자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

이 실험의 전반적인 목표는 자가면역성 관절염의 면역 요법을 위해 줄기세포 유래의 염증성 관절 관련 조절 T 세포를 생성하는 새로운 방법을 개발하는 것입니다. 이 방법은 자가면역성 관절염에 대한 잠재적 면역 치료제라는 자가면역 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 줄기세포 유래 조절 T 세포가 정형화되어 있으며 단일 유형이라는 점입니다.

먼저 관심 있는 피더 세포를 OP9 배지에서 최소 밀도 1 × 10⁴ cells/cm²가 되도록 희석하고, 10 cm 디쉬당 1 × 10⁶개의 피더 세포를 플레이팅합니다. 세포가 80~90% 합쳐졌을 때(confluent), 배양액의 배지를 제거하고 각 디쉬에 레트로바이러스로 형질전환된 유도만능줄기세포(iPSCs) 0.5~1 × 10⁵개를 OP9 배지와 함께 파종합니다. 5일 후, 배지를 흡입하여 제거하고 10 mL의 PBS로 세포를 세척합니다.

그런 다음, 디시당 4 mL의 Trypsin을 사용하여 37 °C에서 세포를 탈착합니다. 10분 후, 8 mL의 IPSC 배지를 가해 반응을 중단시키고 원심분리를 위해 세포를 수집합니다. 펠릿을 10 mL의 신선한 IPSC 배지에 재현탁하고, 새로운 10 cm 디시에 세포를 재배양합니다.

피더 세포가 플레이트에 부착되도록 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 둡니다. 그 후, 부유 상태의 IPSC를 수집하고 형질전환된 세포를 70 µm 스트레이너로 걸러 세포 수를 측정합니다. Murine-Flt3-Ligand가 첨가된 OP9 배지가 들어있는, 80~90% 정도로 합류(confluent)된 새로운 피더 세포 플레이트에 5×10⁵개의 IPSC를 접종하고 배양물을 인큐베이터로 옮깁니다.

3일 후, 10 mL 피펫을 사용하여 배양 접시를 배양액으로 세척합니다. 그런 다음, 접시에 신선한 OP9 배지 5 mL를 추가하고, 피더 세포층을 손상시키지 않도록 주의하면서 신중하고 강하게 피펫팅하여 반부착성 iPSC를 조심스럽게 씻어냅니다. 10 mL의 PBS로 세척 과정을 반복하여 남은 반부착성 세포를 수확하며, 각 접시의 세척액을 배양당 하나의 원추형 튜브에 모읍니다.

세포를 원심 분리한 후, Murine-Flt3-Ligand와 IL-7이 첨가된 OP9 배지 10 milliliters에 펠렛을 재현탁하고 70 micron 스트레이너로 세포를 여과합니다. 80 내지 90%confluent한 피더 세포 단층이 포함된 6-웰 배양 플레이트의 각 웰에 IPSC 배양액을 하나씩 접종하고 공동 배양 시스템을 인큐베이터에 넣습니다. 2일마다 배지의 절반을 Murine-Flt3-Ligand와 IL-7이 첨가된 신선한 OP9 배지로 교체하고, 4 내지 6일마다 필요에 따라 분화 중인 IPSC를 신선한 피더 세포 층이 있는 새 플레이트에 재접종합니다.

먼저 Trypsin을 사용하여 대상 세포 배양물을 분리한 다음, 각 세포 유형을 10 milliliters의 신선한 배지에 재현탁합니다. 각 세포 배양물을 새로운 10 centimeter 디시에 도말하고 세포 배양 인큐베이터에서 피더 세포가 부착되도록 둡니다. 30분 후, 부유하고 있는 IPSCs를 수집하고 세포 계수를 위해 개별 70 micron 세포 스트레이너에 배양물을 통과시켜 세포 클러스터를 제거합니다.

각 배양물을 차가운 PBS에서 1.5 × 10⁷ cells/mL 농도로 재현탁하고, 필요에 따라 다시 필터링합니다. 그런 다음, 4~6주 된 암컷 C57BL/6 마우스를 소동물 보정기에 한 마리씩 넣고, 마우스당 한 종류의 세포 200 µL를 각 동물의 꼬리 정맥에 입양 전이(adoptively transfer)합니다. 다이얼 게이지 캘리퍼를 사용하여 양쪽 무릎의 부종을 측정하여 기저치(baseline)를 설정합니다.

세포 이식 10일 후, 1mL 주사기를 사용하여 완전 Freund 보조제(complete Freund's adjuvant)에 유화시킨 100µg의 메틸화 BSA(methylated BSA)를 각 실험 동물의 꼬리 기저부에 주사합니다. 세포 이식 17일 후, 마취된 입양 이식 동물 각각의 왼쪽 무릎 관절에는 PBS 10µL에 녹인 20µg의 메틸화 BSA를, 오른쪽 무릎 관절에는 PBS 10µL에 녹인 20µg의 메틸화 BSA와 100µg의 전-오발부민(whole Ovalbumin)을 관절 내 주사하여 관절염을 유도합니다. 관절염 유도 7일 후, 무릎 직경의 증가 백분율을 계산하기 위해 무릎을 다시 측정하고, 수술적으로 슬개골을 적출합니다.

관절을 포르말린으로 고정합니다. 그 후, EDTA로 탈칼슘화한 뒤 무릎 조직을 파라핀에 매립하고, 조직화학적 염색 및 분석을 위해 4 µm 두께의 절편을 제작합니다. 28일 차에 항원 특이적 T 조절 세포는 상당한 수준의 CD3 및 항원 특이적 T 세포 수용체를 발현합니다.

이 세포들의 대부분은 CD25, CD127 및 CTLA-4를 발현하며, 이들은 모두 자연 발생 T 조절 세포에서 일반적으로 높은 수준으로 발현되는 인자들입니다. 실제로 세포 내 염색으로 확인한 결과, iPSC 유래 T 조절 세포에서는 Notch 리간드를 이용한 장기간의 인비트로(in vitro) 자극 후에도 FoxP3가 지속적으로 발현되었습니다. 또한, 이러한 항원 특이적 iPSC T 조절 세포는 인비트로에서 항원이 처리된 비장세포로 자극했을 때 억제성 사이토카인을 생성하였으며, 이는 이 세포들이 잠재적인 억제 표현형을 가지고 있음을 나타냅니다.

OVA 처리된 무릎에서 FoxP3 양성 세포가 관찰되었으며, 대조군 벡터가 형질전환된 IPSC를 투여한 무릎에서는 FoxP3 양성 세포가 나타나지 않았습니다. 또한, TCR-FoxP3 벡터로 형질전환된 IPSC를 투여한 마우스의 무릎에서는 FoxP3 벡터만 투여한 경우보다 CD4 양성, FoxP3 양성, TCR3 Beta 5 양성 세포가 훨씬 더 많이 시각화되었습니다. 이는 항원 특이적 IPSC-Treg 세포가 수용 동물로의 입양 전이 후 항원 유도성 관절염이 발생한 무릎으로 이동함을 시사합니다. IPSC 유래 세포의 입양 전이는 OVA가 존재하는 경우 염증성 무릎 부종의 상당한 감소를 유도하였으나, 대조군으로서 메틸화된 BSA를 주입한 무릎에는 영향을 미치지 않았습니다.

부종 감소의 긍정적인 효과는 대조군인 MBSA만 주입한 동물과 비교하여 세포 전이 치료를 받은 무릎에서 관찰된 골 손실 감소를 고해상도 Micro-CT 영상으로 촬영함으로써 더욱 입증되었습니다. 숙련된 후에는 이 정밀한 절차를 적절하게 수행할 경우 6주 이내에 완료할 수 있습니다. 이 기술을 시도할 때는 TCR-FoxP3 항원이 형질전환된 IPSC의 유도 분화를 유도하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

이 절차에 따라, 항원 특이적 iPSC 유래 Treg 세포의 생존 및 품질에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 서로 다른 억제성 사이토카인 화합물들을 고려할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 세포 기반 치료 분야의 연구자들은 자가면역 질환에서 항원 특이적 조절 T 세포의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 직접적인 자가 항체 박테리아를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 절차를 수행하는 동안 기초 2등급 시설(BSL-2)에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.

시청해주셔서 감사합니다. 실험에 행운이 따르길 바랍니다.