스트레스 식물에서 분리 된 엽록체로 단백질 가져 오기의 분석

이 방법론의 전반적인 목표는 스트레스의 영향에 특히 초점을 맞추고 핵으로 인코딩된 단백질을 엽록체로 가져오는 방법을 연구하는 것입니다. 이 방법은 엽록체 단백질 수입이 어떻게 조절되는지와 같은 엽록체 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 특별한 장점은 엽록체 단백질 수입에 대한 스트레스의 영향을 평가할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 모델 식물 Arabidopsis thaliana와 함께 사용하기 위해 개발되었지만 작물과 같은 다른 시스템과 함께 사용하기 위해 수정 및 조정할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Qihua Ling입니다. 시작하려면 먼저 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 애기장대 식물을 재배합니다.

그런 다음 식물이 8일이 되면 스트레스 치료를 수행합니다. 한천 플레이트에서 식물을 손으로 부드럽게 긁어내고 스트레스 요인이 포함된 액체 MS 매체의 멸균 플라스크에 넣습니다. 실험의 성격에 따라 스트레스 요인이 없는 유사한 플라스크에 대조군으로 추가 식물을 배치하는 것도 필요할 수 있습니다.

플라스크 입구를 멸균 호일로 덮고 부드럽게 흔들면서 오비탈 셰이커에서 식물이 더 이틀 동안 자랄 수 있도록 합니다. 먼저 50ml 원심분리 튜브에 13ml의 Percoll, 13ml의 2개의 x 엽록체 분리 완충액, 5mg의 글루타티온을 혼합하여 연속 밀도 구배를 준비합니다. 그런 다음 혼합물을 원심 분리하십시오.

원심분리 후에는 구배를 방해하지 않도록 튜브를 조심스럽게 다루고 나중에 사용할 수 있도록 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 조건당 100ml의 엽록체 분리 완충액을 1리터 비커로 옮깁니다. 액체 매체에서 묘목을 체에 밀어 넣습니다.

그런 다음 엽록체 분리 완충액이 들어 있는 비커로 옮깁니다. 완충액으로 조직을 헹구어 잔류 매체를 제거한 다음 완충액을 100ml의 새 분리 완충액으로 교체합니다. 첫 번째 균질화의 경우 식물 조직을 손으로 50ml 비커로 옮겨 이전 완충액이 손가락을 통해 배출되도록 합니다.

다음 조직 균질화기의 조사를 조직으로 두고 각각 1개에서 2 초의 2개의 맥박으로 균질화하십시오. 두 겹의 여과 천을 통해 균질액을 250ml 원심분리기 튜브로 여과합니다. 천을 부드럽게 짜서 마무리합니다.

여과액을 유지하고 식물 조직을 50ml 비커로 다시 옮깁니다. 그런 다음 두 번째 20ml의 엽록체 분리 완충액을 50ml 비커에 넣고 첫 번째 균질화에서 사용되지 않은 나머지 조직을 추가합니다. 균질화 및 여과 단계를 4회 더 반복합니다.

1, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 000 시간 g에 모인 균질산물을 분리기. 원심분리 직후 상층액을 붓고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 튜브를 얼음 위에 놓고 튜브를 부드럽게 교반하여 잔류 상층액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

다음으로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 수용 튜브의 벽을 통해 미리 만들어진 연속 밀도 구배의 상단으로 균질산염을 부드럽게 옮깁니다. 그런 다음 브레이크를 끈 상태에서 섭씨 4도에서 10분 동안 7, 800회 g의 스윙 버킷 로터에서 샘플과 기울기를 원심분리합니다. 완료되면 그라디언트에서 볼 수 있는 두 개의 녹색 띠를 관찰합니다.

깨진 엽록체가 들어 있는 위쪽 밴드를 버리고 파스퇴르 피펫을 사용하여 손상되지 않은 엽록체가 들어 있는 아래쪽 밴드를 새 50ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 25ml의 HMS 완충액을 튜브에 넣고 튜브를 두 번 뒤집어 엽록체에서 Percoll을 씻어냅니다. 그런 다음 튜브를 스윙 버킷 로터에 다시 넣고 엽록체를 다시 펠릿화합니다.

상층액을 붓고 얼음 위에서 튜브를 부드럽게 교반하여 펠릿을 잔류 완충액에 다시 현탁시킵니다. 필요한 경우 100-300마이크로리터의 HMS 버퍼를 추가하되 샘플을 너무 많이 희석하지 마십시오. 재현탁된 엽록체를 얼음 위에 보관하십시오.

1.5 밀리리터 튜브에 있는 495 마이크로리터의 HMS 버퍼에 5마이크로리터의 분리된 엽록체를 추가하는 것으로 시작합니다. 튜브를 뒤집어 용액을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 혈구계의 계수 챔버 위에 덮개 유리를 놓습니다.

40-60 마이크로리터의 희석된 엽록체 현탁액을 커버 유리와 계수 챔버 사이의 틈으로 천천히 피펫팅합니다. 위상차 현미경을 사용하여 20x 대물렌즈로 엽록체를 이미지화합니다. 온전한 엽록체는 둥글고 밝게 보이며 빛의 후광으로 둘러싸여 있습니다.

그런 다음 10x 대물렌즈를 사용하여 10개의 큰 사각형에 있는 엽록체의 수를 계산합니다. 큰 정사각형당 엽록체의 수는 평균 10개에서 30개 사이여야 합니다. 엽록체가 너무 적거나 너무 많으면 희석 계수를 조정하고 절차를 반복하십시오.

적절한 범위 내에 있으면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 밀리리터당 엽록체의 수를 계산합니다. 세 개의 타임 포인트가 있는 타임 코스를 실행하려면 각각 130마이크로리터의 수입 스톱 버퍼 분취액이 들어 있는 3개의 튜브를 준비하고 얼음 위에 둡니다. 2밀리리터 튜브에서 반응 완충액과 방사성 표지된 전구체 단백질을 포함하는 수입 반응을 준비합니다.

테스트할 각 조건에 대해 하나의 반응이 있어야 합니다. 시점당 약 1,000만 개의 엽록체를 사용합니다. 반응 튜브를 섭씨 25도의 제한된 양의 빛 아래 수조에서 배양합니다.

때때로 엽록체를 다시 현탁시키기 위해 튜브를 튕깁니다. 선형 수입 범위 내에서 필요한 시점의 반응에서 130 밀리리터 분취량으로 시간 과정을 수행합니다. 회수 즉시 각 130마이크로리터 분취액을 튜브를 가볍게 두드려 혼합된 얼음처럼 차가운 수입 정지 버퍼 튜브에 옮기고 시간 과정이 완료될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

마지막 샘플이 제거되면 Microfuge에서 12, 000회 g으로 30초 동안 모든 샘플을 원심분리하십시오. 다음으로, 상등액을 버리고 펠릿을 15마이크로리터의 2개의 x 단백질 로딩 버퍼에 재현탁합니다. 그런 다음 볼텍싱으로 샘플을 혼합합니다.

마지막으로, 표준 SDS-PAGE 및 자가방사선 촬영, 형광 촬영 또는 인광을 사용하여 모든 샘플과 전구체 입력 제어를 분석합니다. PsaD는 23 킬로달톤의 더 큰 전구체로 합성된 광계 I의 18킬로달톤 구성 요소입니다. 성숙한 18 킬로달톤 형태로 가공하는 것은 엽록체로의 수입이 발생했음을 나타냅니다.

여기에서 연구된 애기장대의 sp1 돌연변이는 엽록체 단백질 수입 기계의 중요한 조절자인 sp1 단백질에 결함을 가지고 있습니다. 스트레스 조건에서는 sp1 돌연변이 엽록체로 유입되는 PsaD 단백질의 양이 야생형에 비해 증가하지만, 스트레스가 없는 정상적인 조건에서는 그렇지 않습니다. PsaD의 성숙한 단백질 형태는 두 식물 유전자형의 엽록체와 함께 시간 의존적 방식으로 축적되었지만, sp1 돌연변이 엽록체의 수입 비율은 야생형 엽록체보다 훨씬 높았습니다.

이러한 결과는 스트레스 조건에서 엽록체 단백질 수입을 조절하는 데 sp1 단백질이 중요한 역할을 한다는 것을 의미합니다. 일단 숙달되면 엽록체 분리에서 수입 분석 완료까지 이 방법을 적절하게 수행할 경우 5-6시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 엽록체가 최대한의 활동을 유지하도록 하기 위해 모든 엽록체 분리 단계를 섭씨 4도에서 수행해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

수십 년 전 초기 개발 이후, 체외 엽록체 단백질 수입 분석법은 이 분야의 연구자들이 엽록체 단백질 수입 메커니즘의 다양한 측면을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 여기에 제시된 개선 사항을 통해 단백질 수입에 대한 스트레스 조건의 영향을 조사할 수 있습니다. 방사성 물질로 작업할 때는 특별한 주의가 필요하다는 것을 잊지 마십시오.

이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑, 실험복 및 보안경 착용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.