Name: PM10의 입자 바인딩 베팅 1 절 알레르기의 유세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 학습하세요 유세포 분석을 이용하여 PM10 입자에 결합된 Bet v 1 알레르겐을 정량화하는 방법을. 이 기술은 대기 중 알레르겐 부하를 시각화하고 측정하는 빠른 방법을 제공하여 호흡기 건강 연구에 활용됩니다.

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저자는 귀중한 준비 작업에 대해 Katrin Bossmann, Anett Neumann 및 Eike Wolter(독일 환경청)에게 감사를 표합니다.

참고 :이 프로토콜은 이차 항체를 표지 된 베팅 1 절, 주요 자작 나무 꽃가루 항원 성분, 플러스 알로 피코 (APC)에 대한 단클론 항체와 PM10 입자의 간접 염색 (단일 클론 마우스의 IgG1 항체, 클론 MA-3B4)에 대해 설명 (항 - 마우스의 IgG1 항체, 클론 A85-1) 및 유세포 분석에 후속. 적절한 다른 가능한 항체로,이 방법은 대기 입자에 결합 된 다른 항원의 검출로 확장 될 수있다. 1. PM10 샘플링 <ol><li> 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)의 외기로부터 PM10 수집 2.3 m 3 / 시간 (도 1)의 유량을 갖는 저 부피 샘플러를 사용하여 필터링한다. 여기서 설명하는 실험에 사용되는 샘플러의 특성 (16)에서 발견된다. 시간을 실행하면 필요한 PM10의 양 (보통 사이 일 10 일)에 따라 달라집니다. </li><li> 배양 시간의 끝에서, 샘플러에서 필터를 제거하고, 그것을 동결-20 ° C까지 사용. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig1.jpg" /> 그림 1. 낮은 볼륨 PM10 샘플러. 낮은 볼륨 PM10 샘플러의 예. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2. PM10 제거 및 입자 수 <ol><li> 약 5 분 동안 PTFE 필터 해동을 할 수 있습니다. 그런 다음, 깨끗한 폴리스티렌 페트리 접시 (그림 2A)에 필터를 넣어. 하나 이상의 필터가 처리 될 경우, 각 필터에 대한 새로운 배양 접시를 가져 가라. </li><li> 다음에, 인산 완충 용액 (PBS)와 PTFE 필터를 중첩. 이 프로토콜을 8x10 ml의 당 6 입자의 최종 농도 PM10 설립된다 (단계 3.3 참조). 적어도 그 농도를 얻기 위해 필터와 오버레이 PBS 다음 경험적 볼륨을 사용하여 다음 PM10 콜렉션 시간 이었다면 &lt;<html> 2 일, 2 ml에 사용합니다. 배양 시간 ≥2 일 동안, 4 ml에 사용합니다. 주 :이 적절한 경우 PM10 현탁액의 입자 농도를 증가시키기 위해, 다른 필터의 현탁액 풀링 될 수있다. </li><li> 1 분 동안 민감한 브러쉬 헤드 (도 2B, 2C)와 전기 칫솔 핀셋과 브러시로 PTFE 필터를 잡으십시오. 깨끗한 반응 관에, 입자-PBS-서스펜션, 이하라고 PM10 현탁액을 전송합니다. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig2.jpg" /> 전기 칫솔도 2 PM10 제거. 샘플링 PM10과 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 필터는 폴리스티렌 배양 접시 (A)에 배치되고, 4 ml의 PBS로 중첩된다. 그런 다음, PM10은 전기 칫솔로 제거 (B : 1 분 동안 칫솔질 후 : 닦고 C 전).= &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <ol start="4"><li> 입자 계수기를 이용하여, 예 PM10 입자의 농도를 측정한다. , PM10 현탁액 10 ㎖ 측정 등장 완충액 50 μL 같은 적절한 부피를 희석 세 번 측정 용액 당 입자의 평균 수를 계산한다. 해당 크기의 입자를 검출 할 수있는 입자 계수기를 사용하십시오. </li></ol> 3. 베팅 1 절 염색 <ol><li> 시료의 분석에 필요한 반응 튜브의 수를 계산하는 적어도 세 개의 반응 튜브가 요구된다 : (Ⅰ) 시료 만 (기본 제어) 한 튜브 샘플 플러스 이차 항체 (대조군)과 (ⅱ) 하나의 튜브 및 ( ⅲ) 샘플 플러스 일차 및 이차 항체 (특정 샘플) 하나의 튜브. 처음으로 측정 된 경우, (ⅰ) 적어도 두 개의 반응 관을 준비 (II),및 (iii) 적절히 설정 사이토 조정하기에 충분한 재료를 갖고 (단계 4.1 참조). </li><li> 반응 튜브의 수에 필요한 PM10 현탁액의 양을 계산한다. 각각의 반응 관은 현탁액의 50 μl를 필요로한다. </li><li> PBS를 적당량 첨가하여 용액 당 8x10과 6 입자의 최종 농도는 단계 3.2에서 계산 된 현탁액의 볼륨 단계 2.4에서 측정 된 입자 농도를 조정한다. 참고 :이 프로토콜에 대한 갓 준비 PM10 서스펜션을 권장하지만 나머지 PM10 현탁액, 미래의 실험 -20 ° C에서 동결 할 수있다. </li><li> 블록 예컨대 1 % BSA를 PBS로 제조 원액을 사용하여, 0.02 %의 최종 농도로 우 혈청 알부민 (BSA)과 PM10 현탁액을 보충하여 비특이적 결합. 소용돌이 간략하고 실온에서 20 분 동안 배양한다. </li><li> 각 샘플은 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 경우, 교류 단계 3.4에서 서스펜션의 50 μl를 전송린 반응 관. 간단히 특정 염색 와류 대해 지정된 반응 튜브에 0.02 μg의 / μL 최종 농도 내기 V 1에 대해 모노클로 날 마우스 항체를 첨가하고 실온에서 60 분 동안 배양한다. <ol><li> 기본 대조군과 음성 대조군은 또한 실온에서 60 분 동안 체류에 지정된 PM10-BSA 서스펜션 반응 튜브하자. </li></ol></li><li> PBS가 실온에서 5 분 동안 4,700 XG에서 샘플이어서 각 반응 관 와류 간단히 원심 0.02 % BSA로 보충 된 500 μl를 첨가하여 모든 샘플을 세척한다. 진공 펌프를 이용하여 조심스럽게 상층 액을 제거한다. </li><li> 단계를 반복 3.6. </li><li> PBS는 반응 관 당 0.02 %의 BSA와 보충 50 μL에 녹인 1 μg의 항체 : 필요 APC 표지 보조 안티 - 마우스의 IgG1 항체의 총량을 결정합니다. 0.02 %의 BSA로 보충 PBS의 각 볼륨 항체의 적절한 양을 희석. </li><li> 기본 제어를 위해 지정된 반응 관을 제외한 모든 반응 튜브로 희석 차 항체의 50 μl를 추가합니다. PBS는 0.02 % BSA로 보충 된 50 μL와 후자를 보완. 소용돌이 몇 초 동안 모든 샘플. </li><li> 어둠 속에서 30 분 동안 모든 샘플을 품어. </li><li> 단계를 반복 3.6 배. </li><li> 각각의 반응 관, 소용돌이에 50 μl의 PBS를 추가하고 흐름 cytometer에 샘플을 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 유세포 분석 <ol><li> 매개 변수 사이토 다음, 기본 컨트롤을 조정 사용하여 데이터 분석을 최적화 할 수 있습니다. <ol><li> 디바이스 제어 보드에 표시되는 전방 산란 (FSC) 임계 컨트롤러를 이용함으로써, 낮은 값 (200)에 FSC 임계 값을 설정하고, 분석을 시작한다. </li><li> 캐터 전압 제어기를 사용함으로써, 모든 PM10 입자를 검출 할 수 있도록하는 방식으로 FSC 및 측방 산란 (SSC)를 조정하여 입자 집단은 일 대략 위치하도록금감위 축 및 SSC 축의 아래쪽의 E 중간. </li><li> 형광 전압 제어기를 사용함으로써, APC 전압이 필요한 경우, APC와 같은 동일한 파장에서 방출하지 않는 형광 염료 (FITC)와 같은 다른 형광 전압을 조정한다. 모든 입자는 모두 형광 축의 하단에 볼 수 있습니다 것을 확인하십시오. </li></ol></li><li> 연속적으로, 기본 컨트롤을 포함하여 각 샘플을 검사하고 샘플 당 최소 10,000 입자의 FSC, SSC, APC 및 FITC 데이터를 저장합니다. </li><li> 각각의 소프트웨어와 데이터를 평가합니다. 특정 시료에 흡착 된 항원의 콘텐츠는 두 가지 방법으로 정량화 할 수있다 : <ol><li> 모든 PM10 입자 위에 내기 V 1 하중 계수로서 모든 입자 (중앙값)의 APC 형광 강도를 분석한다. 참고 : 특정 샘플이 알레르기 항원을 포함하는 경우, APC 형광 강도가 대조군에 비해 특정 샘플 증가한다. 한편, 다른 불소escence 강도 (예., FITC 형광 강도)를 크게 변경하지 않아야합니다. </li><li> 바운드 안티 내기 1 절 항체 PM10 입자의 비율을 계산합니다. 이에 따라, 음성 대조군에 복사하여 특정 샘플에이 문을 붙여 특정 샘플에서 APC 긍정적 인 입자의 비율에서 대조군에 APC 긍정적 인 입자의 비율을 빼기, APC는 긍정적 인 생각 입자 주위에 게이트를 설정합니다. </li></ol></li></ol>

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프로토콜의 중요한 단계는 대기에서 PM10 입자의 수집을위한 적절한 필터를 사용하는 것이다 (단계 1.1 참조). 필터는 전기 칫솔 칫솔질 견딜만큼 튼튼해야하고, 모든 필터 재료는 이러한 요건을 충족. 염색 프로토콜 ml의 당 8x10과 6 입자의 PM10 입자 농도가 설립되었다. 재료가 제한되고 샘플 풀링 적절하지 그러나 경우, 메소드는 아마 잘 작동되지만, 항체 농도가 조절 될 수있다 (단계 3.5 및 3.8 참조). PM10 입자의 베팅 1 절 염색 긍정적 및 부정적 스테인드 입자의 별개의 집단 발생하지 않았다. 이것은 최대 아주 작은에서 많은 양에 이르기까지 입자의 각 흡착 내기 V 1 알레르기 항원의 다양한 양의에 의해 발생 될 수 있습니다. 이는 따라서 인구를 향해 시프트 APC 신호의 확장을 초래할 수APC 양성. 모든 입자의 평균 APC 형광 강도를 측정하여 (I)의 상대적인 정량 : 그것은 음의 입자의 양을 분리하는 것이 곤란하기 때문에, 두 개의 정량 방법은 PM10&gt; 0.5 시험편 배팅 V 한 내용의 차이를 결정하기 위해 사용 된 및 (ⅱ) APC 대상 입자의 비율을 결정하는 단계를 포함한다. 저 높은 꽃가루 시즌 PM10&gt; 0.5 입자의 베팅 1 절 부하에 대해서는 두 방법 모두 비슷한 결과를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이 때문에 게이트를 배치의 독립과 같이 아직도, 모든 입자의 평균 형광 강도에 의해 상대 정량을 권장 아마 덜 오류가 발생하기 쉬운. 지금까지 많은 연구 ELISA 5,12-14,17와 각각의 알레르겐과 이후의 정량화를 추출하여 대기 입자상 물질의 알레르기 항원 함량을 검사합니다. 여기에 기술 된 절차와 quantificatio 간의 기본적인 차이가N ELISA에 : 유동 세포 계측법은 입자 - 결합 된 항원을 분석하면서 ELISA는 추출 용해 항원 정량화. ELISA를 통해 테스트 PM10 샘플의 BET V 1 부하 (N = 8) 1.2 ng를 / ㎖의 검출 한계 미만이었다 (데이터는 보이지 않음). 마찬가지로, Buters 등은 PM &lt;2.5 μm의 분수와 10 μm의에서 약 7 %&gt; PM&gt; 2.5 μm의 일부지만, PM 대기 13&gt; 10 μm의 비율에 93 % 이상에 더 베팅 1 절을 확인하지 않습니다. 한편, 다른 한편으로는 FACS 분석에 대한 ELISA의 대조 결과를 발산 감도와 결합 검출 방법의 차이에 의해 야기 될 수있다. 또한 연구 그러나 완전히 차이를 이해하는데 필요하다. 방법은 입자 - 결합 항원은 전자 현미경을 스캔 10,14 시각화된다. 전자 현미경을 스캔하여, Ormstad 외. 부유 입자 매트의 표면 상에 가시 내기 V 1r에 매연 입자는 높은 꽃가루 시즌과 낮은 꽃가루 시즌 15 샘플 입자에 조금 적게 샘플링. 또한, 화분, 라텍스, 또한 β 글루칸에서 알레르겐은 대기 (10)에서 연소 된 입자에 흡착되는 것으로 밝혀졌다. 그러나,이 방법은 입자 - 결합 항원의 정량화를 허용하지 않는다. 유동 세포 계측법을 사용하여, 입자 결합 내기 1 절 알러지 유발 물질은 정량 할 수있다. 따라서, 한편으로 다른 적절한 항체로 PM10의 10-0.5 μm의 생물학적 부분을 특성화하는 새로운 방법을 제공 할 수 유세포,이 방법은 대기 입자, 예를 들면, 곰팡이, 진드기의 다른 항원의 검출로 확장 될 수도 알레르기 또는 LPS. PM10 입자를 아주 쉽게 또한 화학 및 금속뿐만 아니라 생체 물질을 흡착하지만 같이, 항체의 비특이적 결합하지만, 문제를 제기 할 수있다. 새로운 항체를 시험하는 경우 중요한 단계는 특정 바인딩을 증명하는 것이다ING. 이것은 11 염색 전에 대응하는 항원과 특이 적 항체의 결합을 차단하는 능력, 예를 들어, 수행 될 수있다. 14, 18를 계산 내기 V로 주변 공기의 한 내용이 자작 나무 꽃가루 수 12,13,18과 다를 수 있습니다, 알레르기 증상은 아마도 꽃가루보다 알레르기 수준이 더 상관 관계가 있습니다. 따라서, 임상 데이터와 함께 제시된 방법은 자작 나무에 알레르기 반응이 PM10&gt; 0.5의 베팅 1 절 알레르겐 부하에 해당하는지 여부 미래의 실험에서 검사 할 수 있습니다.

대기 오염은 최근 수십 년간 1-3에서 관찰 호흡기 알레르기의 증가 빈도와 심각도의 중요한 환경 적 원인으로 간주되고있다. 또한, 먼지 4,5 일반적인 알러지 유발 물질의 분포에 대한 관심이 있었다. 자작 나무 꽃가루는 꽃가루 알레르기를 유발 할 수 있습니다뿐만 아니라 알레르기 성 천식 6-8의 중요한 트리거 할 수 있습니다. 항목 자작 나무 꽃가루 하부 호흡기를 입력 또는 크기 (직경 22 μm의)의 결과로서 PM10에서 발견 될 가능성이 없다. 그러나 베팅 1 절, 주요 자작 나무 꽃가루 알레르기 성분, 같은 자작 나무 꽃가루 알레르기는 꽃가루 파열 구 이후에 출시 될 수 있으며, 하부 호흡기기도를 따라서 가능, 대기 입자 (10)에 결합 입력 할 수 있습니다. 실제로,이 꽃가루 알레르기 proband (11) basophiles의 체외 활성화에 의해 입증 된 바와 같이 PM10은 생물학적 활성 알레르기가있는 것으로 나타났다 </suP&gt;. PM10 샘플에 베팅 1 절 알레르기 항원 함량은 ELISA 12-14로 각각의 알레르겐과 이후의 정량화를 추출하여 연구되어왔다. ELISA 법으로 용해 알레르겐을 측정했지만, 알레르겐 - 로딩 된 입자의 양이 아직 알려지지. 주사 전자 현미경은 알레르기로드 입자를 밝혀 있지만, 정량 10, 15를 허용하지 않았다. 이 연구는 주변 공기 샘플에 베팅 1 절로드 PM10 입자의 비율을 정량화하는 유동 세포 계측법 사용한다. 유량의 검출 한계로 인해뿐만 초과 0.5 μm의 조사가 가능 입자 사이토. PM10의&gt; 0.5 μm의 비율은 더 PM10으로&gt; 0.5로 언급 될 것이다.

<table><tbody><tr><td>테프론 필터</td><td>Pall Life Sciences, 미국</td><td>R2PL047</td><td>47mm, 1.0 &마이크로; m</td></tr><tr><td>저용량 샘플러</td><td>Sven Leckel Ingenieur B&uuml; ro GmbH, 독일</td><td>LVS3</td><td>풍량 2.3 m3/hr</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Biochrom, 독일</td><td>L1825</td><td>Ca/Mg 없음, 저내독소</td></tr><tr><td>전기 칫솔&nbsp;</td><td>독일 브라운</td><td>오랄비 바이탈리티 센서티브</td><td></td></tr><tr><td>케이시 세포 카운터&nbsp;</td><td>슈 &auml; rfe System GmbH, 독일</td><td>모델 TTC</td><td>검출 가능한 입자 크기 범위: 0.7 & 마이크로; m에서 45&nbsp; &마이크로; m</td></tr><tr><td>FACS칸토 II&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, 미국</td><td>3-레이저, 8-컬러 (4-2-2)</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva 소프트웨어 v6.1.3&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, 미국</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>단클론 마우스 IgG1 항체 Bet v 1</td><td>Indoor Biotechnologies, 영국</td><td>&nbsp; MA-3B4</td><td>클론 MA-3B4</td></tr><tr><td>APC (Allophycocyanin) 표지 2차 항마우스 IgG1 항체&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>560089</td><td>클론 A85-1</td></tr><tr><td>SPSSTM 소프트웨어 버전 18&nbsp;</td><td>PASW 통계 18, 홍콩, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Gosselin, France</td><td>BP50-02</td><td>D 55&nbsp; mm, H 15&nbsp; mm</td></tr><tr><td>FACS 튜브&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, 미국</td><td>REF 352054</td><td>5 ml 폴리스티렌</td></tr><tr><td>CASYton</td><td>Roche 독일</td><td>REF 05651808001</td><td></td></tr><tr><td>Matrix Blank Tubes</td><td>Thermo Scientific, 미국</td><td>4140</td><td>1.4 ml, PP</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Heraeus, Thermo Scientific</td><td>Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>INTEGRA Biosciences AG, 스위스</td><td>모델 158 320</td><td>Inetrgra Vacusafe</td></tr><tr><td>재조합 베팅 v 1a 항원&nbsp;</td><td>실내 생명 공학, 영국</td><td>LTR-BV1A-1</td><td>농도 : 2.0 mg / ml</td></tr></tbody></table>

pm10의 입자 바인딩 베팅 1 절 알레르기의 유세포 분석

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

유동 세포 계측법은 널리 0.5 직경 수십 ㎛을 크기 범위에있는 세포 또는 박테리아 등의 현탁 물질을 정량화하기 위해 사용하는 방법이다. 전방 및 측방 산란 특성의 특성에 더하여, 그 각 구성을 검출하기 위해 항체와 같은 형광 표지 마커의 사용을 가능하게한다. 간접 항체 염색법을 사용하여, 자작 나무 꽃가루 알레르기를 정량화하기 위해 세포 계측법 여기에 사용된다 흐름 흡입 입자상 물질 (PM10, 입자 크기 직경이 ≤10 μm의)에 직경 0.5 μm의 10의 입자를 -loaded (정확하게 1 절 내기). 흡착 알러지 유발 물질의 운반 가능성이 그들이 알레르기 반응을 트리거 할 수있는 하부 호흡기, 그들을 수송으로 PM10 입자 작용할 수있다. 지금까지 PM10의 알레르겐의 함량은 효소 결합 면역 분석법 (ELISA를) 주사 전자 현미경을 이용하여 연구되었다. ELISA는 입자를 용해하지 측정-bound 알레르겐. 알레르겐 - 로딩 입자를 시각화 별도로이를 정량화 할 수있다 유세포 수 사형 전자 현미경에 비해. 주변 공기의 알레르기 항원 함량은 자작 나무 꽃가루 카운트에서 벗어날 수 있듯이, 알레르기 증상은 아마도 꽃가루 개수보다 알레르겐 노출 더 상관 관계가 있습니다. 임상 데이터와 함께, 제시된 방법은 알레르기 반응 꽃가루 항원이 PM10 입자&gt; 0.5 μm의의 베팅 1 절 알레르기 콘텐츠와 관련된 자작 나무할지 여부를 미래의 실험에서 테스트 할 수있는 기회를 제공합니다.

PM10&gt; 0.5 입자에 베팅 1 절 알레르기 흡착는 사이토의 흐름에 간접적 인 항체 염색 및 후속 분석에 의해 정량 하였다. 높은 꽃가루 시즌에서 PM10 샘플 템플릿을 역임. 단계 3.1에 기재된 바와 같이, 음성 대조군은 이차 항체를 전용 (도 3a)에 표시된 APC 배양 PM10 입자로 이루어져 있었다. 안티 베팅 1 절 항체 플러스 이차 항체로 염색 PM10 입자는 알레르기로드 입자 (그림 3B)를 표시. 단계 4.3에 기재된 바와 같이, 알레르겐 부하를 정량화하는 두 가지 방법을 사용 하였다 : 한편, 모든 입자의 APC 형광 강도 중앙값은 특정 샘플의 대조군 대 (137) 및 (904) 인 분석 하였다. 한편, 결합 된 항 - 내기 V 1 항체와 입자의 백분율을 측정 하였다 : 게이트는 음성 대조군에서 APC 대상 입자 주변에이어서 하였다 CO얼룩덜룩 및 특정 샘플에 붙여. 음성 대조군으로, PM10&gt; 0.5 입자의 3 %가 APC 양성으로 간주 하였다. 가양 입자의이 비율은 따라서 77.5 %의 APC 긍정적 인 PM10의 결과로 특정 샘플에서 긍정적 인 입자의 비율&gt; 특정 샘플에서 0.5 입자에서 제외되었다. 관찰 방지 베팅의 결합 1 절 항체가 특정 것을 증명하기 위해, 결합 용량은 염색하기 전에 해당 항원과 차단되었습니다. 베팅 1 절 긍정적 인 PM10&gt; 0.5 입자 (그림 3C)의 비율에 의해 정량화 경우, APC의 형광 강도에 의해 정량화, 84 %의 경우는 69 %로 반 내기 1 절 항체의 결합을 감소. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig3.jpg" /> 그림 3. 입자 바인딩 1 알레르기가 높은 포에서 PM10 샘플의 유동 세포 계측법. APC의 형광 강도에 의해 가시화 될 수있다 내기 V단지 APC로 염색 llen 시즌, 그리고 재조합 내기 1 절 항원 차 항체를 차단 한 후 이차 항체 (B)에 표시된 항 내기 V 1 차 항체 및 이후 APC와 염색 차 항체 (A)를 표지 (C ). 게이트 P의 APC +는 APC의 긍정적 인 생각 입자의 주위에 설정된 (빨간색으로 표시) 및 각각의 비율이 주어진다. 이 수치가 약간 (11)에서 수정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 이 방법은 높은에서 낮은 꽃가루 시즌 PM10&gt; 0.5 시료의 흡착 내기 1 절 내용의 양의 차이를 나타 내기 위해 채택 할 수 있는지 여부를 테스트하려면 높은 13 PM10 샘플과 낮은 꽃가루 시즌 6 PM10 샘플을 분석 하였다. 그림 4은 APC 형광 강도 및 베팅 1 절 긍정적 인 PM10&gt; 낮은 꽃가루 시즌 PM10 샘플에 비해 높은 꽃가루 시즌 PM10 샘플의 0.5 입자의 비율에 유의 한 차이를 보여줍니다. 두 정량화 방법은 이에 유사한 결과를 보였다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig4.jpg" /> 저 높은 꽃가루 시즌 그림 4. PM10 샘플 (1. 낮은 꽃가루 시즌 PM10은 가을 / 겨울 2013 년 표본 (N = 6), 높은 꽃가루 시즌 PM10 5 월 2012 2013 년 한 흡착 내기 V의 자신의 양에 차이가 N = (13)). (A) PM10의 APC 형광 강도&gt; 높은 꽃가루 시즌 0.5 입자는 낮은 꽃가루 시즌 (평균 / 최소 / 최대 높은 꽃가루 시즌보다 훨씬 높았다 : 796/313/1097, 평균 / 최소 / 최대 낮은 꽃가루 계절 : 197 / 277분의 85). (B) PM10 높은 꽃가루 시즌 significan 포함낮은 꽃가루 시즌 PM10보다 TLY 더 내기 1 절 양성 PM10이&gt; 0.5 입자 (평균 / 최소 / 최대 높은 꽃가루 시즌 : 45.2 / 18.5 / 74.5, 평균 / 최소 / 최대 낮은 꽃가루 계절 : 11.8 / 4.4 / 19.8). 박스 플롯은 각각 중간 값 (박스의 내부 선), 25 및 75 백분위 수 (박스의 하부 및 상부 테두리)과 최소값과 최대 값 (수염)를 보여줍니다. *** 낮은 꽃가루 시즌 대 P &lt;0.001, 맨 휘트니 U 테스트. 이 수치가 약간 (11)에서 수정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서는 유동 세포 계측법에 의해 알레르겐 - 로딩 입자를 정량 할 수있는 프로토콜을 제시한다. 주변 미립 입자 흡착 알레르겐의 담체로서 작용할 수있다. 우리는 유동 세포 계측법, 방법은 널리 직경이 0.5㎛가 이러한 알레르겐 - 로딩 입자를 측정 할 수있다&gt; 부유 물질을 특성화하는 데 사용 여기 나타낸다.

PM10의 입자 바인딩 베팅 1 절 알레르기의 유세포 분석

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

이 방법의 전반적인 목적은 유세포 분석법을 사용하여 알레르겐이 부착된 주변 대기 미세먼지 입자를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 PM10 입자의 알레르겐 함량에 관한 주요 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 입자들은 흡착된 알레르겐의 운반체 역할을 하여 알레르겐을 하기도로 운반할 가능성이 있으며, 이 기술의 주요 장점은 알레르겐이 부착된 PM10 입자를 빠르게 시각화하고 정량화할 수 있다는 점입니다.본 연구진은 Bet v 1 항원을 대상으로 이 방법을 확립하였으나, 다른 항원에도 적용 가능합니다. 실험 절차 시연은 저희 실험실의 기술자인 Sabine Bach가 진행하겠습니다. 먼저, 저유량 시료 채취기를 사용하여 주변 공기 중 직경 10 µm 이하의 미세먼지를 폴리테트라플루오로에틸렌 필터에 채집하십시오.공기 중의 입자상 물질 양과 원하는 시간적 해상도에 따라 수집기를 1일에서 10일 동안 가동하십시오. 수집이 끝나면 샘플러에서 필터를 제거하십시오. 그리고 분석 전까지 -20 °C에서 냉동 보관하십시오.시료 분석을 계속할 준비가 되면, 냉동고에서 폴리테트라플루오로에틸렌 필터를 꺼내십시오. 그리고 약 5분 동안 해동하십시오. 그런 다음, 필터를 깨끗한 폴리스티렌 페트리 접시에 넣고 8 × 10⁶ particles/mL 농도가 되도록 충분한 양의 PBS를 필터 위에 덮으십시오.핀셋으로 필터를 잡고, 민감성 브러시 헤드가 장착된 전동 칫솔을 사용하여 1분 동안 브러싱합니다. 그런 다음, 입자가 포함된 PBS 현탁액을 깨끗한 반응 튜브로 옮깁니다. PM10 현탁액 50 µL를 10 mL의 등장성 측정 버퍼(isotonic measurement buffer)에 희석합니다.입자 계수기를 사용하여 수집된 PM10 입자의 농도를 측정하십시오. 세 번의 개별 측정값으로부터 평균 입자 농도를 계산하십시오. 만약 입자성 물질의 농도가 너무 낮아 여러 샘플을 병합하는 것이 적절하다고 판단되면, 한 샘플의 입자 PBS 현탁액을 사용하여 다른 필터에서 입자를 수집하십시오.먼저, 필요한 반응 튜브의 수량을 결정합니다. 분석할 각 PM10 현탁액당 세 종류의 반응 튜브가 필요합니다. 네이티브 대조군 샘플용 튜브 하나, 음성 대조군 샘플용 튜브 하나, 그리고 특이 염색된 샘플용 튜브 하나가 필요합니다.다음으로, 필요한 PM10 현탁액의 부피를 계산합니다. 각 반응 튜브에는 50 µL의 현탁액이 필요합니다. 그런 다음, 적절한 양의 PBS를 첨가하여 시료에서 측정된 입자 농도를 최종 농도 8 × 10⁶ particles/mL로 조정합니다.다음으로, PBS로 조제한 1% BSA 스톡 용액을 희석하여 PM10 현탁액에 0.02% BSA를 첨가함으로써 비특이적 결합을 차단합니다. PM10 BSA 현탁액을 짧게 볼텍싱하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 유세포 분석으로 분석할 각 시료에 대해, 현탁액 50 µL를 깨끗한 반응 튜브로 옮깁니다.특이적 염색용으로 지정된 반응 튜브에 Bet v 1에 대한 마우스 단클론 항체를 최종 농도 0.02 µg/µL가 되도록 첨가하십시오. 짧게 볼텍싱한 후, 모든 반응 튜브를 상온에서 60분 동안 배양하십시오. 다음으로, 각 반응 튜브에 0.02% BSA가 함유된 PBS 500 µL를 첨가하고 샘플을 짧게 볼텍싱하여 모든 샘플을 세척하십시오.그 다음, 샘플을 원심 분리하여 펠렛을 형성하고 진공 펌프를 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 필요한 APC 표지 이차 항-마우스 IgG1 항체의 총량을 결정하고, 0.02% BSA가 첨가된 PBS의 해당 부피로 희석합니다. 네이티브 대조군을 제외한 모든 반응 튜브에 희석된 이차 항체 50 µL를 첨가합니다.천연 대조군(native control)에 0.02% BSA가 보충된 PBS 50 µL를 첨가합니다. 모든 샘플을 수 초 동안 볼텍싱하고 암소에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 앞서 설명한 방법대로 모든 샘플을 2회 세척합니다.마지막 세척 후, 각 반응 튜브에 50 µL의 plain PBS를 추가합니다. 그 다음, 샘플을 볼텍싱하고 유세포 분석기로 분석합니다. 네이티브 컨트롤을 사용하여 데이터 분석을 최적화하도록 분석기 파라미터를 조정합니다.먼저, 전방 산란(forward scatter) 임계값을 최저치인 200으로 설정하고 분석을 시작합니다. 다음으로, 산란 전압 컨트롤러를 사용하여 전방 산란을 조정하고, 이어서 측방 산란(sideward scatter)을 조정하여 모든 PM10 입자가 검출되도록 하며, 입자군이 전방 산란 축의 대략 중앙 및 측방 산란 축의 하단부에 위치하도록 합니다. 분석을 다시 시작하고 데이터를 기록합니다.그런 다음, 형광 전압 컨트롤러를 사용하여 2차 항체 형광 전압과 FITC와 같은 다른 형광 전압을 조정합니다. 이 과정이 완료되면 분석을 재시작하고 데이터를 기록합니다. 모든 입자가 두 형광 축의 하단 절반에 표시되는지 확인하십시오.각 샘플을 순차적으로 분석하고 샘플당 최소 10,000개 입자의 전방 산란광(forward scatter), 측방 산란광(sideward scatter), 2차 항체 형광 및 FITC 데이터를 저장하십시오. 흡수된 알레르겐 함량을 정량화하는 한 가지 방법은 모든 입자의 APC 형광 강도를 분석하는 것입니다. 이를 위해 FITC 중앙값과 APC 중앙값 버튼을 클릭하여 통계 수치를 편집하십시오.그런 다음, 각각의 값과 음성 대조군을 특이적으로 염색된 샘플의 값과 비교합니다. 흡수된 알레르겐 함량을 정량화하는 또 다른 방법은 anti-Bet v 1 항체가 결합된 PM10 입자의 백분율을 결정하는 것입니다. 이는 먼저 위양성으로 간주되는 입자 주변에 게이트를 설정함으로써 수행됩니다.다음으로, 특정 염색된 샘플을 클릭하고 동일한 게이트를 사용하여 해당 샘플 내의 APC 양성 입자들을 분리합니다. 꽃가루 농도가 높은 시즌에는 많은 수의 PM10 입자들이 Bet v 1 항원과 결합해 있습니다. Bet v 1의 인식은 특이적이며, 이는 일차 항체를 recombinant Bet v 1 항원으로 블로킹했을 때 신호가 유의미하게 감소하는 것을 통해 확인할 수 있습니다.꽃가루 고농도 시기에 수집된 PM10 입자를 저농도 시기의 입자와 비교했을 때, Bet v 1 양성 PM10 입자의 비율에서 유의미한 차이가 나타났습니다. 고농도 시기에 수집된 입자에서 Bet v 1 항원이 포함되어 있을 가능성이 훨씬 더 높았습니다. 숙달된 경우, 적절하게 수행한다면 샘플링된 PM10의 유세포 분석은 4~5시간 이내에 완료할 수 있습니다.유세포 분석법은 5 µL보다 큰 입자만 검출한다는 점에 유의하십시오. 이 절차를 따를 때, 본 방법은 PM10 입자의 Bet v 1 알레르겐 부하량을 결정하기 위해 고안되었으며, 이는 용해된 항원을 다루는 ELISA 방법과는 근본적으로 다르다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 대기 중의 Bet v 1 함량이 꽃가루 수와 다를 수 있으므로, 알레르기 증상은 알레르겐 수치와 상관관계가 있을 수 있습니다.임상 데이터와 결합하여, 이 방법은 자작나무 꽃가루에 대한 알레르기 반응이 PM10 내의 알레르겐 수준과 일치하는지 확인할 수 있게 해줍니다. 다른 적절한 항체를 이용하면, 이 방법을 LPS, 곰팡이 또는 집먼지진드기 알레르겐과 같은 대기 입자 상의 다른 항원 검출로 확장할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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여기서 우리는 인간 IgE 수용체에 감염된 쥐 배혈세포세포를 사용하여, 제1형 알레르기 반응에서 전형적으로 관찰되는 이펙터 세포의 분해를 시뮬레이션하기 위해 중재자 방출 분석체를 제시한다. 이 방법은 매우 민감하고 재현 가능하며 맞춤성 방식으로 알레르겐의 생물학적 활성을 조사합니다.

인간화된 중재자 릴리스 분석으로 알레르겐 효능에 대 한 읽기-아웃

우리는 대규모 무작위 대조 시험 동안 인도 현장 현장에서 공기 및 생물학적 샘플링 프로세스 전반에 걸쳐 사용되는 일관되고 고품질의 절차를 자세히 설명합니다. 농촌 지역의 노출 평가에 적합한 혁신적인 기술의 적용 감독에서 얻은 통찰력은 보다 신뢰할 수 있는 결과와 함께 더 나은 현장 데이터 수집 관행을 가능하게 합니다.

인도의 가정용 대기 오염 개입 네트워크 시험을 위한 노출 및 바이오마커 평가의 현장 데이터 수집 절차 시각화

이 논문은 개별 미립자 물질 노출 수준에서 내부 노출 선량을 평가하기 위해 기도 대식세포의 탄소 함량을 측정하기 위한 자세한 실험 프로토콜에 대해 설명합니다.

탄소 함유 미립자 물질에 노출된 기도 대식세포의 탄소 함량 측정

학습하세요 유세포 분석을 이용하여 PM10 입자에 결합된 Bet v 1 알레르겐을 정량화하는 방법을. 이 기술은 대기 중 알레르겐 부하를 시각화하고 측정하는 빠른 방법을 제공하여 호흡기 건강 연구에 활용됩니다.

PM10의 입자 바인딩 베팅 1 절 알레르기의 유세포 분석

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