Name: 자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 학습하세요 iPSC에서 항원 특이 조절 T세포를 생성하는 방법을 자가 면역 관절염 면역치료를 위해. 이 기술은 균일한 세포군을 제공하여 연구자들의 치료 효율성 향상에 도움을 줍니다.

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이 프로젝트는 건강 (R01AI121180, R21AI109239 및 K18CA151798), 미국 당뇨병 협회 (American Diabetes Association)의 국립 연구소에서 보조금에서 부분적으로 투자되었다 (16-IBS-281), 건강의 펜실베니아 부 (담배 결제 자금)에 JS

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이 프로토콜에서 중요한 단계는 TCR / Foxp3의 유전자 형질 iPSCs의 체외 분화된다. 시험관 노치 신호는 T 세포 계통으로의 개발을 유도한다. CD4 + Foxp3의 + Tregs에 iPSCs를 구별하기 위해, 우리는 OP9-DL1 / DL4 / IA의 B 세포, 매우 빠른 MHC II (IA 나) 분자를 사용했다. iPSCs 대부분은 CD4 + 세포로 분화. 그러나, 표면 TCR 발현 후 많은 분화 이전 T 세포 분화 결국 죽게 할 수있는 능력을 잃는다. 그 결과, IPSC 유래 기능성 Tregs의 셀 수가 대폭 체외 분화 4 주 후에 감소시킨다. 이를 방지하기 위해, IL-2의 첨가는 그 시점에서 세포 생존을 향상시킬 수있다. 다른 방법은 마우스에 주 동안 시험 관내에서 분화 한 프리 Tregs을 전송 AG-특정 사전 Tregs의 성숙 및 생존을 구동하도...

자가면역 관절염은 활막 조직의 증식과 관절 연골, 뼈 및 인대의 점진적인 파괴를 특징으로 하는 전신 질환입니다1. 자가면역 관절염에서 Tregs의 결함 생성 또는 기능은 Tregs가 자가 반응성 면역 세포의 발달을 예방하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 만성 염증 및 조직 손상에 기여합니다. 
Tregs의 조작은 Ag 의존적 방식으로 염증을 억제하는 치료법 개발에 이상적인 전략입니다. Treg 기반 면역요법의 경우, 전달된 Tregs의 특이성은 진행 중인 자가면역2의 치료에 중요합니다. 억제 활성을 나타내기 위해, Tregs는 영향을 받은 부위에서 이동하고 유지되어야 하며, 이는 해당 위치에서 Ag에 대한 TCR의 특이성에 의해 지시될 수 있습니다3. 다클론 Treg는 TCR에서 이러한 Ag 특이성을 포함하는 작은 집단을 포함할 수 있지만 이러한 Ag 특이적 Tregs의 수는 일반적으로 낮습니다. 결과적으로, 자가면역 질환에 대한 다클론 Tregs를 사용하는 세포 기반 치료법은 많은 수의 Treg의 채택 전달을 필요로 합니다4,5. 만능줄기세포(PSC)는 모든 유형의 세포로 발달할 수 있는 능력이 있기 때문에 Ag 특이적 PSC-Tregs는 Treg 기반 면역요법에 적합한 후보가 될 수 있습니다. 이전 연구에서는 Tregs6-8을 포함한 PSC 유래 T 세포의 성공적인 발달을 보여주었습니다. 
여기에서는 Ag 특이적 iPSC-Tregs를 개발하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 우리는 또한 이러한 Tregs를 사용하여 쥐 모델에서 자가면역 관절염의 세포 기반 요법을 설명합니다. 이 방법은 Ag 특이적 TCR과 전사 인자 FoxP3를 가진 유전적으로 변형된 쥐 iPSC를 기반으로 합니다. 그런 다음 엔지니어링된 iPSC는 사이토카인 mFlt3L 및 mIL-7의 존재 하에서 Notch ligands DL1, DL4 및 MHC-II(I-Ab) 분자를 발현하는 OP9 기질 세포에서 Ag 특이적 Tregs로 분화합니다. 이러한 Ag 특이적 iPSC-Tregs는 Ag로 자극될 때 TGF-β 및 IL-10과 같은 억제성 사이토카인을 생성할 수 있으며, 이러한 Tregs의 채택 전달은 쥐 모델에서 AIA 발달을 억제할 수 있습니다. 설명된 프로토콜은 잠재적인 치료 개입을 위한 줄기세포 유래 Ag 특이적 Tregs를 개발하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6j 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7 Rag1tm1Mom/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2216</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (2C11) 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD28 (37.51) 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (GK1.5) 항체</td><td>Biolegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8 ( 53&ndash; 6.7) 항체</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD25 (3C7) 항체</td><td>Biolegend</td><td>101912</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR-&beta; (H57597) 항체</td><td>Biolegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL10</td><td>Biolegend</td><td>505010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TGF&beta;</td><td>Biolegend</td><td>141402</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Genejammer</td><td>Integrated science</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 완충액</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148-500G</td><td>주의: 알레르기성, 발암성, 독성</td></tr><tr><td>투과화 완충액</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>421002</tr><tr><td>mBSA</td><td>시그마</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>OVA 알부민</td><td>Avantor</td><td>0440-01</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>Difco</td><td>2017014</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner 억제</td>기 <td>Braintree Scientific</td><td>RTV 150-STD</td><td></td></tr></tbody></table>

자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 t 세포의 발달

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

자가 면역 질환으로 인해 면역 자기 관용의 손실이 발생한다. 규제 T 세포 (Tregs)는 면역 자기 관용의 중요한 매개체이다. 말초 혈액 순환 그 Tregs 2 % - 1과, 마우스 및 인간 성숙 CD4 + T 세포 개체군의 10 % - 약 5 Tregs를 나타낸다. 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)은 전위가자가 면역 질환의 세포 기반 치료에 사용할 수있는 기능 Tregs로 분화 될 수있다. 여기서는 iPSCs에서 항원은 (Ag) 특이 Tregs (즉, IPSC-Tregs)를 개발하기위한 방법을 제시한다. 상기 방법은 iPSCs으로 전사 인자 Foxp3의 및 AG-특정한 T 세포 수용체 (TCR)를 포함하고 노치 발현 OP9 간질 세포 분화에 기초하여 델타 형 (DL) 1 DL4 리간드. 체외 분화 후, IPSC-Tregs는 CD4, CD8, CD3, CD25, Foxp3를하고, AG-특정 TCR을 표현하고의 Ag 자극에 응답 할 수 있습니다.이 방법은 성공적 뮤린 모델에서자가 면역 관절염 세포 기반 치료에 적용되고있다. AG-유도 관절염 (AIA) -bearing 마우스로 이러한 AG-특정 IPSC - Tregs의 입양 전송은 관절 염증을 감소하고 붓기와 뼈 손실을 방지 할 수있는 능력을 가지고 있습니다.

28 일에, 다음과 같이),은 (Ag 특정 Tregs는 실질적으로 CD3과 AG-특정 TCR,이 T 세포 마커를 표명했다. CD3 + TCRVβ5 + 인구는 CD4를 표명했다. 일반적으로 자연적으로 T의 REGS (nTregs)를 발생 및 ectopically Foxp3를 표현 T 세포에서 높은 수준으로 발현된다 또한 CD25, CD127, 및 CTLA-4를 표현 CD3 + TCRVβ5 + CD4 + 세포의 대부분. 유동 세포 계측법 (도 1)에 의해 분석하여 세포 내 염색으로 검출되는 IPSC 유래 세포 Foxp3를 발현 노치 리간드 관내 자극 후에도 장기간 지속되었다. IPSC-Tregs 잠재적 억제 활동했다 나타내는 AG-펄스 비장 세포 (도 2)와 함께 생체 외에...

여기서는 쥐 모델에서 자가면역 관절염의 면역 요법을 위해 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 기능적 항원(Ag) 특이적 조절 T 세포(Tregs)를 개발하는 방법을 제시합니다.

자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

이 실험의 전반적인 목표는 자가면역성 관절염의 면역 요법을 위해 줄기세포 유래의 염증성 관절 관련 조절 T 세포를 생성하는 새로운 방법을 개발하는 것입니다. 이 방법은 자가면역성 관절염에 대한 잠재적 면역 치료제라는 자가면역 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 줄기세포 유래 조절 T 세포가 정형화되어 있으며 단일 유형이라는 점입니다.먼저 관심 있는 피더 세포를 OP9 배지에서 최소 밀도 1 × 10⁴ cells/cm²가 되도록 희석하고, 10 cm 디쉬당 1 × 10⁶개의 피더 세포를 플레이팅합니다. 세포가 80~90% 합쳐졌을 때(confluent), 배양액의 배지를 제거하고 각 디쉬에 레트로바이러스로 형질전환된 유도만능줄기세포(iPSCs) 0.5~1 × 10⁵개를 OP9 배지와 함께 파종합니다. 5일 후, 배지를 흡입하여 제거하고 10 mL의 PBS로 세포를 세척합니다.그런 다음, 디시당 4 mL의 Trypsin을 사용하여 37 °C에서 세포를 탈착합니다. 10분 후, 8 mL의 IPSC 배지를 가해 반응을 중단시키고 원심분리를 위해 세포를 수집합니다. 펠릿을 10 mL의 신선한 IPSC 배지에 재현탁하고, 새로운 10 cm 디시에 세포를 재배양합니다.피더 세포가 플레이트에 부착되도록 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 둡니다. 그 후, 부유 상태의 IPSC를 수집하고 형질전환된 세포를 70 µm 스트레이너로 걸러 세포 수를 측정합니다. Murine-Flt3-Ligand가 첨가된 OP9 배지가 들어있는, 80~90% 정도로 합류(confluent)된 새로운 피더 세포 플레이트에 5×10⁵개의 IPSC를 접종하고 배양물을 인큐베이터로 옮깁니다.3일 후, 10 mL 피펫을 사용하여 배양 접시를 배양액으로 세척합니다. 그런 다음, 접시에 신선한 OP9 배지 5 mL를 추가하고, 피더 세포층을 손상시키지 않도록 주의하면서 신중하고 강하게 피펫팅하여 반부착성 iPSC를 조심스럽게 씻어냅니다. 10 mL의 PBS로 세척 과정을 반복하여 남은 반부착성 세포를 수확하며, 각 접시의 세척액을 배양당 하나의 원추형 튜브에 모읍니다.세포를 원심 분리한 후, Murine-Flt3-Ligand와 IL-7이 첨가된 OP9 배지 10 milliliters에 펠렛을 재현탁하고 70 micron 스트레이너로 세포를 여과합니다. 80 내지 90%confluent한 피더 세포 단층이 포함된 6-웰

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

규제 T 세포 : 이식 거부와 유형 나는 당뇨병 치료를위한 치료 가능성

우리는 한 인간의 혈액 기증자로부터 규제, 메모리 및 나이브 T 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 편광 Tregs 그때도 여기에 설명된 억제 분석을 포함한 유전자 균질성와 유전 및 기능 다양한 어플 리케이션의 다른 하위 집합을 비교할 수 있습니다.

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 세포로부터 T lymphocytes의 생성은 T 세포 기반 immunotherapy에 대한 배아 줄기 세포를 사용하는 대체 방식을 제공합니다. 방법 중 하나를 이용하여...

T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

이 비디오는 마우스의 자가면역 관절염에 대한 세포 기반 치료법을 보여줍니다. 오브알부민 특이적 수용체를 발현하는 iPSC 유래 T 조절 세포에 보조제에서 유화된 메틸화된 소 혈청 알부민(mBSA)을 주입합니다. 쥐 항원제시세포(APC)는 mBSA를 처리하여 T세포에 전달하여 T세포가 활성화되고 무릎 관절의 활액막으로 이동하도록 유도합니다. 후속 주사에는 왼쪽 무릎에 mBSA만 투여하고 오른쪽 무릎에 mBSA와 오브알부민을 조합하여 투여합니다. 왼쪽 무릎에서는 mBSA에 대한 면역 반응이 관절염을 유발하는 반면, 오른쪽 무릎에서는 오브알부민과 상호 작용하는 T 조절 세포가 염증을 완화하여 관절염 증상을 개선합니다.

쥐 모델에서 자가면역 관절염에 대한 세포 기반 치료법

순진 CD4 콕 사키 아데노 바이러스 수용체의 유전자 발현과 T 세포에 아데노 바이러스 유전자 전달은 규제 T 세포 분화의 분자 분석을...

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

본 문서에서는 3차원(3D) 흉선 배양 시스템에 의해 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 흉선 이주자(iTE)를 생성하는 새로운 방법을 설명한다. iTE는 증식, 기억 형성 및 종양 억제 능력을 가진 순진한 T 세포와 밀접하게 관련된 T 세포의 균질한 서브세트이다.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

본 호는 시험관 내 및 생체 내에서 사용하기 위해 많은 수의 기능성 T 세포를 산출하는 것을 목표로 항원 특이적 CD8 T 세포의 생성및 시험관 내 확장에 대한 프로토콜을 설명합니다.

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

이 문서에서는 OP9/DLL1 공동 배양 시스템을 사용하여 기능성 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 CD8αβ+ 단일 양성 T 세포를 생성하는 방법을 설명한다.

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

여기에 제시된 것은 줄기세포 유래 바이러스 항원(Ag)-특이적 T 림프구의 입양세포 전달(ACT)을 이용하여 마우스에서 B형 간염 바이러스(HBV) 복제의 효과적인 억제를 위한 프로토콜이다. 이 절차는 HBV 감염의 잠재적인 ACT 기지를 둔 면역 요법을 위해 적응될 수 있습니다.

줄기 세포 유래 바이러스 Ag 특이적 T 림프구는 마우스에서 HBV 복제를 억제

이 프로토콜은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하고 테스트하기 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다.

인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포의 생성

학습하세요 iPSC에서 항원 특이 조절 T세포를 생성하는 방법을 자가 면역 관절염 면역치료를 위해. 이 기술은 균일한 세포군을 제공하여 연구자들의 치료 효율성 향상에 도움을 줍니다.

자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

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