에서 재조합 효소 중재 카세트 교환에 의해 재조합 인간 다 능성 줄기 세포의 신속하고 효율적인 생성 AAVS1 로커스

이 절차의 전반적인 목표는 플립파제(flippase), 재조합효소 매개 카세트 교환 접근법(RMCE)을 사용하여 인간 만능 줄기세포 또는 인간 PSC의 AAVS1에서 빠르고 효율적인 표적 게놈 편집을 수행하는 것입니다. RMCE는 AAVS1 유전자 자리에 염기서열의 표적 삽입을 개선하며, 이는 과발현 또는 넉다운에 의한 분자의 기능에 대한 신속한 테스트를 가능하게 하기 때문에 줄기세포 생물학에 매우 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 PSC 라인에 무작위 통합 이벤트가 없고 여전히 만능이며 단 15일 만에 정상 핵형을 생성할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 AAVS1 유전자 자리에서 형질전환 유전자 변형에 유용한 도구를 제공하지만 다른 인간 허용 유전자좌에도 적용할 수 있습니다. 먼저 6개의 웰 플레이트에서 불활화 마우스 배아 섬유아세포 또는 iMEF의 표준 절차에 따라 인간 PSC 마스터 세포주를 배양합니다. 세포가 60%에서 70%에 도달하면 먼저 0.1% 젤라틴 용액을 사용하여 12웰 플레이트의 필요한 웰을 코팅하고 플레이트를 실온에서 5분 동안 배양하여 약물 내성 iMEF

그런 다음 웰당 125, 000 iDR4를 플레이트화하고 iMEF 배지로 하룻밤 동안 배양물을 배양합니다. 다음 날, 10 micromolar ROCK Inhibitor를 포함한 새로운 배지로 인간 PSC 배양물을 섭씨 37도에서 1시간 동안 사전 배양합니다. 그 동안, 인간 ESC 형질주입 용액과 세포 해리제를 실온으로 가져갑니다.

핵 펙션 조건당 1ml의 핵 펙션 도금 배지를 준비합니다. 그런 다음 웰에서 iDR4 배지를 제거하고 실온 PBS 1ml를 사용하여 세포를 세척하고 핵 펙션 도금 배지를 추가합니다. 도금 매체 샘플당 500마이크로리터를 멸균 1.5ml 튜브로 옮기고 도금할 때까지 섭씨 37도에서 보관합니다.

단일 세포 현탁액에서 인간 PSC를 분리하려면 배지를 제거하고 실온 PBS를 사용하여 세포를 세척한 다음 공급장치 또는 공급자가 없는 hPSC 배양에 각각 1ml의 0.05% 트립신 또는 아큐타아제를 첨가합니다. 섭씨 37도에서 배양물을 배양합니다. 다음으로, 인큐베이터에서 플레이트를 조심스럽게 제거하고 세포가 분리되지 않도록 해리제를 흡인하고 1ml의 인간 PSC 배지를 추가합니다.

거품 형성을 피하면서 플레이트 표면의 매체를 부드럽게 세척하여 느슨한 세포를 해리합니다. 깨끗하고 멸균된 15 또는 50 밀리리터 튜브에 단일 세포 현탁액으로 세포를 수집합니다. 그런 다음 1ml의 hESC 배지를 사용하여 세포를 세척하고 동일한 튜브에 수집합니다.

계수를 위해 50마이크로리터의 세포 현탁액 분취액을 취하고 나머지 세포를 실온에서 300배g로 5분 동안 원심분리합니다. 현탁액이 원심분리되는 동안 세포 계수 장치로 세포를 계수합니다. 상층액을 제거하고 실온 PBS를 사용하여 세포 색상을 10에서 밀리리터당 6번째 셀로 부드럽게 재현탁합니다.

그런 다음 실험 조건당 2밀리리터를 옮겨 멸균 15밀리리터 튜브를 세척하고 원심분리를 반복합니다. 샘플이 회전하는 동안 2.5 마이크로그램의 플립파제 플라스미드를 사용하여 0:1, 2:1 및 2:0 공여체 플립파제 분자 비율이 있는 3개의 깨끗한 1.5 밀리리터 튜브에 플라스미드 혼합물을 준비합니다. 핵 절제를 진행하려면 인큐베이터에서 iDR4 플레이트와 도금 매체가 있는 1.5ml 튜브를 제거합니다.

펠릿을 방해하지 않고 한 번에 하나의 튜브를 PBS에서 조심스럽게 피펫으로 분리하여 버퍼를 최대한 많이 제거합니다. 100마이크로리터의 트랜스펙션 용액을 사용하여 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 재현탁시킵니다. 그런 다음 플라스미드 혼합물이 들어 있는 1.5ml 튜브로 세포 현탁액을 옮기고 부드럽게 혼합합니다.

세포 DNA 혼합물을 tranfector 큐벳으로 옮기고 기포가 생기지 않도록 주의합니다. nucleofector 장치에 큐벳을 삽입하고 feeder에서 배양된 세포에 대해 프로그램 A13을 실행하거나 feeder-free transfection에 대해 F16을 실행합니다. 큐벳을 제거하고 키트에 있는 일회용 전사 피펫을 사용하여 큐벳에 0.5ml의 도금 매체를 부드럽지만 빠르게 한 번의 움직임으로 추가합니다.

그런 다음 동일한 방식으로 부피를 회수하고 iDR4와 도금 매체가 들어 있는 12웰 플레이트에 적하 방식으로 플레이트합니다. 배양 접시를 인큐베이터의 선반에 놓고 천천히 앞뒤로, 좌우로 움직여 세포 현탁액을 고르게 분포시킵니다. 배지를 교체하기 전에 24시간 동안 접시를 배양하십시오.

transfection 후 2-3일 후에 선택을 시작합니다. 배지를 흡인하고 PBS 1ml를 사용하여 세포를 세척한 다음 퓨로마이신 100나노그램이 함유된 인간 ESC 배지를 추가합니다. 세포 성장을 관찰하고 그에 따라 퓨로마이신 농도를 밀리리터당 최대 250나노그램까지 증가시키고 7일 동안 퓨로마이신 선택을 계속합니다.

퓨로마이신 선별 3-4일 후, 0.5 마이크로몰 피알루리딘 또는 FIAU로 선별을 시작합니다. 매체를 매일 변경하고 연속 7일 이상 FIAU를 유지하지 않습니다. 선택 완료 후 14일에서 15일 경에 저항성 RMCE 군집이 존재하여 새로운 RMCE 계통을 구성합니다.

표준 절차에 따라 셀을 1:2 비율로 분할합니다. Key 1의 웰이 분할할 준비가 되면 앞서 비디오에서 설명한 대로 특성화를 위해 웰을 단일 세포 현탁액으로 해리하고 15ml 튜브에 세포를 수집합니다. 실온에서 300g의 속도로 5분 동안 세포를 스핀다운합니다.

그런 다음 1ml의 PBS를 사용하여 세포를 재현탁하고 샘플을 둘로 분할합니다. 하나는 세포 스트레이너를 사용하여 유세포 분석을 수행하여 필터링하고 다른 하나는 텍스트 프로토콜에 따라 DNA 분석을 수행합니다. flippase recombinase 및 tdT RMCE donor를 사용한 transfection 후, hPSC는 iDR4 MEF 층에 고르게 분포된 작은 세포 그룹을 형성하고 구성적 GFP 및 일시적 tdT를 발현했습니다.

puromycin을 사용한 positive selection은 RMCE donor insert를 선호하고, TK가 결핍된 FRT 매개 재조합 이벤트만 FIAU를 사용한 Negative selection을 선호합니다. transfection 후 6일째 경에 RMCE GFP 음성, tdT 양성 세포의 작은 클러스터를 확인할 수 있습니다. 여기에서 입증된 바와 같이, GFP 음성, tdT 양성 RMCE 콜로니는 RMCE 공여체와 플립파제가 모두 사용되는 경우에만 존재하는 반면 RMCE는 플립파제가 없을 때 발생하지 않습니다. 비클론 세포 집단에 결합된 퓨로마이신 및 FIAU 내성 RMCE 콜로니인 새로 생성된 RMCE 라인의 유세포 분석 특성화는 세포의 100%가 RMCE GFP 음성, tdT 양성 표현형을 나타내는 것을 확인합니다.

hPSC에서 기록자 활성이 없는 RMCE 공여체를 사용하면 세포의 100%가 GFP 음성입니다. 여기에 표시된 비클론 RMCE 라인의 PCR 특성 분석은 전체 카세트 교환을 보여주며 사용된 선택 프로그램이 RMCE 공여체와 flippase 발현 벡터 모두의 무작위 통합이 없는 라인을 생성함을 보여줍니다. 요약하면, 이 RMCE 방법은 표적 뉴클레아제와 비교하여 정의된 유전자 자리에 대한 hPSC의 유전자 편집을 크게 단순화합니다.

이 기술을 마스터하면 15일 안에 완료할 수 있습니다. 따라서 RMCE는 동종 환경에서 비교 연구를 가능하게 하는 매우 빠른 유전자 편집 도구입니다. 이 절차를 사용할 때는 30% 이상의 transfection 효율을 유지하고 적절한 코어 스토리지 선택제를 preformize하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 인간 PSC의 AAVS1 유전자 자리에서 RMCE를 수행하는 방법과 재조합 라인을 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.