자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달
2016년 11월 8일
여기서는 쥐 모델에서 자가면역 관절염의 면역 요법을 위해 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 기능적 항원(Ag) 특이적 조절 T 세포(Tregs)를 개발하는 방법을 제시합니다.
이 실험의 전반적인 목표는 자가면역 관절염에 대한 면역 요법을 위해 줄기 세포 유래 염증 관절 관련 조절 T 세포를 생성하는 새로운 방법을 개발하는 것입니다. 이 방법은 자가면역 관절염에 대한 잠재적인 면역 요법에 대한 자가면역 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 줄기 세포 유래 조절 T 세포가 nyped이고 단일 유형이라는 것입니다.
먼저 관심 피더 셀을 OP9 배지에서 제곱센티미터당 네 번째 셀의 10배의 최소 밀도로 희석하고, 10cm 접시당 6번째 피더 셀에 10을 1배 도금합니다. 세포가 80-90% 융합이 되면 배양물에서 배지를 제거하고 각 접시의 OP9 배지에 0.5-1배 10-5배를 소급바이러스로 형질전환한 유도만능 줄기세포 또는 IPSC를 파종합니다. 5일 후, 배지를 흡인하고 10ml의 PBS로 세포를 세척합니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 접시당 4ml의 트립신으로 세포를 분리합니다. 10분 후 8ml의 IPSC 배지로 반응을 중지하고 원심분리를 위해 세포를 당깁니다. 펠릿을 10밀리리터의 새 IPSC 배지에 재현탁시키고 세포를 새 10cm 접시에 다시 플레이팅합니다.
세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 feeder cell이 plate에 부착되도록 합니다. 그런 다음 부유 IPSC를 수집하고 계수를 위해 70미크론 스트레이너를 통해 형질도입된 세포를 필터링합니다. Murine-Flt3-Ligand가 보충된 OP9 배지의 새로운 80-90% confluent plate에 10-5번째 IPSC를 5번 파종하고 배양액을 인큐베이터로 되돌립니다.
3일 후, 10ml 피펫을 사용하여 배양 배지로 접시를 씻습니다. 그런 다음 5ml의 새로운 OP9 배지를 접시에 넣고 공급세포층을 방해하지 않는 신중하고 강력한 피펫팅으로 반접착성 IPSC를 부드럽게 씻어냅니다. 10ml의 PBS로 세척을 반복하여 마지막 반접착 세포를 수확하여 각 접시의 세척액을 배양당 하나의 원뿔형 튜브로 끌어당깁니다.
세포를 스핀다운한 후 Murine-Flt3-Ligand 및 IL-7이 보충된 10ml의 OP9 배지에 펠릿을 재현탁시키고 70미크론 스트레이너를 통해 세포를 여과합니다. 웰당 하나의 IPSC 배양액을 80-90%의 confluent feeder cell 단층을 포함하는 6웰 배양 플레이트에 파종하고 공동 배양을 인큐베이터로 되돌립니다. 2일마다 배지의 절반을 Murine-Flt3-Ligand 및 IL-7이 보충된 새로운 OP9 배지로 교체하고, 4-6일마다 필요에 따라 새로운 공급세포 층이 있는 새 플레이트에 분화 IPSC를 다시 파종합니다.
먼저 트립신으로 관심 세포 배양액을 분리하고 각 세포 유형을 10ml의 새로운 배지로 재현탁합니다. 각 세포 배양액을 10cm 크기의 새 접시에 플레이트로 고정하고 피더 세포가 세포 배양 인큐베이터에 부착되도록 합니다. 30분 후 부유 IPSC를 수집하고 개별 70미크론 세포 스트레이너를 통해 배양물을 통과시켜 계수를 위해 세포 클러스터를 제거합니다.
저온 PBS에서 각 배양액을 1.5 곱하기 10에서 밀리리터당 7번째 세포 농도로 재현탁하고 필요에 따라 다시 필터링합니다. 그런 다음, 4주에서 6주 된 암컷 C57BL/6 마우스를 한 번에 하나씩 작은 동물 재조정기에 넣고 마우스 한 마리당 한 가지 유형의 세포 200마이크로리터를 각 동물의 꼬리 정맥으로 양자로 이식합니다. 다이얼 게이지 캘리퍼를 사용하여 양쪽 무릎의 붓기를 측정하여 기준선 측정을 설정합니다.
세포 이식 후 10일 후, 1밀리리터 주사기를 사용하여 각 실험 동물의 꼬리 기저부에 완전한 프로인트 보조제에서 유화된 메틸화 BSA 100마이크로그램을 마우스에 주입합니다.세포 이식 후 17일 후, PBS 10마이크로리터에 포함된 메틸화 BSA 20마이크로그램을 왼쪽 무릎 관절에 주입하고 메틸화 BSA 20마이크로그램 및 전체 오브알부민 100마이크로그램을 관절 내 주사하여 관절염을 유발합니다. 10 마이크로 리터의 PBS에서 마취 된 각 입양 이식 동물의 오른쪽 무릎 관절로. 관절염을 유발한 지 7일 후, 무릎 직경의 증가율을 계산하기 위해 무릎을 다시 측정하고 슬개골을 외과적으로 절제합니다.
포르말린으로 관절을 고정하십시오. 그런 다음 EDTA에서 석회질 제거 후 무릎을 파라핀에 삽입하고 조직화학적 염색 및 분석을 위해 4개의 미크론 절편을 얻습니다. 28일째에 항원 특이적 T 조절 세포는 상당한 수준의 CD3 및 항원 특이적 T 세포 수용체를 발현합니다.
이러한 세포의 대부분은 CD25, CD127 및 CTLA-4도 발현하며, 이들 모두는 일반적으로 자연적으로 발생하는 T 조절 세포에서 높은 수준으로 발현됩니다. 실제로, FoxP3는 세포 내 염색에 의해 검출된 바와 같이 Notch 리간드를 이용한 장기간 체외 자극 후에도 IPSC 유래 T 조절 세포에서 잔류합니다. 또한, 이러한 항원 특이적 IPSC T 조절 세포는 in vitro에서 항원 펄스 비장세포로 자극될 때 억제 사이토카인을 생성하며, 이는 이러한 세포에 대한 잠재적인 억제 표현형을 나타냅니다.
OVA 처리된 무릎에서 FoxP3 양성 세포가 관찰되며, 제어 벡터 형질도입 IPSC를 받는 무릎에서는 FoxP3 양성 세포가 나타나지 않습니다. 또한, FoxP3 벡터만 투여할 때보다 TCR-FoxP3 벡터로 transduction된 IPSC를 받은 마우스의 무릎에서 CD4 양성, FoxP3 양성, TCR3 Beta 5 양성 세포가 더 많이 관찰되었는데, 이는 항원 특이적 IPSC-Treg 세포가 수용 동물로 이식된 후 항원 유발 관절염 무릎으로 이동한다는 것을 시사합니다. IPSC 유래 세포 채택 전달은 또한 OVA가 존재할 때 염증성 무릎 부종의 상당한 감소에 영향을 미치지만, 메틸화 BSA 주입 무릎 제어에는 영향을 미치지 않습니다.
붓기 감소의 긍정적인 효과는 MBSA만 주사한 대조군과 비교하여 세포 이식 처리된 무릎에서 관찰된 뼈 손실 감소에 대한 고해상도 Micro-CT 영상에 의해 더욱 입증됩니다. 이러한 심층적인 절차는 일단 소집되면 적절하게 수행되면 6주 안에 완료될 수 있습니다. 이 기술을 시도하는 동안, TCR-FoxP3 항원 형질도입 IPSC의 주입된 분화를 유도하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라, 항원 특이적 IPSCs T reg 세포의 생존 및 품질에 대한 추가 질문에 답하기 위해 억제 사이토카인의 다양한 화합물을 심사숙고할 수도 있습니다. 개발 후 이 기술은 세포 기반 치료 분야의 연구자들이 자가면역 질환에서 항원 특이적 조절 T 세포의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 직접 차체 bactors로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 절차를 수행하는 동안 기본 2 시설에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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개요
이 연구는 자가면역 관절염에 대한 면역치료를 목적으로 유도 만능 줄기세포(iPSC)에서 기능성 항원 특이적 조절 T 세포(Tregs)를 생성하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 표적 항원에 특이적이고 균일한 줄기세포 유래 Tregs를 생산하는 데 중점을 둡니다.
주요 연구 구성요소
과학 분야
- 면역치료
- 자가면역
- 줄기세포 연구
배경
- 자가면역 관절염은 치료에 큰 어려움을 제기합니다.
- 조절 T 세포는 면역 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다.
- 유도 만능 줄기세포는 Tregs를 생성하기 위한 유망한 원천을 제공합니다.
- 특이적인 Tregs를 생산하는 방법을 개발하면 치료 효과를 향상시킬 수 있습니다.
연구 목적
- iPSC에서 Tregs를 생성하는 새로운 방법을 개발합니다.
- 자가면역 관절염에 대한 잠재적 면역치료제를 탐색합니다.
- 연구 및 임상 응용을 위한 균일한 Tregs 집단을 제공합니다.
사용된 방법
- OP9 배지에서 피더 세포 희석.
- 레트로바이러스로 형질주입된 iPSCs의 배양.
- 배지 제거 전 세포 밀집도 모니터링.
- 배양 후 PBS로 세포 세척.
주요 결과
- iPSC에서 항원 특이적 Tregs의 성공적인 생성.
- 유래된 Tregs의 균일성과 기능성 입증.
- 자가면역 관절염에 대한 면역치료에 적용할 잠재력.
- 줄기세포 유래 Tregs의 생성에 대한 통찰력 제공.
결론
- 개발된 방법은 면역치료 접근법을 크게 발전시킬 수 있습니다.
- 균일한 Tregs는 자가면역 관절염의 치료 결과를 개선할 수 있습니다.
- 임상 응용을 탐색하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables the generation of antigen-specific regulatory T cells from iPSCs, offering a scalable and uniform cell source for immunotherapy development in autoimmune diseases. By providing a defined Treg population with antigen specificity, it supports mechanistic de-risking in preclinical programs targeting immune tolerance. The approach addresses a key discovery-stage challenge: producing functionally validated, disease-relevant Tregs for therapeutic evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of antigen-specific Treg function in suppressing autoimmune responses.
- Operational Value: Provides a reproducible system for validating Treg-mediated mechanisms of action.
- Predictive Value: Supports assessment of target engagement and immunomodulatory potential in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates Tregs that express CD4, CD25, FoxP3, and antigen-specific TCR for functional validation.
- Operational Value: Delivers a standardized cell product suitable for assay development and suppressive activity screening.
- Scalability: Enables production of Tregs in quantities sufficient for downstream immunological testing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrated efficacy in reducing joint inflammation and bone loss in murine autoimmune arthritis models.
- Translational Continuity: Supports evaluation of Treg migration, persistence, and suppressive cytokine production in vivo.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides data on functional Treg engraftment and antigen-dependent activity to inform go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling antigen-specific Treg generation for mechanistic studies and therapeutic candidate evaluation in autoimmune indications.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on Treg-mediated immune suppression and antigen-specific tolerance induction.
- Analytics: Enables quantitative measurement of Treg phenotype (CD3, CD25, FoxP3, TCR) and function via cytokine suppression assays.
- Translational Research: Connects in vitro Treg differentiation to in vivo outcomes in arthritis models, supporting biomarker-aligned advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform for generating antigen-specific Tregs applicable across multiple autoimmune targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in Treg-based therapies through antigen-specific functionality and phenotypic validation.
- Operational Value: Ensures reproducibility and uniformity of Treg products via defined iPSC differentiation protocols.
- Strategic Value: Reduces biological risk in immunotherapy development by providing mechanistically defined, antigen-targeted Tregs.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified prioritization of Treg candidates based on antigen specificity and suppressive capacity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in iPSC culture, retroviral transduction, and stromal co-culture systems.
- Depends on OP9 feeder cells expressing Notch ligands DLL1 and DLL4 for Treg differentiation.
- Necessitates flow cytometry and intracellular staining for validation of FoxP3, TCR, and Treg markers.
- Involves in vivo validation in antigen-induced arthritis models to assess therapeutic potential.
- Limited by the need for antigen-specific TCR identification and cloning prior to iPSC engineering.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
In Vitro Antigen-specific Inducible Pluripotent Stem Cell (iPSC)-T Regulatory Cell (T-reg) Differentiation
4:00
In Vivo iPSC Maturation and Autoimmune Arthritis Suppression and Analysis
6:24
Results: Representative Antigen-specific iPSC-T-reg Mediated Arthritis Suppression
8:54
Conclusion
