (HMS, 1X) 준비는 50mM HEPES, 3 mM의 황산 마그네슘 (MgSO4로), 0.3 M 소르비톨; 수산화 나트륨 (NaOH)으로 pH를 8.0으로 조정한다. 버퍼 400 mL의 분취 량을 준비하고 장기 보관을 위해 -20 ℃에서 그들을 유지 또는 단기 저장을 위해 4 ℃에서. </li></ol></li><li> 추운 방에서 또는 얼음에서 다음 절차를 모두 실시한다. 일 전에 용액, 장치, 장비, 및 로터 모두 사전 냉각arting. </li><li> 13 mL의 퍼콜, 13 mL의 2 배 CIB 버퍼 및 50 mL의 원심 분리기 튜브에 5 밀리그램 글루타티온을 혼합, 4 ° C에서 30 분 (브레이크 해제)에 대한 43,000 × g에서 혼합물을 원심 분리하여 연속 밀도 기울기를 준비합니다. 원심 분리 후, 그라디언트를 방해 방지하고 나중에 사용하기 위해 얼음에 그것을 유지하기 위해주의 튜브를 처리합니다. </li><li> 1 L 비이커에 유전자형 / 조건에 따라 1 배 CIB의 100 mL로 전송합니다. <ol><li> 체로 팁에 의해 액체 매질에서 모종을 제거하고 다른 CIB 함유 비커에 전송할; 이어서, 신선한 CIB 100㎖로 교체하기 전에 잔류 액체 매질을 제거하는 CIB와 조직을 헹군다. </li></ol></li><li> 균질화를 들어, 50 mL의 비커에서 개최 신선한 CIB의 20 ㎖를 사용하여 라운드 균질화의 5 개의 연속 라운드, 각 샘플 당 100 mL의 1 배의 CIB의 총을 사용합니다. <ol><li> 균질의 첫 번째 라운드를 들면, 허용, 손으로 50 ㎖ 비이커로 식물 조직을 전송할이전 보유 버퍼는 손가락을 통해 배출합니다. 첫 라운드에서 조직의 대부분을 사용하려고하지만,이 버퍼에 몰입되어 있는지 확인; 이것이 가능하지 않다면, 두 번째 라운드의 나머지 미사용 조직을 소개한다. </li></ol></li><li> 조직에 조직 균질의 프로브를 놓고 1 개의 펄스와 균질화 - 2의 각. 부드러운 압착하여 250 mL의 원심 분리기 튜브에 여과 천의 두 층을 통해 균질를 필터링합니다. 여액을 유지하고, 50 mL의 비커에 다시 조직을 전송합니다. </li><li> 균질화의 첫 번째 라운드에 사용되지 않은 나머지 조직을 추가, 50 mL의 비커에 두 번째 20 ㎖ CIB 나누어지는을 배치하고, 균질화 여과 단계를 반복합니다. 따라서, 반복 CIB의 100 ㎖ (즉, 5 ~ 20 mL를 분취), 그리고 결과 여과 액을 결합까지 사용 된 모든 때까지 3.5 및 3.6 단계를 반복합니다. </li><li> 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 (에 브레이크) 1,000 × g에서 풀링 된 균질하고, 부어상층 액을 즉시 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 원심 분리의 완료에 따라. 조심스럽게 얼음에 튜브를 교반하여 튜브에 남아있는 상등액 잔류 펠렛을 재현 탁. 피펫 또는 텍싱에 의해 적극적으로 재현 탁하지 마십시오. </li><li> 부드럽게 수용 튜브의 벽을 통해 적용 할 파스퇴르 피펫을 사용하여 미리 제작 된 연속적인 밀도 구배의 정상에 균질 옮긴다. 그라데이션을 방해하지 마십시오. 4 ℃에서 10 분 (브레이크 해제)에 대한 7,800 × g에서 스윙 버킷 로터에서 원심 분리기. 하단 밴드가 그대로 엽록체를 포함하고 상위 대역 깨진 엽록체가 포함되어 두 개의 녹색 밴드는 원심 분리 후 그라디언트에서 볼 수 있습니다. </li><li> 피펫으로 상위 대역을 폐기하고 그라데이션 당 최대 8 ㎖를 유지하는 신선한 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 파스퇴르 피펫으로 낮은 주파수 대역을 전송. </li><li> t ~ 1X HMS 25 ㎖의 튜브에 완충액 추가 회 튜브 반전오 엽록체에서 퍼콜을 씻는다. 4 ° C에서 5 분 (에 브레이크) 1,000 × g에서 스윙 - 버킷 로터와 원심 분리기에 다시 튜브를 놓습니다. </li><li> 상층 액을 붓고 조심스럽게 부드럽게 얼음에 튜브를 교반하여 튜브에 남아있는 잔류 HMS에서 엽록체 펠렛을 재현 탁. (펠렛의 크기와 제 4의 계산 기준) 필요한 경우 HMS 300 μL,하지만 너무 많은 샘플을 희석하지 않으려 고 - 추가 (100)를 추가합니다. <ol><li> 얼음에 엽록체를 유지합니다. 엽록체는, 다운 스트림 응용 프로그램에 사용하기 전에 각각의 시간을 재현 탁하기 위해 튜브를 흔들어. 항상 엽록체를 전송하는 (확대 기공)와 컷 피펫 팁을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 엽록체의 수율 및 Intactness 4. 분석 <ol><li> 1.5 mL의 튜브에 495 μL 1 배의 HMS 버퍼에 고립 된 엽록체의 5 μL를 추가 한 다음 1 얻을 수있는 튜브 반전 부드럽게 혼합 : 100 희석. </li><li> 놀이터혈구의 카운팅 챔버의 상부에 커버 글래스 CE. 천천히 피펫 ~ 40 - 커버 유리 및 카운팅 챔버 사이의 간극에 희석 엽록체 현탁액 60 μL. 10 배 또는 20 배 목적으로 위상 현미경을 사용하여, 그대로 엽록체는 둥글고 밝은 모양과 빛의 후광으로 둘러싸여있다. 주 : 현미경으로, 25 큰 사각형 카운팅 챔버의 중심에 각각 포함하는 16 개의 작은 사각형 1mm의 카운팅이 영역이있다. </li><li> 10 큰 사각형 엽록체의 수를 계산합니다. 너무 적거나 너무 많은 엽록체가 있으면, 적절하게 희석 계수 (상기 단계 4.1)을 조정하고, 절차를 반복하여 10 내지 30 대 면적당 엽록체의 수 평균한다. </li><li> 다음 ㎖ (농도) 당 엽록체의 수를 계산한다 : N (단계 4.3에서 계산 된 대형 사각형 당 엽록체의 평균 수)가 큰 사각형 (25) (총 개수 ×) 100 (희석 인자) × 25 사각형 위 용적이 0.1 mm이기 때문에 3) 1 mL의 데이터를 표현하기 위해 104 (스케일링 팩터 ×. </li><li> 단계 3.12에서 얻어진 엽록체 현탁액의 부피 농도를 곱하여 엽록체의 실제 수익률을 계산합니다. 일반적으로, 50 × 106 엽록체를 얻을 수있다. </li></ol> 5. 엽록체 단백질 가져 오기 <ol><li> 다음 재고 솔루션을 준비합니다 : <ol><li> 10 배 HMS 버퍼 준비 : 500 mM의 HEPES, 30 mM의 황산, 3.0 M 소르비톨을; NaOH로 pH를 8.0으로 조정한다. 장기간 저장을 위해 -20 ℃에서의 버퍼, 분취하고, 저장소 50 ㎖를 준비하고 단기 저장을 위해 4 ℃에서. </li><li> 1 배 HMS 완충 용액 50 mM의 EDTA : 수입 정지 버퍼를 준비합니다. -20 ° C에서 버퍼, 나누어지는 및 저장의 50 ㎖를 준비합니다. </li><li> (w 60 mM 트리스 - 염산, pH가 6.8, 10 % (v / v) 글리세롤, 2 % : 배 단백질 로딩 완충액을 준비/ v)의 SDS, 0.005 % (w / v)의 브로 모 페놀 블루. 4 ℃에서 50 mL를 저장합니다. 그냥 사용하기 전에, 버퍼 900 μL에 1 M 1,4- 디티 오 트레이 톨 (DTT)의 100 μL를 추가합니다. </li></ol></li><li> 3 시간 점 시간 과정을 실행 3 관 수입 정지 버퍼의 130 μL 나누어지는을 포함하는 각을 준비하고 얼음을 둡니다. (유전자형 / 조건에 따라) 2 mL의 튜브에 450 μL 가져 오기 반응을 준비합니다. 사용 직전에 모든 성분을 해동. <ol><li> 하나 수입 반응에 통상적으로 μL 부피의 10 × 10 6 엽록체를 사용; 예컨대, 엽록소 농도는 2.5 × 108 / ㎖ 40 μL 엽록체 현탁액을 사용하는 경우. 세 번째 포인트는 3 × μL가 필요합니다 (즉, 우리의 예에서 120 μL). </li><li> 다음 순서대로 얼음에 반응 성분을 혼합 : 증류수 (총 부피 600 μL를 만들기 위해), B μL 배 HMS 완충액 (여기서, B = [600-3 × A] / 10, 즉 48이 예에서) 12 μL1 M 글루 콘산 (칼륨 염), 6 μL 1 M NaHCO3을 6 μL의 20 % BSA, 30 μL를 100mM 아데노신 5&#39;- 삼인산 마그네슘 염 (MgATP) 24 μL 250 mM의 메티오닌 (/ V W) (방사성 표지되지 ), 30 μL 단백질을 전구체. 즉시 가져 오기 반응을 시작하기 전에, 3 × 엽록체의 μL를 추가하고 부드럽게 튜브를 눌러 섞는다. </li></ol></li><li> 2 ·의 - 1 - 빛 100 μmol · m 아래 수조에서 25 ° C에서 반응 튜브를 품어. 때때로 엽록체를 재현 탁하기 위해 튜브를 가볍게. </li><li> 시간 코스를 수행하기 위해, pPsaD 위해 ~ 12 분 (4, 8 및 12 분 시간 지점은 적합하도록 인 수입의 선형 범위 내에 필요한 시간 지점에서 상기 반응으로부터 130 μL 씩 인출 이 경우에). 선형 범위 기간은 다른 단백질 (14)에 따라 다를 수 있습니다. 따라서, t를 최적화하기 전에 각각의 프레를 테스트 제안그는 시간을 가리 킵니다. </li><li> 즉시 인출시에, 빙냉 오기 정지 버퍼의 각 튜브에 130 μL 분취를 부드럽게 전달 튜브를 탭하여 혼합하고, 시간 과정이 완료 될 때까지 얼음 모든 튜브를 유지한다. </li><li> 원심 분리기의 microfuge에서 12,000 × g에서 30 초 동안 모든 샘플은 피펫으로 상층 액을 버리고, 그리고에 resuspend 펠릿 텍싱 15 μL 배의 단백질 로딩 버퍼입니다. </li><li> 모든 샘플 플러스 표준 SDS-PAGE 및 오토 라디오 그래피, fluorography 또는 형광 영상 (15)에 의해 pPsaD 입력 제어부 (단계 270에서, 각각의 가져 오기 반응에 첨가 양의 10 % pPsaD 당량을 함유)을 분석. 결과를 정량화하고 분석 할 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다. 수입 효율의 표시를 제공하기 위해, 다른 유전자형 가져온 단백질 량 / 각 상황 성숙한 밴드와 연관된 방사능을 측정함으로써 평가 될 수있다. </li></ol>

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우리는 최근 엽록체 단백질 가져 오기가 적극적으로 엽록체 기능과 식물의 생존 3 중요하다 스트레스에 의해 조절 될 수 있음을 보여 주었다. 이 연구에서, 이러한 규제를 모니터링, 우리는 스트레스 조건 하에서 성장 식물 반입 용량 평가를 가능하게하기 위해 우리의 엽록체 단리 관내 가져 분석 절차에서 수정. 결과는 엽록체 단백질의 수입 규제에 SP1을위한 중요한 역할을 지적했다. 기존의 생체 외 수입 분석은 표준 MS 한천 배지 6,17,18에서 자란 식물을 사용합니다. 여기에 설명 된 SP1 변이체의 경우에, 종래 분석법은 WT 3 단백질 수입 상대적 차이를 보여주지 않았다. 단백질 오기가 여기에 설명 된 방법 (도 1)를 이용하여 스트레스 조건 하에서 평가한다 그러나 단백질 수입을 조절하는 SP1의 역할은 명백하게 드러난다. 그것은 해요 동안바깥 직접 (방법은 각각 액체 문화와 한천 배지에서 자란 식물을 사용하는 등) 기존의 분석에서 얻은 결과와 스트레스 조건 분석에서 수입 데이터를 비교 할 수없는 경우, 스트레스 아닌 스트레스 조건 사이의 비교가 가능 제공된다 식물 모두 또는 스트레스없이 같은 액체 배양 배지에서 배양된다. 한천 배지에 스트레스 치료와 비교할 때, 액체 배양은 시험관 가져 분석에 필요한 설비의 다수의 치료에 더 편리하다. 또한, 단기 스트레스 치료에 특히 중요하다 모든 식물의 스트레스의 균일 한 적용을 용이하게한다. 여기에 제시된 방법은 만니톨 처리를 사용하여 삼투압 스트레스 연구에 적용했지만, 쉽게 다른 응력 다양한 적응 될 수있다; 예를 들어, 단기 염 스트레스 및 산화 스트레스, 해당하는 스트레스의 b 구려전자 마찬가지로 액체 MS 매체를 통해 적용했다. 응력 다른 형태를 위해, 우리는 응력의 정도가 제 최적화 제안; 지나치게 가혹한 치료는 고립 된 세포 소기관의 수율 및 / 또는 수입 능력에 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. 아래에 설명 된대로 하나, 특별한주의를 기울여야하는 프로토콜 내에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 제조업체에 따라 - (/ V 승, 0.9 % 0.6)를 MS 매체에 대한 최적의 한천 농도는 다를 수 있습니다. 따라서, 경험적 실험을 시작하기 전에 한천 농도를 최적화하는 것을 권장한다. 매체는이 수확 단계 (단계 1.9)에서 조직에 스틱 너무 부드러운 안, 어느 쪽도 그렇게 열심히 식물 뿌리의 발달을 억제하는 것이 없어야합니다. 슈 크로스 농도는 사용되는 식물에 따라 조정될 수있다. (/ V 승) 자당 식물이 잘 성장하는 데 도움이 될 수 있습니다 3 % - 특히 아픈 돌연변이로 작업 할 때, MS 매체는이 보충. 경우 앱스트레스 치료 누워, 상기 액체 매질 (예,&gt; 14 일)까지 매우 오래 식물 전송 좋지 않다. 이전 식물의 뿌리 선진 더 쉽게 양도 중에 손상되기 때문이다. 맥아를 기반으로하는, 토끼 망상에 기반한 : 전사 / 번역 시스템과 관련하여,이 주요 시스템이있다. 이 키트는 선형화 된 플라스미드, unlinearized 플라스미드 또는 PCR 제품 등 다양한 템플릿을 사용할 수있다. 키트는 또한 T3, T7 및 SP6 프로모터에 대한 구체적인이다. 우리가 여기에서 추천하는 키트는 PCR 제품 및 T7 프로모터와 함께 사용에만 적합합니다. 그러나 알 수없는 원인으로,이 시스템을 만든 일부 방사성 표지 preproteins 가져 오기 분석에서 효율적으로 작동하지 않을 수 있습니다; 이러한 경우에, 하나는 맥아 추출물 시스템 또는 플라스미드 템플릿 의미 망상 적혈구 용 해물 시스템 시도 고려할 수있다. 하나는 전사 / 번역 재구성의 결과를 개선시킬 수있다제조자의 지침서에 따라 반응 조건을 수정하여 동작. 그것은 이른 아침에 엽록체 분리를 시작하는 것이 중요하다 (또는 초기 성장 챔버의 광 사이클에서) 그대로 소기관의 분리를 방해 할 수있는 광합성에 엽록체 내부에 전분의 축적을 피하기 위해서이다. 엽록체 분리 과정은 불필요한 지연없이 빠르게 수행되어야하고, 절연 엽록체 항상 저온 유지되어야한다. 이 점차 좋지 않아 자신의 생존 능력을 잃게됩니다 엽록체를 격리 관찰을 완화하는 것입니다. 새로 해동 ​​CIB 또는 HMS 버퍼를 사용하는 경우, 균일 한 용액을 얻기 위해 사용하기 전에 잘 버퍼를 혼합해야합니다. 식물 재료의 균질화를위한 최적 조건을 경험적으로 설정되었고, 다른 조직의 균질화가 사용되는 경우 변할 수있다. 다른 식물의 유전자형은 simila 포함 된 경우R 엽록소 농도는 엽록소 정량화 가져 분석을 수행하기 전에 샘플을 정상화하는 다른 방법으로 사용될 수있다. 엽록소가 80 %에 고립 된 엽록체의 샘플의 추출 다음 분광 광도계 결정될 수있다 (v / v)의 수성 아세톤 (19, 20). 식물의 수입 비율이 (예를 들어, 백화 표현형을 가진 돌연변이)를 비교하는 서로 다른 엽록소 내용을 보여주는 경우, 가져 오기 분석에서 엽록체 샘플을 정상화 계산 엽록체 번호를 사용합니다. 철저하게 단계 3.11에서 엽록체를 재현 탁하는 것이 특히 중요하다. 부족 부유 가져 오기 반응에 올바른로드를 방해합니다 때문에 어려운 정확하게 숫자를 계산하는 것 엽록체의 집계를두고있다. 심한 응집 현미경으로 볼 경우 aggregat까지 얼음 엽록체 샘플을 계속 진탕 (예, 10 엽록체는 접합&gt;과 합산)ES는 제거됩니다. 이 버퍼의 작은 볼륨에서 엽록체를 재현 탁하는 것이 더 쉽습니다. 단백질 가져 오기 반응 (5 절)이 때문에 방사성 특성 적절한 예방 조치로 수행해야 함을 인식하는 것이 중요하다. 필요한주의 사항은 다음과 같습니다 모니터링 및 작업 표면 및 장비의 오염을 제거하고, 허가 된 폐기물 용기에 모든 방사성 폐기물의 처분, 일회용 장갑, 실험실 의류 및 안전 안경을 착용. 또한 올바른 삼투압 가져 오기 반응시 엽록체의 intactness을 유지하기위한 중요한 명심하고, 이것은 주로 HMS 버퍼에 의해 유지된다. 배 HMS 점성이기 때문에, 제 RT까지 예열 한 후 완전히 혼합하고 정확한 양의 측정을 위해 절단 피펫 팁을 사용하여 적용한다. 임포트 반응에서, 차가운 메티오닌 무관 chloropl으로 자유 방사성 표지 메티오닌의 결합을 억제하는 추가배양 단계 동안 organellar 번역 통해 AST 단백질, BSA는 프로테아제에 대한 기질로서 작용하여 단백질 분해를 최소화하기 위해 사용된다.

엽록체는 식물의 녹색 조직에 존재하는 매우 풍부한 소기관이다. 이들은 광합성에서의 중요한 역할 당 이산화탄소를 변환함으로써 지구 (1)에 거의 모든 생활을 지원하는 광 에너지를 사용하는 방법으로 잘 알려져있다. 또한, 엽록체 (와 색소체라고 관련 세포 기관의 폭 넓은 제품군은) 아미노산, 지질, 색소의 생합성 및 중력과 병원체의 도전과 같은 환경 신호의 감지를 포함하여 식물의 다른 많은 중요한 역할을 재생할 수 있습니다. 광합성 특정 상황에서 유용한 역할을 부산물로서 반응성 산소 종 (ROS)을 생성하지만, 경우에 손상 또는 치명적인 영향을 일으킬 수있는 과잉. ROS의 생산 과잉은 특히 불리한 환경 조건에 의해 추진되고, 따라서 엽록체는 밀접하게 같은 염분 및 삼투 스트레스 2와 비 생물 적 스트레스에 대한 반응에 연결되어 있습니다. 장loroplasts은 복잡한 구조를 가지고있다. 각 엽록체는 외부 및 내부 막으로 구성 봉투라는 이중 막 외부 층에 의해 둘러싸여 있습니다. 내부적으로, 광합성의 빛 반응이 일어나는 틸라코이드라는 다른 막 시스템이있다. 두 개의 막 시스템 사이에 수성 구획 통화 탄소 고정에 관여하는 기질,있다. 엽록체는 3,000 ~ 서로 다른 단백질을 포함 할 수 있으며, 이러한 단백질의 대부분은 전구체 형태로 세포질에서 합성되고, 봉투 막 1 전용 단백질 translocons을 통해 세포 기관으로 수입 할 필요가있다. 흥미롭게도, 최근의 연구는 엽록체 단백질 가져 오기가 적극적으로 규제를 나타내면, 그래서 엽록체 프로테옴 통제의 중요한 레벨을 발휘 할 수있다. 예를 들면, 단백질 가져 오기 번째의 풍요의 직접 규제를 통해 비 생물 적 스트레스에 반응 할 수있는 2015 년에보고되었다유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (3)에 의하여 엽록소 (TOC)의 외부 덮개 막에 전자 translocon. 정제 된 엽록체를 사용하여 체외 합성 전구체 단백질에서 단백질 수입은 체외 4,5에서 재구성 할 수 있습니다. 따라서, 시험 관내 방법은 단백질 수입 기계 추정 성분들의 분석, 단백질 수입 및 조절의 기초가되는 메커니즘을 발견하기위한 매우 중요한 접근법왔다 다른 돌연변이 식물 6 수입의 비율을 평가하기 위해 사용될 수있다. 또한, 엽록체는 엽록체 단백질 7,8의 서브 organellar 현지화 및 토폴로지에 대한 연구를 용이하게 할 수 시험관 가져 오기 다음 추가 분류 또는 단백질 분해 효소 분해, 처리 할 수 있습니다. 우리가 설명하는 바와 같이 스트레스에 의한 단백질의 수입 규제를 연구하기 위해, 우리는 우리의 일상 엽록체 분리 방법을 수정 한이리. 중요한 엽록체 8 일 동안 표준 한천 배지 무라 시게 및 스쿡 (MS) 상에 성장하고 상대적으로 짧은 제어 스트레스 처리를 제공 스트레스 보충 MS 액체 배지에 옮기고 있었다 식물로부터 분리 하였다. 스트레스 처리 된 식물에서 분리 된 엽록체의 수율과 역량은 체외 단백질 수입 분석 (3)의 하류와 호환됩니다. 엽록체 분리 프로토콜 외에도 강력한 것으로 입증되었다 3,9-12 널리 사용되는 시험 관내 단백질 수입, 우리의 통상적 인 방법을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>Murashige와 Skoog 기초 소금&nbsp;</td><td>Melford</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>phytoagar</td><td>Melford</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-모르폴리노) 에탄 술폰산(MES)</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>Fisher</td><td>BPE151-500</td><td></td></tr><tr><td>수술용 테이프(예: , Micropore, 3M)</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td>Fisher</td><td>FB59023</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Fisher</td><td>10607095</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>Fisher</td><td>D/0700/53</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄술폰산(HEPES)</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>여과포(Miracloth)</td><td>Calbiochem</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>CFT-595-040M</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 원심분리기 병</td><td>Fisher</td><td>CFT-891-V</td><td></td></tr><tr><td>Polytron (예: , Kinematica PT10-35)</td><td>Fisher</td><td>11010070</td><td></td></tr><tr><td>Polytron probe (예: , Kinematica PTA20S)</td><td>Fisher</td><td>11030083</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 (예: , Beckman Coulter Avanti JXN-26, 50 및 250 mL 튜브용)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34182</td><td></td></tr><tr><td>고정각 로터, 250&nbsp; mL 병 (예: , JLA-16.250)</td><td>Beckman Coulter</td><td>363930</td><td></td></tr><tr><td>고정 각도 로터 50&nbsp; mL 튜브(예: , JA-25.50)</td><td>Beckman Coulter</td><td>363058</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브용 스윙 버켓 로터(><예: , JS-13.1)</td><td>Beckman Coulter</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>radiolabeled [35S] 메티오닌</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG072002MC</td><td></td></tr><tr><td>토끼 망상적혈구 용해물 기반 무세포 번역 시스템(TNT T7 PCR DNA용 퀵 키트)</td><td>Promega</td><td>L5540</td><td></td></tr><tr><td>위상차 현미경 (예: , Nikon Eclipse 80i)</td><td>Nikon</td><td>사용할 수 없는</td><td></td></tr><tr><td>혈구계 (개선된 Neubauer BS748 챔버)</td><td>Hawksley Technology</td><td>AC1000</td><td>깊이 0.1 mm, 1/400 mm2</td></tr><tr><td>cover 안경</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td>22 mm &times; 22 mm, 두께 0.13-0.17 mm</td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로퓨지 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 마이크로퓨지 튜브</td><td>Starlab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>마이크로퓨지><(예: , Eppendorf 5415D)</td><td>Eppendorf</td><td>사용할 수 없음</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 분광 광도계 또는 이와 유사한</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPR-700-310L</td><td></td></tr><tr><td>글루콘산(칼륨염)</td><td>Fisher</td><td>22932-2500</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>메티오닌</td><td>Sigma</td><td>M6039</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>Fisher</td><td>B/P620/44</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher</td><td>S/5200/53</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base&nbsp;</td><td>Melford</td><td>B2005</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어(예: , Aida Image Analyzer)</td><td>Raytest</td><td>사용 불가</td><td></td></tr></tbody></table>

스트레스 식물에서 분리 된 엽록체로 단백질 가져 오기의 분석

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

엽록체는 광합성을하지만 수많은 다른 신진 대사 및 신호 기능뿐만 아니라 포함 식물의 많은 중요한 역할과 세포 기관이다. 또한, 엽록체는 염분 및 삼투 스트레스 등의 다양한 비 생물 적 스트레스에 대한 식물의 반응에 대한 중요하다. 엽록체는 자신의 게놈에 의해 인코딩 된 일부 ~ 3,000 다른 단백질까지 함유 할 수있다. 그러나, 엽록체 단백질의 대부분이 핵으로 인코딩 및 세포질에서 합성하고, 이들 단백질은 엽록체 봉투 막에 translocons 통해 엽록체 내로 가져와야된다. 최근의 연구는 엽록체 단백질 가져 오기가 적극적으로 스트레스에 의해 조절 될 수 있음을 보여 주었다. 생화학 적 스트레스 조건 하에서 단백질 수입 그러한 조절을 조사하기 위해, 우리는 쉽게 실험실에서 달성 될 수있는 신속하고 간단한 방법으로 여기에 설명 된 방법을 개발 하였다. 이 방법에서는, 식물은 일반 공조하에 성장다음 NS와 액체 배양 조건을 스트레스에 노출. 식물 재료를 수집하고, 엽록체는 다음 균질화에 의해 방출된다. 조 균질 그대로 엽록체의 분리를 가능 밀도 구배 원심 분리에 의해 분리된다. 엽록체 수율 계산에 의해 평가되고, 엽록체 intactness는 현미경으로 확인한다. 단백질 가져 오기 분석을 위해, 정제 된 엽록체는 체외 번역 전구체 단백질 35 S의 방사성 표지와 함께 배양하고, 시간 코스 실험은 스트레스 조건에서 유전자형 사이의 수입 비율의 비교를 가능하게하기 위해 실시된다. 우리는 규제 돌연변이에서 엽록체 내로 단백질 수입 비율은 특별히 삼투 스트레스 조건 변경되는 것을 보여준다이 방법을 사용하여 생성 된 데이터를 제시한다.

3 시간 점을 예 엽록체 단백질 가져 오기 실험은 그림 1과 같다. PSAD는 ~ 23 kD의 (16)의 전구체 양식, 나는 기질에 노출 광계의 ~ 18 kD의 구성 요소입니다. 그 정상 수준 WT에 상대적인 SP1 돌연변이에서 증가되므로 PSAD는 돌연변이 3 년 수입 효율의 변화를 제시 스트레스 조건 하에서, 여기서 시험 관내 단백질 가져 분석으로 선정 하였다. SP1의 단백질 - 3 SP1 돌연변이는 엽록체 단백질 수입 기계의 중요한 조정기의 결함을 수행합니다. 정상적인 조건 하에서 성장 식물로부터 분리 엽록체 들어 SP1 및 WT 사이 PSAD 수입에서 명백한 차이는 없었다 (데이타는 도시되지 않음) 3. 그러나, 여기에 설명 된 방법을 사용하여 삼투에서 분리 된 엽록체에 psad는 가져 오기를 평가하기스트레스 식물, 명확한 차이가 감지되었습니다. 우리는 두 유전자형 시간 의존적으로 성숙한 단백질 형태의 축적이 관찰 된 반면, 수입 비율은 이전 결과 (3)와 일치한다 SP1 엽록체 (도 1)보다 WT 엽록체 유의하게 낮았다 계시 스트레스 조건 하에서 PSAD의 엽록체 수입을 규제에서 SP1 단백질의 중요한 역할. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54717/54717fig1.jpg" /> 그림 1. 단백질 가져 오기 분석은 스트레스 조건 하에서 성장 엽록체가 10 일짜리 WT (골-0)에서 분리되었다. 삼투압 스트레스 조건에서 자란 식물에서 분리 된 엽록체와 SP1 돌연변이 애기 장대 식물을 사용하여 전도 (200 mM의 만니톨) 2 일합니다. (A) 단백질 가져 오기를 수행 하였다 [35 S] -methionine 표지 pPsaD 및 SDS-PAGE 및 형광 이미징에 의한 분석하기 전에 4, 8, 12 분 동안 진행하는 것을 허용했다. 병행하여, 시험관 내에서 상기 pPsaD 10 % 입력 제어 번역 단백질 (IVT)을 분석 하였다. 가능성이 잘 리거나 proteolyzed 번역 제품에 해당하는 두 개의 밴드가 사이에있는 동안 자신의 강도가 시간 코스 (*) 동안 변경되지 않았기 때문에 (사전) 성숙 전구체는 (매트) pPsaD의 형태는 표시됩니다. 스트레스 조건 하에서 성장 WT SP1 및 식물 엽록체로 수입 비율을 비교하는 (B)는 A의 수입 성숙 단백질에 대응하는 각 밴드의 강도를 정량 하였다. 모든 데이터는 12 분 후 WT 식물의 엽록체에서 수입 된 단백질의 양을 백분율로 표현된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54717/54717fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서 우리는 스트레스 고립 된 엽록체로 단백질 가져 오기를 연구하는 새로운 방법을 설명합니다. 상기 방법은 신속하고 간단하고 엽록체 단백질 가져올 다른 스트레스 조건의 결과 및 대응하는 조절 메커니즘을 연구에 적용 할 수있다.

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...

본 방법론의 전반적인 목표는 특히 스트레스의 영향에 초점을 맞추어, 핵에서 인코딩된 단백질의 엽록체 내 유입을 연구하는 것입니다. 이 방법은 엽록체 단백질 유입이 어떻게 조절되는지와 같은 엽록체 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 특별한 장점은 스트레스가 엽록체 단백질 유입에 미치는 영향을 평가할 수 있다는 점입니다.이 방법은 모델 식물인 Arabidopsis thaliana에서 사용하도록 개발되었지만, 작물 식물과 같은 다른 시스템에 맞게 수정 및 조정하여 사용할 수 있습니다. 실험 절차의 시연은 본 연구실의 박사후 연구원인 Qihua Ling이 맡아 진행하겠습니다. 먼저, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Arabidopsis 식물을 재배하십시오.식물이 8일 되었을 때 스트레스 처리를 수행합니다. 배양 접시에서 식물을 손으로 조심스럽게 긁어내어, 스트레스 요인이 포함된 액체 MS 배지가 담긴 멸균 플라스크에 옮깁니다. 실험의 성격에 따라 대조군으로서 스트레스 요인이 없는 유사한 플라스크에 추가 식물을 배치하는 것이 필요할 수 있습니다.플라스크 입구를 멸균된 호일로 덮고, 완만한 진동이 있는 오비탈 쉐이커에서 식물을 이틀 더 배양합니다. 50 mL 원심분리관에 Percoll 13 mL, 2배 농도 엽록체 분리 완충액 13 mL, 글루타치온 5 mg을 먼저 혼합하여 연속 밀도 구배를 준비합니다. 그 다음 혼합물을 원심분리합니다.원심분리 후, 밀도 구배가 흐트러지지 않도록 튜브를 주의해서 다루고, 나중에 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 조건당 100 milliliters의 엽록체 분리 완충액을 1 liter 비커로 옮깁니다. 묘목을 체에 부어 액체 배지에서 분리하십시오.그 다음, 엽록체 분리 완충액이 들어 있는 비커로 조직을 옮깁니다. 완충액으로 조직을 헹구어 잔류 배지를 제거한 후, 완충액을 100 milliliters의 신선한 분리 완충액으로 교체합니다. 1차 균질화를 위해 식물 조직을 손으로 50 milliliter 비커에 옮기며, 이때 이전 완충액이 손가락 사이로 빠져나가게 합니다.그 다음 조직 균질기(tissue homogenizer)의 프로브를 조직에 넣고 1~2초 간격으로 두 번 펄스하여 균질화합니다. 균질물을 여과포 두 겹을 통해 250 milliliter 원심분리관에 여과합니다. 마지막으로 여과포를 살짝 짜서 마무리합니다.여과액을 보관하고 식물 조직을 다시 50 milliliter 비커로 옮깁니다. 그런 다음 50 milliliter 비커에 엽록체 분리 버퍼 20 milliliters를 추가로 넣고, 첫 번째 균질화 과정에서 사용하지 않은 나머지 조직을 모두 넣습니다. 균질화 및 여과 단계를 4회 더 반복합니다.혼합된 균질액을 4°C에서 1,000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 직후 펠릿이 섞이지 않도록 주의하며 상층액을 따라냅니다. 튜브를 얼음에 두고 튜브를 부드럽게 흔들어 남은 상층액에 펠릿을 재부유시킵니다.다음으로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 균질액을 수집 튜브의 벽면을 따라 미리 제작된 연속 밀도 구배 상단에 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 브레이크를 끈 상태에서 스윙 버킷 로터를 사용하여 4°C에서 7,800 ×g로 10분 동안 샘플과 밀도 구배를 원심분리합니다. 완료되면 밀도 구배에서 관찰되는 두 개의 녹색 띠를 확인합니다.파손된 엽록체가 포함된 상단 밴드는 버리고, 파스퇴르 피펫을 사용하여 온전한 엽록체가 포함된 하단 밴드를 새로운 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 튜브에 25 milliliters의 HMS 완충액을 넣고 튜브를 두 번 뒤집어 엽록체에서 Percoll을 세척합니다. 그런 다음 튜브를 스윙 버킷 로터에 다시 넣고 엽록체를 재침전시킵니다.상층액을 따라내고, 튜브를 얼음 위에서 부드럽게 흔들어 펠렛을 잔류 완충액에 재현탁합니다. 필요한 경우 HMS buffer를 100~300 µL 추가로 첨가하되, 샘플이 너무 많이 희석되지 않도록 주의하십시오. 재현탁된 엽록체를 얼음 위에 보관합니다.먼저 1.5 mL 튜브에 분리된 엽록체 5 µL를 HMS 완충액 495 µL에 첨가합니다. 튜브를 뒤집어 용액을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 혈구계수기(hemacytometer)의 계수실 위에 커버 글라스를 덮습니다.희석된 엽록체 현탁액 40~60 µL를 커버 글라스와 카운팅 챔버 사이의 틈새에 천천히 피펫팅합니다. 위상차 현미경을 사용하여 20x 대물렌즈로 엽록체를 촬영합니다. 손상되지 않은 엽록체는 둥글고 밝게 보이며 빛의 후광으로 둘러싸여 있습니다.그런 다음 10x 대물렌즈를 사용하여 10개의 큰 격자 내 엽록수 수를 측정합니다. 큰 격자당 엽록수의 평균 수는 10개에서 30개 사이여야 합니다. 엽록수의 수가 너무 적거나 많은 경우, 희석 배수를 조절하여 절차를 반복하십시오.적절한 범위 내에 들어오면, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 밀리리터당 엽록체 수를 계산하십시오. 세 개의 시점을 갖는 시간 경과 실험을 수행하려면, 각각 130 µL의 수입 중지 버퍼(import stop buffer)가 들어 있는 튜브 세 개를 준비하여 얼음 위에 두십시오. 2 mL 튜브에 반응 버퍼와 방사성 표지된 전구체 단백질을 포함하는 수입 반응액을 준비하십시오.테스트할 각 조건당 하나의 반응이 이루어져야 함에 유의하십시오. 시점당 약 10 million 개의 엽록체를 사용하십시오. 반응 튜브를 제한된 양의 빛이 있는 수조에서 25 °C로 배양하십시오.엽록체를 재현탁시키기 위해 가끔 튜브를 톡톡 쳐줍니다. 시계열 분석을 수행하려면, 수송의 선형 범위 내의 필요한 시점에서 반응액을 130 microliter씩 분취합니다. 분취 즉시 각 130 microliter의 분취액을 얼음처럼 차가운 수송 정지 버퍼가 담긴 튜브로 옮긴 후 튜브를 가볍게 두드려 섞어주고, 시계열 분석이 완료될 때까지 튜브를 얼음에 보관합니다.마지막 샘플을 꺼낸 후, Microfuge를 사용하여 모든 샘플을 12,000 ×g에서 30초 동안 원심분리합니다. 그다음 상층액을 제거하고 펠릿을 15 µL의 2x 단백질 로딩 버퍼에 재부유시킵니다. 이후 보텍싱으로 샘플을 혼합합니다.마지막으로, 표준 SDS-PAGE와 방사선 자기법(autoradiography), 형광 사진법(fluorography) 또는 인광 이미지법(phosphorimaging)을 사용하여 전구체 입력 대조군을 포함한 모든 샘플을 분석합니다. PsaD는 광계 I의 18 kilodalton 성분으로, 23 kilodalton의 더 큰 전구체 형태로 합성됩니다. 성숙한 18 kilodalton 형태로 가공되었다는 것은 엽록체 내로의 유입이 일어났음을 나타냅니다.본 연구에서 다룬 Arabidopsis의 sp1 돌연변이체는 엽록체 단백질 수입 장치의 중요한 조절 인자인 sp1 단백질에 결함이 있습니다. 스트레스 조건 하에서 sp1 돌연변이체 엽록체로 수입되는 PsaD 단백질의 양은 야생형에 비해 증가하였으나, 일반적인 비스트레스 조건에서는 그렇지 않았습니다. 두 식물 유전자형의 엽록체 모두에서 PsaD의 성숙 단백질 형태가 시간에 따라 축적되었지만, 수입 속도는 야생형 엽록체보다 sp1 돌연변이체 엽록체에서 유의미하게 더 높았습니다.이러한 결과는 스트레스 조건 하에서 엽록체 단백질 유입을 조절하는 데 sp1 단백질이 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 숙달되면, 엽록체 분리부터 유입 분석 완료까지의 본 방법은 적절하게 수행될 경우 5~6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 엽록체가 최대 활성을 유지할 수 있도록 모든 엽록체 분리 단계를 4 °C에서 수행하는 것이 중요함을 기억하십시오.수십 년 전 처음 개발된 인 비트로(in vitro) 엽록체 단백질 도입 분석법은 해당 분야의 연구자들이 엽록체 단백질 도입 기전의 다양한 측면을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 본 논문에서 제시하는 개선된 방법은 스트레스 조건이 단백질 도입에 미치는 영향에 대한 조사를 가능하게 합니다. 방사성 물질을 다룰 때는 특별한 주의가 필요하다는 점을 잊지 마십시오.본 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑, 실험복 및 보안경 착용과 같은 주의 사항을 준수해야 합니다.

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생물학

기술 비교, 정량 프로테오믹스 방법은 서로 다른 조건에서 multiprotein의 단지의 조성에 대한 통찰력을 얻는 것을 목표로하고 유 전적으로 서로 다른 변종을 비교하여 보여줍니다. 정량 분석​​을 위해 자당 밀도 구배 상이한 분획 같은 부피는 질량 분석법에 의해 혼합되고 분석된다.

multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로<sup&gt; 15</sup&gt; N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

선물이 여기 순수 active thylakoids의 높은 수율 격리에 대 한 프로토콜 및 엽록체 트윈 아르기닌 전 (cpTat), 분 비 (cpSec1), 및 신호 승인 입자 (cpSRP) 경로 대 한 단백질 전송 분석 실험.

생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리

여기는 못 중재 변환 메서드를 사용 하 여 protoplasts로 단백질을 표현 하는 프로토콜에 설명 합니다. 관심, 단백질 및 단백질 현지화 및 다양 한 실험 조건에 대 한 가져오기 프로세스의 효율적인 조사의 쉬운 표현 제공 합니다 vivo에서.

Protoplasts를 사용 하 여 엽록체로 공부 단백질 가져오기

여기 선물이 엽록체의 정화에 대 한 검증 및 테스트 프로토콜 가져오기 단백질 복합물 (복잡 한 TIC TOC) 탭-태그를 사용 하 여. 1 단계 선호도 격리 프로토콜 잠재적으로 어떤 단백질에 적용 될 수 있습니다 그리고 질량 분석에 의해 새로운 상호 파트너를 식별 하는 데.

탭 태그를 사용 하 여 엽록체 Translocon 단백질 복합물의 친 화력 정화

여기, 우리 애기 잎 (봉투, 기질, 그리고 thylakoids), 그들의 세 가지 주요 하위 구획에서 그대로 엽록체를 정화 하는 방법을 설명 차동 centrifugations, 연속 Percoll 기울기의 조합을 사용 하 고 불연속 자당 기온 변화도입니다. 메서드는 subplastidial 및 immunoblotting과 proteomics에 의해 단백질의 subcellular 지 방화에 대 한 귀중 한.

단백질 지 방화 Immunoblotting 또는 단백질의 분석에 대 한 애기에서 엽록체 하위 구획의 준비

여기에 제시된 프로토콜은 리보솜과 관련된 mRNA인 translatome을 자당 밀도 구배 원심분리 를 통해 애기장대 에서 비폴리솜 및 폴리솜 RNA로 분리하기 위한 폴리솜 프로파일링을 포함합니다. 이 방법은 열 스트레스 애기장대(heat-stressed Arabidopsis)의 번역 효율성을 보여줍니다.

열 스트레스 하에서 폴리좀 프로파일을 사용한 translation efficiency test

쿠매시 블리언트 블루 (CBB)의 polyacrylamide 젤의 G - 250로 단백질 얼룩에 대한 짧은 프로토콜은 CBB와 고전적인 얼룩 절차에서와 같이 유기 용제 또는 초산을 사용하지 않고도 설명되어 있습니다.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

함께 비디오 GELFREE 8100 분획화 시스템의 사용, 분자량을 기준으로 파티션 복잡한 단백질 샘플을 설명하고 액상에있는 분수를 복구합니다. 비디오 기술이 사용 방법, 작동 및 fractionated 소 간 homogenate의 polyacrylamide 젤 전기 영동 분석, 결과 데이터를 제공하는 방법에 대해 설명합니다.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

녹색 형광 단백질에 융합을 기반으로 대장균에서 재조합 막 단백질의 발현에 대한 심사에 대한 효율적인 접근 방법이 제시된다.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

배우세요 스트레스 조건에서 엽록체 단백질 가져오기를 분석하는 방법을 Arabidopsis thaliana를 사용하여. 이 기술은 식물 생물학 및 스트레스 생리 연구에 활용됩니다.

스트레스 식물에서 분리 된 엽록체로 단백질 가져 오기의 분석

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